經(jīng)方鱉甲煎丸抑制H22肝癌細(xì)胞血管生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究*

湯新躍

廣東省第二人民醫(yī)院腫瘤二科 (廣州 510317)

經(jīng)方鱉甲煎丸抑制H22肝癌細(xì)胞血管生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究*

湯新躍

廣東省第二人民醫(yī)院腫瘤二科 (廣州 510317)

目的：探討經(jīng)方鱉甲煎丸對(duì)H22肝癌細(xì)胞荷瘤小鼠血管生長(zhǎng)的抑制效果，為鱉甲煎丸在肝癌治療的臨床應(yīng)用提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。方法：選用120只昆明小鼠，以H22肝癌細(xì)胞建立H22荷瘤小鼠動(dòng)物模型，隨機(jī)分為A組、B組、C組和D組各30例，A組為高劑量鱉甲煎丸灌胃服用，B組為低劑量鱉甲煎丸灌胃服用，C組為環(huán)磷酰胺注射液腹腔注射，D組為陰性對(duì)照組，連續(xù)用藥15d后將其處死，剝離瘤塊并檢測(cè)腫瘤組織的微血管計(jì)數(shù)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞面積占腫瘤細(xì)胞面積的比例并進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果：A組小鼠的微血管計(jì)數(shù)結(jié)果為(4.08±1.32)條，顯著少于其余三組小鼠(均P<0.05)；B組小鼠的微血管計(jì)數(shù)結(jié)果為(7.72±1.51)條，顯著少于C組和D組小鼠(均P<0.05)；A組小鼠的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞所占面積為(2.32±1.08)%，顯著少于其余三組小鼠(均P<0.05)；B組小鼠的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞所占面積為(5.61±1.42)%，顯著少于C組和D組小鼠(均P<0.05)，C組小鼠的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞所占面積為(9.21±3.36)%，顯著少于D組小鼠(P<0.05)。結(jié)論：鱉甲煎丸可顯著降低H22荷瘤小鼠肝癌組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，抑制新生微血管的生成，進(jìn)而對(duì)腫瘤組織的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有一定的抑制作用。

鱉甲煎丸出自于張仲景的《金匱要略》，其方藥組成較多，具有平調(diào)寒熱、攻補(bǔ)并用、軟堅(jiān)散結(jié)、行氣化瘀的作用?！督饏T要略》中以瘧病日久引起的瘧母、癥瘕為其主治證。然而，隨著現(xiàn)代研究的深入，鱉甲煎丸的臨床應(yīng)用得到了不斷的擴(kuò)展，目前已經(jīng)有應(yīng)用鱉甲煎丸治療肝硬化、肝吸蟲等，同時(shí)也有動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)，鱉甲煎丸具有一定的抗肝纖維化、腎間質(zhì)纖維化的作用[1-2]。在腫瘤的治療上，鱉甲煎丸也有治療肝癌的報(bào)道，且取得一定的臨床療效[3]。然而，由于本方所包含的方藥較多，且用法較為獨(dú)特，而其治療肝癌的報(bào)道多為個(gè)案研究，較少藥理及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)支撐，這將直接影響鱉甲煎丸進(jìn)一步臨床應(yīng)用。本研究觀察鱉甲煎丸對(duì)H22肝癌細(xì)胞血管生長(zhǎng)的抑制效果，為鱉甲煎丸在肝癌治療上的臨床應(yīng)用提供現(xiàn)代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 主要試驗(yàn)材料 本研究所用120只雄性昆明種小鼠均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，小鼠體重為18～22g。隨機(jī)將上述小鼠分為A組、B組、C組和D組各30只。H22荷瘤小鼠模型則由中山醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供。本研究所用鱉甲煎丸由武漢中聯(lián)藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供，國(guó)藥準(zhǔn)字Z42020772，環(huán)磷酰胺注射液由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供，國(guó)藥準(zhǔn)字H32020856。

1.2 主要試劑 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子一抗、生物素標(biāo)記兔抗山羊二抗均由上海安研生物有限公司提供，SABC免疫組化試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3 研究方法 將接種了10dH22肝癌細(xì)胞的小鼠以頸椎脫臼法處死，蠟板固定后，將其腹腔內(nèi)的腹水抽出。以相同體積的0.9%氯化鈉注射液將抽出的腹水稀釋后，采用0.2%臺(tái)盼藍(lán)染色，將腫瘤細(xì)胞懸液的濃度調(diào)整為6×106/mL。然后抽取0.2mL于每只小鼠的右后肢皮下注射，接種完成后24h開(kāi)始各組小鼠給藥。鱉甲煎丸懸液的制備采用蒸餾水和鱉甲煎丸配制而成。分別配制濃度為0.024g/mL和0.048g/mL兩種濃度的鱉甲煎丸懸液，配制完成后，儲(chǔ)存于4℃的環(huán)境中備用。A組小鼠按照每天每公斤12g的劑量灌胃服用鱉甲煎丸懸液，B組小鼠按照每天每公斤體重6g的劑量灌胃服用鱉甲煎丸懸液，C組小鼠每天按照每公斤體重20mg的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺注射液，D組小鼠每天蒸餾水灌胃。四組小鼠均按照各自方案用藥15d后處死，剝離腫瘤后稱重，并檢測(cè)腫瘤的相關(guān)指標(biāo)。

