吉非替尼對(duì)哮喘小鼠模型氣道上皮重塑抑制作用的研究*

第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科(西安710032) 宋 嬌 馬戰(zhàn)平 劉大鵬 楊學(xué)敏 宋立強(qiáng)

吉非替尼對(duì)哮喘小鼠模型氣道上皮重塑抑制作用的研究*

第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科(西安710032) 宋 嬌△馬戰(zhàn)平#劉大鵬 楊學(xué)敏 宋立強(qiáng)▲

目的：觀察選擇性表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼對(duì)哮喘小鼠氣道上皮重塑的影響。方法：將BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、哮喘組、吉非替尼預(yù)防組(預(yù)防組)、吉非替尼治療組(治療組)。蘇木精-伊紅染色法、過碘酸-雪夫特殊染色法、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法分別檢測(cè)各組小鼠氣道中炎癥細(xì)胞浸潤水平、杯狀細(xì)胞數(shù)量及上皮細(xì)胞凋亡等指標(biāo),Western blot法檢測(cè)各組小鼠肺組織中p-EGFR、EGFR蛋白含量的變化。結(jié)果：與正常對(duì)照組相比,哮喘組小鼠出現(xiàn)明顯的氣道柱狀纖毛上皮損傷脫落、杯狀細(xì)胞數(shù)量增加的病理變化,吉非替尼預(yù)防組與治療組的上述病理改變程度有所改善,以預(yù)防組改善最為明顯，各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與哮喘組相比,預(yù)防組和治療組肺組織中p-EGFR表達(dá)水平明顯減少(P<0.05)。與哮喘組相比,預(yù)防組小鼠肺組織氣道上皮細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05),治療組表現(xiàn)出凋亡細(xì)胞增多的趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：吉非替尼通過阻斷EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路，增加哮喘氣道上皮新生細(xì)胞凋亡的數(shù)量，從而達(dá)到一定抑制氣道上皮重塑的效果，為哮喘氣道重塑的防治提供了新的思路。

氣道上皮細(xì)胞是哮喘發(fā)病的始動(dòng)部位之一，其結(jié)構(gòu)重塑的主要特征是柱狀纖毛上皮細(xì)胞數(shù)量減少、杯狀細(xì)胞增生而比例顯著增高,從而引發(fā)氣道黏液高分泌及促進(jìn)全層氣道重塑的形成。上皮重塑的發(fā)生機(jī)制是氣道慢性持續(xù)性炎癥的反復(fù)損傷及組織異常修復(fù),目前其防治已成為治療哮喘的研究熱點(diǎn)。上皮細(xì)胞表皮生長因子受體(EGFR)及下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在氣道上皮組織損傷修復(fù)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，近期研究發(fā)現(xiàn)哮喘氣道上皮組織中EGFR的表達(dá)水平與組織損傷、病情嚴(yán)重程度相一致[1],提示阻斷EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能對(duì)哮喘上皮重塑及病情控制起到一定作用。吉非替尼是EGFR酪氨酸激酶抑制劑,可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌的臨床治療[2]。本實(shí)驗(yàn)擬通過給予哮喘小鼠模型吉非替尼預(yù)防和治療性干預(yù),觀察哮喘小鼠氣道上皮重塑的變化,并初步探討其機(jī)制。

材料與方法

1 材 料 ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)雌性BALB/c小鼠40只，6～8周齡，體重19～25g，非含卵蛋白飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度21℃～25℃，濕度為45.5%～65.5%。由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。②主要試劑：Schiff試劑、雞卵清蛋白(OVA II級(jí))購自Sigma公司,EGFR抗體、磷酸化EGFR抗體購自Cell signal technology公司,原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記試劑盒(POD)、DAPI試劑購自Roche公司,總蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒為碧云天公司產(chǎn)品,吉非替尼原料為AstraZeneca UK Limited公司提供。③主要儀器設(shè)備：霧化器(402C型,上海魚躍公司)、霧化箱(自制)；生物圖像分析系統(tǒng)(Image Pro Plus 6.0,美國Media Cybernetics公司)

