糖痹康對STZ誘導的DPN大鼠坐骨神經(jīng)細胞凋亡Drp1信號通路的影響*

易文明 孫 文 郭翔宇 劉銅華▲

北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院內(nèi)分泌科(北京100078)

糖痹康對STZ誘導的DPN大鼠坐骨神經(jīng)細胞凋亡Drp1信號通路的影響*

易文明 孫 文△郭翔宇 劉銅華△▲

北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院內(nèi)分泌科(北京100078)

目的：探討糖痹康對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠細胞凋亡Drp1信號通路的作用機制。方法：使用60只高脂飼料喂養(yǎng)后小劑量鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射而誘發(fā)的2型糖尿病大鼠動物模型，8周造模成功后按體重隨機分為模型組、α-硫辛酸組、糖痹康低、中、高劑量組，另外單獨設(shè)10只大鼠為正常組，模型組和正常組予蒸餾水灌胃，糖痹康組和α-硫辛酸組分別予不同劑量糖痹康和α-硫辛酸灌胃，每4周測一次體重、空腹血糖，16周后取大鼠一側(cè)坐骨神經(jīng)，采用實時熒光定量PCR法檢測大鼠坐骨神經(jīng)Drp-1、 Bax和 Bcl-2 mRNA表達水平。結(jié)果: 與正常組比較，模型組和各治療組Drp-1的表達水平明顯升高，Bax表達顯著增加,Bcl-2表達顯著減少；糖痹康高劑量組Drp-1的表達水平比α-硫辛酸組更低，Bax表達也更減少，而Bcl-2表達則明顯增加。結(jié)論: 糖痹康可以抑制Drp1的表達水平，促進抗凋亡基因Bcl-2的表達而抑制促凋亡基因Bax表達，從而具有抗Drp-1信號通路的細胞凋亡作用，緩解DPN的進展。

糖尿病性周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病經(jīng)常出現(xiàn)的慢性并發(fā)癥之一，它很容易造成糖尿病足及截肢,有癥狀的發(fā)病率波動在50%～70%，甚至更高，由于診斷方法不統(tǒng)一，有的報道發(fā)病率可高達90%以上，基于DPN非常高的發(fā)病率和致殘率，DPN的預防和治療已經(jīng)成為學科內(nèi)研究的重點領(lǐng)域。目前西藥治療DPN尚缺乏有效手段，而中醫(yī)藥治療DPN積累了豐富經(jīng)驗，療效確切，但作用機制亟待闡明。中藥復方糖痹康是導師劉銅華教授的經(jīng)驗方，經(jīng)過了多年的臨床應用，療效較好，目前已獲發(fā)明專利(專利申請?zhí)枺?00810167551.1)。本實驗研究是在既往研究的基礎(chǔ)上，選用SPF級SD大鼠，通過高脂飼料喂養(yǎng)后，采用小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)腹腔注射誘發(fā)2型糖尿病，構(gòu)建DPN動物模型[1]。觀察Drp1介導的細胞凋亡信號通路與DPN的關(guān)系及糖痹康對其產(chǎn)生的影響，探討糖痹康治療DPN的作用機理，為臨床推廣應用提供理論依據(jù),為以改善神經(jīng)病變?yōu)槟康牡男滤幯邪l(fā)探索新靶點。

1 材 料

1.1 實驗動物 60只純系SPF級SD雄性大鼠，體重(180±20)g，7周齡，從北京維通利華動物實驗中心購買，生產(chǎn)許可證：(SCXR(京)2004—0006)，飼養(yǎng)條件：溫度(23±2)℃、濕度(55±10)%，12/12h 光照黑暗循環(huán)，常規(guī)攝食飲水，常規(guī)喂養(yǎng)1周后用于實驗。

