復(fù)方血栓通膠囊對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變的影響*

郝改梅 韓 靜 徐 濤 何 潔 吳 晏 武志黔 袁悅瑩 呂甜甜 王宏亮 王 偉 畢力夫

北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(北京 100029)

·實(shí)驗(yàn)研究·

復(fù)方血栓通膠囊對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變的影響*

郝改梅 韓 靜△徐 濤▲何 潔 吳 晏△武志黔 袁悅瑩△呂甜甜 王宏亮 王 偉 畢力夫■

北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(北京 100029)

目的：觀察復(fù)方血栓通膠囊對(duì)糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變的療效并探討其作用機(jī)制。方法：選取SD 大鼠32只，禁食12 h，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素( 65 mg/kg) 誘導(dǎo)糖尿病模型，造模后將大鼠隨機(jī)分為模型組和復(fù)方血栓通膠囊組。另選取11只大鼠做為正常對(duì)照組。每組每天干預(yù)1次，12周后檢測大鼠的熱痛潛伏期、神經(jīng)血流量、微循環(huán)血流灌注量及神經(jīng)傳導(dǎo)速度，并觀察坐骨神經(jīng)病理變化。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠熱痛潛伏期延長，神經(jīng)血流量減少，神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢；髓鞘松解；耳部及上肢末端微循環(huán)血流灌注量明顯減少；下肢末端血流灌注量減少。與模型組比較，復(fù)方血栓通膠囊組大鼠熱痛潛伏期縮短，神經(jīng)血流量增大，神經(jīng)傳導(dǎo)速度增快，神經(jīng)束膜整齊，耳部及上肢末端微循環(huán)血流灌注量明顯增加，下肢末端血流灌注量增加。結(jié)論：復(fù)方血栓通可能是通過增加周圍神經(jīng)組織的微循環(huán)灌注量，對(duì)糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變進(jìn)行改善。

糖尿病周圍神經(jīng)病變( diabetic peripheral neuropathy,DPN)是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致足部潰瘍和截肢的重要原因之一，其發(fā)病率高，受累神經(jīng)廣泛。目前已經(jīng)證明坐骨神經(jīng)血管舒縮功能紊亂，血管通透性增加，血流灌注減少是糖尿病周圍神經(jīng)病變的重要因素之一[1]。本研究通過觀察復(fù)方血栓通膠囊對(duì)糖尿病大鼠熱痛潛伏期、神經(jīng)血流速度、微循環(huán)血流灌注量及坐骨神經(jīng)病理變化的影響，探討其對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變的防治作用及可能機(jī)制。

1 材 料

1.1 動(dòng) 物 SPF級(jí)雄性SD大鼠32只，體重160～190 g。購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào) SCXK(京) 2012-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF實(shí)驗(yàn)室，室內(nèi)溫度為20 ℃～25℃，相對(duì)濕度為45 %～70 %，換氣次數(shù)為10～15 次/h，12h光照維持，晝夜循環(huán)。動(dòng)物自由攝食飲水，顆粒飼料喂養(yǎng)。

1.2 藥品與試劑 復(fù)方血栓通膠囊(國藥準(zhǔn)字Z20030017)，制成 0.105 g/mL水溶液。鏈脲佐菌素( streptozotocin,STZ)，Sigma S0130。Optium 試紙(雅培糖尿病護(hù)理有限公司)。

1.3 儀 器 Optium Xceed“安妥超越”血糖儀；RB-200 智能熱板儀；BH-2顯微照相系統(tǒng)；激光多普勒血流儀 PeriFlux 5000；激光散斑血流監(jiān)測視頻系統(tǒng)(型號(hào):PeriCam PSI systerm)；多通道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(型號(hào)：RM-6240BD)。

