Tempol預(yù)處理對七氟醚麻醉下老齡大鼠術(shù)后認(rèn)知功能的影響

西安市紅會醫(yī)院麻醉科(西安710054)

蘇 晗 張 潔

Tempol預(yù)處理對七氟醚麻醉下老齡大鼠術(shù)后認(rèn)知功能的影響

西安市紅會醫(yī)院麻醉科(西安710054)

蘇 晗 張 潔

目的：探討Tempol對七氟醚麻醉下老齡大鼠術(shù)后認(rèn)知功能的影響。方法：老齡雄性SD大鼠32只，體重500～600g，20月齡，采用隨機(jī)數(shù)字表法,分為4組(n=8)：正常對照組(C組)，Tempol預(yù)處理組(T組)，七氟醚組(S組)和七氟醚+Tempol組(ST組)。T組和ST組連續(xù)3d腹腔注射Tempol 100mg/kg,C組和S組相應(yīng)給予腹腔注射等容量0.9%生理鹽水,S組和ST組大鼠分別給予連續(xù)3d,每天1次,1次4h的七氟醚麻醉,C組和T組僅置于麻醉箱內(nèi)對照,不進(jìn)行七氟醚麻醉，采用Morris水迷宮對各組大鼠進(jìn)行認(rèn)知功能測定。完成水迷宮行為學(xué)測試后,隨機(jī)處死4只大鼠采用高爾基染色方進(jìn)行海馬樹突棘密度測定，剩余4只大鼠處死后采用 ELISA法測定海馬內(nèi)丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量。結(jié)果：與C組相比，S組和ST組大鼠游泳路程和逃避潛伏期延長,穿越平臺次數(shù)和平臺所在象限停留時間縮短(P< 0.05)；與S組相比，ST組大鼠游泳路程和逃避潛伏期縮短,穿越平臺次數(shù)和平臺所在象限停留時間增加(P<0.05)。與C組相比，S組海馬內(nèi)MDA含量升高,SOD含量和樹突棘密度下降(P< 0.05)。與S組相比，ST組海馬內(nèi)MDA含量下降，SOD含量和樹突棘密度升高(P<0.05)。C組和T組大鼠海內(nèi)馬MDA和SOD含量及神經(jīng)元樹突棘密度變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論：Tempol預(yù)處理可緩解七氟醚麻醉所引起的老齡大鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能與Tempol抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及增加其海馬內(nèi)樹突棘密度有關(guān)。

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(Postoperative cognitive dysfunction,POCD)是指術(shù)前無認(rèn)知功能障礙的病人，在麻醉及手術(shù)后出現(xiàn)焦慮、記憶受損、語言理解能力和社會融合能力減退為主的并發(fā)癥,其中老年患者為易發(fā)人群[1]。有研究證實(shí)七氟醚可引起老年人術(shù)后認(rèn)知功能障礙,促進(jìn)淀粉樣蛋白β的寡聚化和纖維體形成，從而抑制認(rèn)知功能[2-3],其機(jī)制在于七氟醚可激活內(nèi)皮細(xì)胞鈣依賴蛋白酶產(chǎn)生大量氧自由基,從而誘發(fā)海馬神經(jīng)元脂質(zhì)過氧化損傷[4]。Tempol(1-氧-4-羥基-2,2,6,6-四甲基哌啶)作為新型自由基清除劑,具有分子量小,穩(wěn)定性強(qiáng)及細(xì)胞膜通透性好等優(yōu)點(diǎn),可清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，抑制神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷[5]。有研究表明Tempol預(yù)處理來改變腦組織的氧化環(huán)境，對缺血缺氧損傷的腦組織神經(jīng)功能的恢復(fù)具有保護(hù)作用[6]。本研究旨在探討Tempol對七氟醚麻醉下老齡大鼠術(shù)后認(rèn)知功能的影響，為研究POCD的防治提供可能的理論依據(jù)。