1.2 材料及儀器 糖痹康(主藥為黃芪、桂枝、女貞子、黃連、黃芩等，由北京中醫(yī)藥大學中藥學院提供)；α-硫辛酸購于Puritan's Pride公司(100mg×60粒，批號：250597-09 EXP 10/17)；高脂飼料，從北京華阜康生物科技有限公司購買；羅氏活力型血糖儀，ACCU-CHEK；Trizol 試劑(美國 Invitrogen 公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大 MBI Fermentas 公司)；定量 PCR 試劑盒(中國 TIANGEN 公司；)Real-Time PCR 儀(美國應用生物儀器公司)；Drp1、Bax、Bcl-2 多克隆抗體(兔)(美國 Santa Cruz 公司)； Unico7200分光光度計。生物電放大器(AVB-10);VC-10(日本光電)記憶示波器，PowerLab 多功能生理信號采樣分析系統(tǒng)，SEN-3201 電刺激器(日本光電)。

2 實驗方法

2.1 模型建立及分組 大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周后，按體重隨機選擇10只為正常組，采用普通飼料飼養(yǎng)，其它組大鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)，8周后，禁食12h后準備造模，造模用藥物鏈脲霉素用0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液(pH4.4)配成1%的濃度，劑量以35mg/kg進行腹腔注射，72h后檢測大鼠血糖值(尾部血管取血)，血糖≥16.7mmol/L以上者視為造模成功，按大鼠體重隨機分為模型組、α-硫辛酸組、糖痹康低、中、高劑量組，每組10只。

2.2 給藥方法 模型復制成功3d后開始灌胃：糖痹康低劑量組(4.28g/kg)，糖痹康中劑量組(8.56g/kg)，糖痹康高劑量組(17.12g/kg)，α-硫辛酸組：按 20mg/(kg·d)灌胃α-硫辛酸。實驗期間各組大鼠均自由取食、飲水，每天一次，連續(xù)給藥16周。

2.3 指標檢測及方法

2.3.1 體重、血糖檢測：灌胃前和灌胃后的第 4、8、12、16周末，禁食6h，稱大鼠體重及檢測血糖。

2.3.2 神經(jīng)電生理：檢測大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)運動神經(jīng)傳導速度(MNCV)。常規(guī)皮膚消毒，用戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射,大鼠麻醉后，以俯臥位固定好，保持室溫在(20±0.5)℃。運動神經(jīng)：開始將刺激針電極放置在跺關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)面，其次放置在坐骨切跡處，波寬為0.1ms，強度為超強刺激，用針電極記錄，保持每2個刺激之間的間隔時間在5s以上。用計算機軟件記錄波幅、潛伏期。反復測定7～10次，算出平均值。掃描速度保持在2ms/cm，記錄頻率3～10000Hz，放大倍數(shù)2mv/cm。使大鼠后肢以自然狀態(tài)與后背脊柱成45°夾角，然后向斜后方拉直，順著坐骨神經(jīng)方向，測出大鼠體表兩個刺激點之間的長度，從而計算出MNCV。

2.3.3 實時熒光定量PCR檢測坐骨神經(jīng)Drp-1,Bax和 Bcl-2 mRNA表達:第16周末，用10%水合氯醛以0.4mg/100g劑量腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后，腹主動脈取血放入5mL采血管，4℃靜置2h自然凝固，3000r/min離心15min，取上清，-20℃凍存?zhèn)溆谩⒋笫蠊潭ㄓ谑蟀迳?，先切開雙側(cè)后腿中外l/3處皮膚，接著鈍性分離出肌肉組織，將坐骨神經(jīng)充分暴露，旁邊肌肉去除，取出盡可能長的坐骨神經(jīng)，用0.9%的生理鹽水沖洗干凈，天秤稱其重量后放入凍存管內(nèi)，于冰壺內(nèi)冷凍，最后放入-80℃冰箱保存待。用Trizol法提取坐骨神經(jīng)組織總RNA,紫外分光光度計測定其OD值,通過A260比A280確定RNA純度。電泳法觀察RNA濃度和完整性,RNasin去除基因組DNA。RNA 的反轉(zhuǎn)錄：各樣本取2μL的RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應體系：RNA(2 μg)Primer(oligo-dT)1μL,RNasin抑制劑0.5 μL,5×RT Buffer4μL、dNTP Mix(10 mM each)1μL、RNasein 0.5μL、MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(100 U/μL)1μL,補DEPC 水至終體積20μL。cDNA的熒光定量PCR 擴增：熒光定量Master MIX(含SYBR 熒光染料)27μL,25pmol引物1 μL(實驗中所用引物見表1),總體積30μL。擴增條件：95℃預變性3min,然后95℃ 20s,60℃ 20s,72℃ 30s擴增50 個循環(huán),最后72 ℃延伸5min,55℃～95℃繪制溶解曲線。采用熒光定量PCR 專用分析軟件對結(jié)果進行分析。