2 方 法

2.1 動(dòng)物模型的建立、分組與給藥 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，禁食12h，STZ溶解于0.1mmol/L檸檬酸鈉溶液(低溫現(xiàn)配，pH4.5)，隨機(jī)選取大鼠21只，以65mg/kg的劑量予STZ一次性腹腔注射，誘導(dǎo)糖尿病模型。另選取11只作為正常對(duì)照組，腹腔注射等劑量的溶劑(0.1mmol/L檸檬酸鈉溶液，pH4.5)。一周后尾靜脈采血檢測血糖，以禁食6h血糖≥16.7mmol/L為成模標(biāo)準(zhǔn)。STZ造模20周后，將糖尿病模型大鼠按照體重和血糖隨機(jī)分為模型組和復(fù)方血栓通膠囊組，開始藥物干預(yù)。復(fù)方血栓通膠囊組每天給藥一次，劑量1.05g /kg(相當(dāng)于臨床用藥量的14倍灌胃)，正常組和模型組用與中藥組等容的蒸餾水灌胃，持續(xù)12周。

2.2 檢測指標(biāo)及方法

2.2.1 熱痛潛伏期：將大鼠放入溫度設(shè)定為55℃的熱板儀中，記錄從大鼠雙后足接觸到熱板開始，到因其足部受到熱刺激出現(xiàn)第一次舔后足反應(yīng)的時(shí)間，即熱痛潛伏期，以此作為疼痛反應(yīng)指標(biāo)。

2.2.2 神經(jīng)血流量：將大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉 50 mg/kg麻醉，俯臥位固定，剪除一側(cè)臀部和下肢的皮毛，暴露大鼠臀部的坐骨神經(jīng)，使用PeriFlux 5000型彩色超聲多普勒顯像儀，用探針型探頭尖端輕輕接觸神經(jīng)，測定神經(jīng)血流量。

2.2.3 神經(jīng)傳導(dǎo)速度：大鼠麻醉后，刺激電極插入大鼠的坐骨切跡處，記錄電極分別插入大鼠第1、2腳趾間和第2、3腳趾間皮膚下。設(shè)置刺激參數(shù)為：采集頻率4k，濾波頻率10k，正電壓刺激，刺激波寬1 ms，波幅10 v，掃描速度1 s/div。記錄大鼠的神經(jīng)傳導(dǎo)的時(shí)間，并測量刺激電極與記錄電極之間的距離，用距離除以傳導(dǎo)時(shí)間，計(jì)算出神經(jīng)傳導(dǎo)速度。每只大鼠測量3次求出平均值。

2.2.4 微循環(huán)血流灌注量：使用PeriCam PSI激光散斑血流監(jiān)測視頻系統(tǒng)，進(jìn)行耳部、上下肢末端體表血流圖的記錄、分析、處理。激光多普勒血流成像儀(LDPI)其輸出結(jié)果以單位時(shí)間內(nèi)流量單位PU(灌注量)值表示，PU值越大表示微循環(huán)缺血程度越低。

2.2.5 病理切片：取大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)，長度約1 cm，多聚甲醛充分固定后，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析比較，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 熱痛潛伏期 與正常組比較，模型組熱痛潛伏期延長(P<0.001)；與模型組比較，復(fù)方血栓通膠囊組熱痛潛伏期縮短(P<0.05) ，見表 1。

3.2 神經(jīng)血流量 與正常組比較，模型組神經(jīng)血流量明顯減少(P<0.001)；與模型組比較，復(fù)方血栓通膠囊組神經(jīng)血流量增加(P<0.05) ，見表 1。

3.3 神經(jīng)傳導(dǎo)速度 與正常組比較，模型組大鼠的神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯減慢(P<0.01) 。與模型組比較，復(fù)方血栓通膠囊組大鼠神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯增快(P<0.01 ) ，見表 1。

表1 大鼠間熱痛潛伏期、神經(jīng)血流量及神經(jīng)傳導(dǎo)速度的比較

注：與正常組比較，△P<0.001,▲P<0.01；與模型組比較，□P<0.01，■P<0.05

3.4 微循環(huán)血流灌注量 與正常組比較，模型組大鼠耳部及上肢末端微循環(huán)血流灌注量明顯減少(P<0.05)，下肢末端血流灌注量減少(P>0.05)；與模型組比較，復(fù)方血栓通膠囊組耳部及上肢末端微循環(huán)血流灌注量明顯增加(P<0.01或P<0.05)，下肢末端血流灌注量增加(P>0.05)，見表2。