材料與方法

1 動物選擇及分組 健康清潔級老齡雄性SD大鼠32只,體重500～600g,20月齡,采用隨機(jī)數(shù)字表法,將其分為4組(n=8)：正常對照組(C組),Tempol預(yù)處理組(T組),七氟醚組(S組)和七氟醚+Tempol組(ST組)。

2 Tempol預(yù)處理及七氟醚麻醉 T組和ST組連續(xù)3d腹腔注射Tempol(Sigma公司,美國) 100mg/kg,C組和S組相應(yīng)給予腹腔注射等容量0.9%生理鹽水(Baxter制藥公司)；腹腔注射后將S組和ST組大鼠置于自制麻醉箱(50cm×30cm×30cm)進(jìn)行七氟醚麻醉，箱底鋪鈉石灰，麻醉箱放于37℃恒溫水浴箱內(nèi)。麻醉箱有兩個通氣孔,上孔連接麻醉機(jī),用于通入七氟醚(雅培公司，美國)，氧流量2L/min,氧濃度50%，下孔位于對側(cè)，連接Ohmeda麻醉氣體監(jiān)測儀(Datex- Ohmeda公司，芬蘭)監(jiān)測MAC值維持在2.0MAC。S組和ST組大鼠分別給予連續(xù)3d，每天1次，1次4h的七氟醚麻醉,C組和T組僅置于麻醉箱內(nèi)對照,不進(jìn)行七氟醚麻醉。常規(guī)監(jiān)測心率、血壓和脈搏血氧飽和度。發(fā)生脈搏血氧飽和度低于95%或平均動脈壓下降幅度超過基礎(chǔ)值的20%者從研究中剔除。

3 大鼠認(rèn)知功能的測定 參考文獻(xiàn)[7]的方法在完成七氟醚麻醉后1d開始對各組大鼠進(jìn)行認(rèn)知功能測定。采用ZH0065型Morris水迷宮系統(tǒng)測定認(rèn)知功能，持續(xù)5d，前4d進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，第5天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)均于上午9點(diǎn)開始，維持水溫23℃。將各組大鼠從一個固定入水點(diǎn)面向池壁置入水中，記錄120s內(nèi)尋找平臺的時間為逃避潛伏期，讓其在平臺上停留30s。若120s內(nèi)未能找到將其引上平臺停留30s。于第5天撤去隱匿于水中的平臺，將子代大鼠從固定點(diǎn)放入水中，記錄120s內(nèi)大鼠游過前期放置平臺所在象限的次數(shù)(穿越平臺次數(shù))及其在平臺所在象限的停留時間(平臺所在象限停留時間)。整個測試過程中，保證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)燈光和物品擺放等室內(nèi)環(huán)境一致，以排除環(huán)境干擾。

4 大鼠海馬內(nèi)MDA和SOD含量的測定 各組大鼠完成水迷宮行為學(xué)測試后，隨機(jī)取4只進(jìn)行迅速斷頭處死后于冰臺上分離海馬，參考文獻(xiàn)[8]采用 ELISA方法測定海馬內(nèi)MDA和SOD的含量，按25ml·g-1加入相當(dāng)體積的冰生理鹽水，勻漿器研磨組織，冰浴下超聲波粉碎制成勻漿，4℃離心后取上清液。按ELISA測定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)說明書步驟進(jìn)行操作對海馬內(nèi)MDA和SOD的含量進(jìn)行測定。采用NK3酶標(biāo)儀 (Ladsystems公司，芬蘭)，測定吸光度OD值的波長為490nm，96孔培養(yǎng)板，對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出MDA和SOD的含量。