表1 引物序列

3 結(jié) 果

3.1 一般情況 造模72h后，大鼠表現(xiàn)出多食多尿，體重下降，精神萎靡，體毛色澤干枯，活動變得遲緩，在14周后還出現(xiàn)了身體潰瘍等情況，而在α-硫辛酸組和中藥糖痹康高劑量組以上情況出現(xiàn)的較少。

3.2 體重稱量 見表2，和正常組相比，從8周開始，模型組大鼠的體重較前輕度下降(P<0.05)；在16周后，模型組大鼠體重明顯下降。和模型組比較，16周后，糖痹康低、中劑量及α-硫辛酸組體重明顯增加。

3.3 血糖檢測 見表3，和正常組比較，模型組大鼠血糖明顯升高；和模型組比較，干預以后各組大鼠血糖較前都有所改善，其中α-硫辛酸組和糖痹康低劑量組在16周后的有明顯差異，而糖痹康中、高劑量組在4、8、12、16周都有明顯下降。

表2 各組大鼠體重的比較

注：與正常組比較，△P<0.05，▲P<0.01；與模型組比較,□P<0.01

表3 各組大鼠血糖的比較

注：與正常組比較，△P<0.05，▲P<0.01；與模型組比較,□P<0.01

3.4 MNCV測定 見表4，和正常組比較，模型組大鼠坐骨神經(jīng)傳導速度顯著減慢；和模型組比較，糖痹康高劑量組及α-硫辛酸組都能提高糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)傳導速度(P<0.05)，組間比較，糖痹康高劑量組的效果優(yōu)于α-硫辛酸組(P<0.05)，糖痹康各劑量組間相對比，高劑量組改善效果更佳顯著(P<0.05)，提示糖痹康能夠提高糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)傳導速度。

表4 各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導速度比較

注：與正常組比較，△P<0.05，▲P<0.01；與模型組比較,□P<0.01

3.5 坐骨神經(jīng)Drp-1,Bax和 Bcl-2 mRNA表達測定 見表5。基于文獻計算方法，以2-△△Ct值為參照量進行統(tǒng)計，和正常組比較，模型組和各治療組Drp-1的表達水平均明顯升高(P<0.05)；和模型組比較，各治療組Drp-1的表達水平明顯下降(P<0.05)；和α-硫辛酸組比較，糖痹康高劑量組Drp-1的表達水平更低(P<0.05))；和正常組比較，模型組和各治療組Bax表達水平明顯增加(P<0.05),Bcl-2表達水平明顯減少(P<0.05)；與α-硫辛酸組相比，糖痹康高劑量組Bax表達水平明顯減少(P<0.05)，Bcl-2表達明顯增加(P<0.05)，這證明糖痹康高劑量能抑制坐骨神經(jīng)細胞凋亡，效果優(yōu)于α-硫辛酸組。