表2 大鼠微循環(huán)血流灌注量比較

注：與正常對(duì)照組比較，△P<0.05；與模型組比較，▲P<0.01，□P<0.05

3.5 坐骨神經(jīng)病理情況 正常組神經(jīng)束膜較為整齊，厚度均勻一致，無明顯增厚，神經(jīng)纖維排列較為整齊，有髓神經(jīng)纖維的數(shù)目未見減少。模型組神經(jīng)束膜可見明顯增厚，厚度不均一；神經(jīng)纖維排列紊亂，軸索可見節(jié)段性增粗，髓鞘松解，有髓神經(jīng)纖維的數(shù)目減少。復(fù)方血栓通膠囊組神經(jīng)束膜整齊，厚度一致，神經(jīng)纖維排列比較整齊，有髓纖維數(shù)目略減少，見圖 1 。

4 討 論

DPN嚴(yán)重危害糖尿病患者的身體健康和生活質(zhì)量，而目前臨床尚無十分有效的治療方法,DPN的發(fā)病機(jī)制有很多，其中微循環(huán)障礙是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[2]。周圍神經(jīng)的血液供應(yīng)多來自于鄰近血管,神經(jīng)組織自身調(diào)節(jié)血液供應(yīng)的能力非常有限，一旦微血管發(fā)生病變，將會(huì)引起缺氧惡性循環(huán)，導(dǎo)致神經(jīng)病理改變[3]。病理研究顯示，糖尿病導(dǎo)致微血管壁基底膜增厚，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，血管管腔狹窄，血流阻力增大，從而導(dǎo)致神經(jīng)灌注量減少和神經(jīng)內(nèi)膜缺氧，進(jìn)而出現(xiàn)神經(jīng)的變性壞死。因此，在研究周圍神經(jīng)病變時(shí)有必要對(duì)神經(jīng)血液供應(yīng)進(jìn)行深入研究。

中醫(yī)文獻(xiàn)對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變沒有確切的記載和病名，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可將其歸屬于“消渴”合并“痹證”、“痿證”、 “血痹”、“脈痹”等范疇，2010年國家中醫(yī)管理局首次把糖尿病周圍神經(jīng)病變定名為“消渴病痹癥”[4]。此DPN的治療主要從瘀論治，以活血通脈為大法，結(jié)合益氣、養(yǎng)血、滋陰以扶正，使血脈暢通，麻痛消減。

復(fù)方血栓通膠囊由三七、黃芪、丹參、玄參四味藥物組成。三七通脈行瘀，黃芪益氣補(bǔ)虛，丹參涼血活血，祛瘀止痛，玄參養(yǎng)陰生津，全方具奏活血化瘀、益氣養(yǎng)陰之效。目前研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方血栓通膠囊有擴(kuò)張血管，降低血液黏度，清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，提高抗缺氧能力，抗血栓形成，促進(jìn)血栓溶解，改善微循環(huán)等作用[5]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠熱痛潛伏期延長，同時(shí)神經(jīng)血流量減少，神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢，四肢末端及耳部血流灌注量減少，坐骨神經(jīng)病理觀察可見神經(jīng)纖維紊亂、髓鞘松解等，表明糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)病變已形成。與模型組比較，復(fù)方血栓通膠囊組大鼠熱板反應(yīng)潛伏期縮短，神經(jīng)血流量增加，神經(jīng)傳導(dǎo)速度增快，四肢末端及耳部血流灌注量明顯增加；病理觀察可見神經(jīng)束膜整齊，厚度一致，神經(jīng)纖維大部分排列整齊，結(jié)果提示復(fù)方血栓通膠囊對(duì)DPN有明顯的改善作用。本實(shí)驗(yàn)中模型組下肢末端血流灌注量略低于正常組和血栓通組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮與糖尿病模型組大鼠部分后足底部皮膚因感染出現(xiàn)充血水腫，導(dǎo)致局部血流灌注量增高有關(guān)，這是今后實(shí)驗(yàn)應(yīng)注意避免的干擾因素。