5 大鼠海馬樹突棘密度的測定 各組剩余4只大鼠海馬樹突棘密度測定。采用腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛350mg/kg麻醉后，進(jìn)行快速灌注Golgi染色。0.5%亞硝酸鈉液快速灌注后用4%多聚甲醛固定1h。隨后媒體液(5%水合氯醛+5%重鉻酸鉀+10%甲醛混合液)慢速灌注，至流出濃厚橘紅色液。開顱取出大腦半球，從前中1/3處向后取組織塊，修塊后將其浸泡于媒染液中，置于37℃溫箱內(nèi)24h,用1%硝酸銀染色浸泡鍍銀后，置于37℃溫箱內(nèi)3d,更換鍍銀液1次/d。冰凍切片機(jī)連續(xù)切片，厚度100μm，切片經(jīng)2%重鉻酸鉀溶液及蒸餾水漂洗，依次脫水、透明、封片。在光鏡下進(jìn)行采圖。在每只大鼠的背側(cè)海馬水平CAl進(jìn)行樹突棘密度分析，隨機(jī)選擇10個的椎體細(xì)胞，觀察其第二級頂樹突，以每10μm為計(jì)數(shù)單位，每個細(xì)胞觀察3支分支。于LEICA顯微鏡×1000油鏡下進(jìn)行采圖計(jì)數(shù)，最終數(shù)據(jù)以每10μm長度的樹突棘個數(shù)為表現(xiàn)。

結(jié) 果

1 大鼠生理指標(biāo)變化 各組大鼠在麻醉處理過程中血氧飽和度均>95%，心率及平均動脈壓與其基礎(chǔ)值比較無差異，呼吸均勻，膚色紅潤，血糖均維持在正常范圍內(nèi)。

2 大鼠水迷宮行為學(xué)指標(biāo)變化 見表1。與C組相比，S組和ST組大鼠游泳路程和逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)和平臺所在象限停留時間縮短(P< 0.05)。與S組相比，ST組大鼠游泳路程和逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)和平臺所在象限停留時間增加(P<0.05)。C組和T組大鼠水迷宮行為學(xué)指標(biāo)變化指標(biāo)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠水迷宮行為學(xué)指標(biāo)變化的比較

注：與C組比較，aP<0.05；與S組比較，bP<0.05

3 大鼠海內(nèi)馬MDA和SOD含量及神經(jīng)元樹突棘密度變化 見表2。與C組相比，S組海馬內(nèi)MDA含量升高，SOD含量和樹突棘密度下降(P< 0.05)。與S組相比，ST組海馬內(nèi)MDA含量下降，SOD含量和樹突棘密度升高(P<0.05)。C組和T組大鼠海內(nèi)馬MDA和SOD含量及神經(jīng)元樹突棘密度變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表2 大鼠海內(nèi)馬MDA和SOD含量及神經(jīng)元樹突棘密度變化的比較

注：與C組比較，aP<0.05；與S組比較，bP<0.05

討 論

本研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪沁x用易在麻醉后出現(xiàn)POCD老年大鼠作為對象，并在濃度較高的七氟醚進(jìn)行長時間多次麻醉后，檢測水迷宮行為學(xué)證實(shí)出現(xiàn)了POCD,從而探討Tempol的保護(hù)作用及機(jī)制。各組大鼠麻醉期間生理指標(biāo)均在正常范圍內(nèi),無低血糖發(fā)生,排除了生理性干擾對其影響。

七氟醚以其起效快、排出快，肌松效果良好，麻醉效果確切，對循環(huán)和呼吸功能抑制輕等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于老年患者的臨床麻醉中。研究表明七氟醚能通過促進(jìn)腦內(nèi)β淀粉樣單體寡聚化的作用引起海馬內(nèi)tau蛋白過度磷酸化，使其喪失生理功能，引起POCD[9]，同時，七氟醚亦可激活內(nèi)皮細(xì)胞鈣依賴蛋白酶產(chǎn)生大量氧自由基[5]。突觸可塑性障礙均可導(dǎo)致認(rèn)識功能障礙，樹突表面的樹突棘是形成突觸的具體位點(diǎn)，在神經(jīng)元信息傳遞和加工中起至關(guān)重要的作用[10]，七氟醚可抑制突觸后膜乙酰膽堿突觸的傳遞，從而抑制了突觸可塑性[11]。本研究結(jié)果顯示單純七氟醚麻醉組麻醉后出現(xiàn)嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙，海馬內(nèi)MDA含量升高且樹突棘密度減少，與前人研究結(jié)果一致。