表5 各組大鼠坐骨神經(jīng)組織Drp-1、Bax、Bcl-2

mRNA水平測定

注：與正常組相比，△P<0.05;與西藥組相比,▲P<0.05

4 討 論

DPN的發(fā)病機制目前還不是十分清楚，不能用單一因素來解釋，而應該是多種因素相互作用的結(jié)果。其可能發(fā)病機制主要包括代謝原因和血管原因，還有多元醇途徑、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)途徑、蛋白激酶C(PKC)途徑、氨基已糖途徑、生長因子缺乏、氧化應、神經(jīng)營養(yǎng)因子、免疫因素等等。

有研究證實動力相關(guān)蛋白-1(dynamin-related protein 1，Drp1)與神經(jīng)性病密切相關(guān)，對糖尿病周圍神經(jīng)功能損傷起著核心作用，Drp1大多出現(xiàn)在細胞漿，表現(xiàn)為多聚體的形式[2]。Drp-1介導的線粒體裂解是細胞內(nèi)線粒體內(nèi)生物合成的關(guān)鍵步驟，有研究發(fā)現(xiàn)過度表達的Drp-1蛋白會推進線粒體的自身裂解，從而產(chǎn)生很多碎片，而減少Drp-1表達，減少線粒體的裂解，這表明Drp-1可能是線粒體裂解的必需分子[3]。另外，如果神經(jīng)細胞胞漿中Drp-1過度表達，會轉(zhuǎn)移到線粒體，并立即激活Caspase系統(tǒng)，導致線粒體內(nèi)重要蛋白及細胞器受損，最終導致線粒體裂解，引起細胞凋亡[4]。Bcl2 是一種從小鼠 B 淋巴細胞瘤中分離出來的原癌基因，是抑制細胞凋亡的主要基因,Bax與 Bcl2來源相同，它起到幫助定位的作用，它能夠招集大量的Drp1 移動到線粒體表面，大大增強了分裂活性，它是促進細胞凋亡的主要基因，二者相互拮抗，在細胞凋亡中發(fā)揮各自重要作用，Drp-1可能通過影響B(tài)ax和Bcl2導致細胞凋亡，引起DPN發(fā)病[5]。

本動物實驗的目的在于觀察Drp-1與DPN的關(guān)系以及糖痹康對其產(chǎn)生的影響，結(jié)果提示:糖尿病性周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)中Drp-1含量是升高的，這會引起線粒體裂解增加，從而相應地導致Bax蛋白表達增加，Bcl-2蛋白表達減少，促進細胞凋亡。因此，增高的Drp-1水平可能是引起糖尿病性周圍神經(jīng)病變發(fā)病的一個重要原因。而中藥復方糖痹康可以抑制Drp-1的表達水平，促進抗凋亡基因Bcl-2的表達而抑制促凋亡基因Bax表達，因此我們認為，糖痹康具有的抗Drp-1信號通路細胞凋亡作用可能是其對糖尿病周圍神經(jīng)病變的神經(jīng)保護作用機制之一。

[1] 吳 晏,韓 靜,黃黎明,等.高脂喂養(yǎng)合并小劑量鏈脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型[J].中國實驗動物學報,2012,20(2):11-15.

[2] Ferrari L F,Chum A,Bogen O,et al.Role of Drp1,a Key Mitochondrial Fission Protein,in Neuropathic Pain[J].Journal of Neuroscience,2011,31(31): 11404-11410.

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(收稿2015-01-22；修回2015-03-11)

*北京中醫(yī)藥大學自主選題項目(2013-JYBZZ-JS-159)

北京中醫(yī)藥大學創(chuàng)新團隊項目(2011-CXTD-19)

教育部中醫(yī)養(yǎng)生學重點實驗室項目

北京市中醫(yī)養(yǎng)生學重點實驗室項目

△北京中醫(yī)藥大學(北京 100029)

▲通訊作者

糖尿病并發(fā)癥 糖痹康 Drp1 Bax Bcl-2 細胞凋亡

R587.1

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.06.057