綜上所述，復(fù)方血栓通膠囊對(duì)DPN有較好的療效，其機(jī)制可能是通過促進(jìn)機(jī)體血液循環(huán)、增加周圍神經(jīng)組織的微循環(huán)灌注量，改善其缺血、缺氧狀態(tài)，促進(jìn)受損神經(jīng)組織的營養(yǎng)代謝及其功能的恢復(fù)，從而起到保護(hù)坐骨神經(jīng)、延緩糖尿病周圍神經(jīng)病變的作用。

[1] 趙紅燕.肢體缺血預(yù)適應(yīng)在糖尿病周圍神經(jīng)病變治療中的應(yīng)用效果觀察[D].天津：天津醫(yī)科大學(xué),2013.

[2] 張世有,張 雯.糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)病機(jī)制及治療進(jìn)展[J].中國老年保健醫(yī)學(xué),2014,12(3): 67-69.

[3] 呂翠巖.糖痹康干預(yù)糖尿病周圍神經(jīng)病變臨床及作用機(jī)制研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué),2014.

[4] 沈 璐,胡筱娟,李 婷,等.糖尿病周圍神經(jīng)病變與血瘀證的相關(guān)性探討[J].陜西中醫(yī),2013,34(5): 577.

[5] 劉 鵬,李小娟.李小娟.調(diào)營衛(wèi)化痰瘀論治糖尿病周圍神經(jīng)病變經(jīng)驗(yàn)擷菁[J].陜西中醫(yī),2014,35(1): 70-71.

(收稿2015-01-18；修回2015-03-06)

The effect of compound Xueshuantong capsule on diabetic peripheral neuropathy

Basic Medical College of Beijing University of Chinese Medicine (Beijing 100029)

Hao Gaimei Han Jing Xu Tao et al

Objective:To observe the effect of compound Xueshuantong(XST) capsule on diabetic peripheral neuropathy(DPN) in rats and to explore its mechanism of action.Methods:32 SD rats were selected and fasted for 12h.Streptozotocin(STZ,65mg/kg) was intraperitoneally injected to rats to induce diabetes.The diabetic rats were randomly divided into the model group and the XST group.Other 11 rats were recruited as the normal control group.The intervention was carried out once daily and continued for 12 weeks.The threshold of hot pain test,nerve blood flow,microcirculatory perfusion,nerve conduction velocity and pathological changes were observed.Results: Compared with the normal group,the latency of hot pain was delayed,the nerve blood flow was reduced and the conduction velocity was decreased in the model group.Myelin sheaths was loose.The microcirculatory perfusion of ear and upper end was decreased; while the perfusion of lower extremities reduced.Compared with the model group,the latency of hot pain was shortened,the nerve blood flow was reduced and the conduction velocity was increased in XST group.The perineurium was in order.The microcirculatory perfusion of ear and upper end was increase,while the perfusion of lower extremities induced.Conclusion: XST can improve the DPN in rats by increasing the microcirculatory perfusion of peripheral nerve tissue.

Diabetic peripheral neuropathy/traditional Chinese medicine therapy Animal experimentationt Rat @Xueshuantong capsule

*國家科技部“十二五”支撐計(jì)劃項(xiàng)目( 2012BAI29B07)

北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生自主課題項(xiàng)目( 2014-JYBZZ-XS-004)

△北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心(北京100029)

▲北京王府中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(北京102209)

■通訊作者：內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院(呼和浩特 010059)

糖尿病神經(jīng)病變/中醫(yī)藥療法 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 大鼠 @復(fù)方血栓通膠囊

R587.1

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.06.055