1.4 觀察指標(biāo) 分別檢測(cè)瘤塊內(nèi)的微血管計(jì)數(shù)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的水平。瘤塊內(nèi)微血管計(jì)數(shù)的檢測(cè)方法如下：分別在每組小鼠瘤體的不同部位取出5個(gè)體積為5mm×5mm×2mm的標(biāo)本，取標(biāo)本時(shí)注意避開(kāi)出血部位和邊緣反應(yīng)區(qū)。所取的標(biāo)本經(jīng)過(guò)HE染色，現(xiàn)在40倍顯微鏡下標(biāo)記血管計(jì)數(shù)最高的3個(gè)區(qū)域，然后通過(guò)100倍顯微鏡在相應(yīng)區(qū)域計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)每個(gè)高倍鏡視野中的微血管計(jì)數(shù)。計(jì)算微血管數(shù)目時(shí)，對(duì)于有較厚血管平滑肌或者管腔面積超過(guò)8個(gè)紅細(xì)胞面積的血管忽略不計(jì)，這樣可避免較大的血管影響計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。以5個(gè)部位計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值為最終的微血管計(jì)數(shù)結(jié)果。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平的檢測(cè)方法如下：瘤塊剝離后，經(jīng)過(guò)固定、脫水、浸蠟、包蠟、切片5個(gè)步驟處理后，采用SABC免疫組化試劑盒對(duì)其血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平進(jìn)行檢測(cè)。如果細(xì)胞的胞質(zhì)、胞膜有棕黃色著色的判定為陽(yáng)性細(xì)胞。以切片細(xì)胞著色明顯的區(qū)域取10個(gè)高倍視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算每個(gè)高倍視野中100個(gè)腫瘤細(xì)胞中，陽(yáng)性細(xì)胞所占的比例。以細(xì)胞漿內(nèi)有棕黃色為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子陽(yáng)性的判定標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子陽(yáng)性的細(xì)胞面積和腫瘤細(xì)胞面積的比值。對(duì)比四組小鼠的腫瘤微血管計(jì)數(shù)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié) 果 2.1 四組小鼠腫瘤組織微血管計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比 A組小鼠的微血管計(jì)數(shù)結(jié)果為(4.08±1.32)條，顯著少于其余三組小鼠(均P<0.05)；B組小鼠的微血管計(jì)數(shù)結(jié)果為(7.72±1.51)條，顯著少于C組和D組小鼠(均P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 四組小鼠腫瘤微血管計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比

注：和A組對(duì)比，△P<0.05，和B組對(duì)比，▲P<0.05

2.2 四組小鼠腫瘤組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比 A組小鼠的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞所占面積為(2.32±1.08)%，顯著少于其余三組小鼠(均P<0.05)；B組小鼠的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞所占面積為(5.61±1.42)%，顯著少于C組和D組小鼠(均P<0.05)，C組小鼠的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞所占面積為(9.21±3.36)%，顯著少于D組小鼠(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 四組小鼠腫瘤組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比

注：和A組對(duì)比，△P<0.05，和B組對(duì)比，▲P<0.05，和C組對(duì)比，◇P<0.05

3 討 論 鱉甲煎丸是目前臨床較為常用經(jīng)方，近年來(lái)的臨床報(bào)道顯示，本方可用于肝纖維化、慢性肝炎、肝硬化等的治療中，同時(shí)在肝癌、胃癌等抗腫瘤的治療中，也證實(shí)具有較為肯定的療效[4-5]。然而，目前的臨床研究多為單純的案例報(bào)道，缺乏現(xiàn)代藥理或者實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)據(jù)作為理論支撐，這將使鱉甲煎丸的廣泛應(yīng)用受到限制。本研究試圖通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究，為鱉甲煎丸在肝癌的治療上提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

臨床研究已經(jīng)證實(shí)，惡性腫瘤的侵襲力與新生血管的產(chǎn)生有直接的關(guān)系，馬晨光[6]的研究顯示，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的濃度和胸部惡性腫瘤的惡性行為有密切的關(guān)系。林道浙等[7]的研究也證實(shí)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子濃度的檢測(cè)可用于評(píng)估肝癌的生物學(xué)行為和患者的預(yù)后。由于惡性腫瘤的代謝旺盛，其增殖、轉(zhuǎn)移均需要新生血管提供充足的血液供應(yīng)，以保證腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子則在誘導(dǎo)腫瘤新生血管的產(chǎn)生上發(fā)揮了重要的作用，因此，檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的濃度有助于評(píng)估腫瘤的惡性程度和增殖的活躍程度[8]。本研究的結(jié)果證實(shí)，經(jīng)過(guò)高劑量鱉甲煎丸懸液喂養(yǎng)的小鼠，其微血管計(jì)數(shù)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞面積均最少，而低劑量鱉甲煎丸懸液喂養(yǎng)小鼠的微血管計(jì)數(shù)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞面積也顯著低于單純環(huán)磷酰胺注射液腹腔注射的小鼠。這說(shuō)明鱉甲煎丸能夠有效抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制肝癌組織新生微血管的生成，這與鄭艷等的研究結(jié)果基本一致[9]。同時(shí)，鱉甲煎丸服用劑量的增加能夠增強(qiáng)其抑制肝癌組織新生微血管生成的作用。由于腫瘤組織的血管密度越高，腫瘤細(xì)胞經(jīng)進(jìn)入血循環(huán)而發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)越大，鱉甲煎丸的應(yīng)用顯著抑制了微血管的生成，這不僅對(duì)腫瘤組織的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，同時(shí)也降低了肝癌細(xì)胞發(fā)生血行轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。羅慶東等[10]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)，鱉甲煎丸可下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移有抑制作用。

綜上所述，鱉甲煎丸可顯著降低H22荷瘤小鼠肝癌組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，抑制新生微血管的生成，進(jìn)而對(duì)腫瘤組織的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有一定的抑制作用。

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(收稿2015-03-08；修回2015-04-06)

*廣東省中醫(yī)藥管理局科研立項(xiàng)(20131106)

肝腫瘤/中醫(yī)藥療法 @鱉甲煎丸 動(dòng)物，實(shí)驗(yàn) 小鼠

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.07.083