Tempol是的SOD擬似物，具有分子量小，穩(wěn)定性強(qiáng)，細(xì)胞膜通透性好等特點(diǎn)，對脊髓，肝臟，腎臟的缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[12]。本研究證實(shí)給予Tempol預(yù)處理后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善，說明抗氧化劑Tempol能夠改善七氟醚所致POCD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。此外，由于七氟醚所致POCD特征性病理改變之一是海馬內(nèi)氧化應(yīng)激損傷和樹突棘減少，因此我們檢測了氧化應(yīng)激損傷和保護(hù)的標(biāo)志物MDA和SOD以及樹突棘密度的變化。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示給予Tempol預(yù)處理能夠明顯改善大鼠七氟醚所致的氧化應(yīng)激損傷而提高保護(hù)性物質(zhì)SOD的含量，并增加神經(jīng)元樹突棘密度。因此，我們推測Tempol可能通過對抗了氧化應(yīng)激損傷及增加樹突棘密度，從而改善了大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，產(chǎn)生治療七氟醚麻醉下老齡大鼠術(shù)后認(rèn)知功能的效果。

綜上所述，Tempol預(yù)處理可緩解七氟醚麻醉所引起的老齡大鼠POCD，其機(jī)制可能與Tempol抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及增加其海馬內(nèi)樹突棘密度有關(guān)。

[1] Hovens IB, Schoemaker RG, van der Zee EA,etal.Postoperative cognitive dysfunction：Involvement of neuroinflammation and neuronal functioning[J].Brain Behav Immun, 2014, 38：202-210.

[2] Hu N,Guo D,Wang H,etal.Involvement of the blood-brain barrier opening in cognitive decline in aged rats following orthopedic surgery and high concentration of sevoflurane inhalation[J]. Brain Res,2014,1551：13-24.

[3] Rortgen D. Kloos J. Fries M,etal. Comparison of early cognitive function and recovery after desflurane or sevoflurane anaesthesia in the elderly：a double-blinded randomized controlled trial[J]. Br J Anaesth,2010, 104(2)：167-174.

[4] 杜敏逸,劉毓和,吳新民. 反復(fù)吸入七氟醚對老年大鼠認(rèn)知功能的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志,2009,29(3)：233-235.

[5] Xiong Y, Singh IN, Hall ED. Tempol protection of spinal cord mitochondria from peroxynitrite-induced oxidative damage[J]. Free Radic Res, 2009, 43(6): 604-612.

[6] 曹巖巖,孟凌新,趙柏松.Tempol預(yù)處理對大鼠心肺復(fù)蘇后腦內(nèi)HIF-1α及VEGF變化的影響[J].廣東醫(yī)學(xué),2014,35(4)：497-500.

[7] 李夢圓,趙為祿,湯 洋,等.孕早期七氟醚麻醉對子代大鼠認(rèn)知功能的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志,2011,31(12)：1431-1433.

[8] Zhao BS, Ding YY, Meng LX,etal. Hyperbaric oxygen treatment produces an antinociceptive response phase and inhibits astrocyte activation and inflammatory response in a rat model of neuropathic pain[J]. J Mol Neurosci,2014,53(2)：251-261.

[9] Lu Y,Wu X,Dong Y,etal.Anesthetic sevoflurane causes neurotoxicity differently in neonatal naive and Alzheimer disease transgenic mice[J]. Anesthesiology,2001,112(6)：1404-1416.

[10] Glynn IM. A hundred years of sodium pumping[J]. Annu Rev Physiol ,2002, 64：1-18.

[11] Zheng H,Dong Y,Xu Z,etal. Sevoflurane Anesthesia in Pregnant Mice Induces Neurotoxicity in Fetal and Offspring Mice[J]. Anesthesiology,2013,118(3)：516-526.

[12] Rak R，Chao DL，P1uta RM，etal．Neuroprotection by the stable nitroxide Tempol during reperfusion in a rat model of transient focal ischemia[J]. J Neurosurg, 2000, 92：646-651．

(收稿：2014-09-17)

甲醚類 麻醉 認(rèn)知障礙 氧化性應(yīng)激 樹突棘 自由基清除劑 @ Tempol

R614.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.008