2 方 法 ①動(dòng)物分組及哮喘模型建立：參照文獻(xiàn)[3]并做改良。實(shí)驗(yàn)小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組10只：正常對(duì)照組、哮喘組、哮喘+吉非替尼預(yù)防組(預(yù)防組)、哮喘+吉非替尼治療組(治療組)。后3組小鼠在第0、7日給予0.5ml OVA/Al(OH)3溶液腹腔注射致敏，第14～20日每日霧化吸入OVA(2.3mg/m3，5h/d)激發(fā)；正常對(duì)照組給予生理鹽水替代OVA腹腔注射及霧化吸入。預(yù)防組小鼠于第14～20日霧化吸入前12h按體重以50mg/kg劑量飼喂吉非替尼溶液(10mg/ml,溶于10%葡萄糖溶液),治療組小鼠于第18～20日霧化吸入前12h給予吉非替尼口服(劑量同預(yù)防組),正常對(duì)照組和哮喘組小鼠于第14～20日霧化吸入前12h按體重以50mg/kg劑量飼喂10%葡萄糖溶液。②取材及標(biāo)本制備：在末次激發(fā)24h后,腹腔注射10mg戊巴比妥鈉麻醉后處死各組小鼠，充分暴露胸腔內(nèi)容物，取左肺剪成厚約0.3cm小段，置4%多聚甲醛緩沖液浸泡24h后,常規(guī)脫水、石蠟包埋,制成約3μm厚度石蠟組織切片；右肺立即置于液氮中冷凍保存,待Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。③HE染色檢測(cè)小鼠氣道炎癥水平：石蠟切片常規(guī)脫蠟、梯度酒精水化后,行HE染色。于光鏡下觀察，每只小鼠隨機(jī)選5張肺組織切片,每張切片以單盲法隨機(jī)選取橫斷面較圓 (直徑約100～200μm,管腔最短徑/最長徑≥0.6)的支氣管5支進(jìn)行觀察并照相。按文獻(xiàn)[4]評(píng)定支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤程度：無炎癥細(xì)胞(0分);少許炎癥細(xì)胞(1分);較多分布不均勻的炎癥細(xì)胞(2分);大量炎癥細(xì)胞,分布較均勻,少見聚集成團(tuán)(3分);大量炎癥細(xì)胞聚集成團(tuán)(4分)，取其平均值為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。④PAS染色檢測(cè)小鼠氣道杯狀細(xì)胞增生水平：石蠟切片常規(guī)脫蠟、梯度酒精水化后,行過碘酸-雪夫染色。杯狀細(xì)胞所含及分泌黏液以中性糖蛋白為主,呈紫紅色。具體方法同HE染色,測(cè)量杯狀細(xì)胞面積(Wag)和支氣管基底膜周徑(Pbm),計(jì)算Wag/Pbm值,取其平均值為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。⑤Western blot技術(shù)檢測(cè)肺組織EGFR、p-EGFR含量：取右肺下葉組織約100.0mg,首先利用蛋白提取試劑盒提取標(biāo)本總蛋白并定量，進(jìn)行電泳、切膠、電轉(zhuǎn)膜，再進(jìn)行一抗、二抗孵育，最后用熒光顯色劑浸泡經(jīng)過一抗和二抗孵育的膜,暗室曝光。以β-actin為內(nèi)參對(duì)照,使用生物圖像分析系統(tǒng)分別統(tǒng)計(jì)EGFR、p-EGFR計(jì)算條帶灰度值,并計(jì)算p-EGFR/EGFR比值為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。⑥原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法檢測(cè)氣道上皮細(xì)胞凋亡情況：石蠟切片常經(jīng)脫蠟、梯度酒精水化后，TUNEL法檢測(cè)小鼠氣道杯狀細(xì)胞凋亡情況。嚴(yán)格按說明書操作，預(yù)處理為20μg/ml蛋白酶K溶液37℃消化15min，1μg/ml DAPI復(fù)染細(xì)胞核，甘油封片。綠色熒光為凋亡陽性信號(hào)，藍(lán)色熒光為DAPI復(fù)染信號(hào),均表達(dá)于細(xì)胞核，綠色與藍(lán)色熒光重合,判定為陽性凋亡杯狀細(xì)胞。具體方法同HE染色實(shí)驗(yàn)。計(jì)數(shù)凋亡氣道上皮細(xì)胞數(shù)為Acm,以支氣管基底膜周徑(Pbm)標(biāo)準(zhǔn)化凋亡細(xì)胞數(shù)量(Acm/Pbm,個(gè)/mm)，取其平均值為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

結(jié) 果

1 各組小鼠氣道病理變化及組織炎癥狀況 見表1。正常對(duì)照組小鼠氣道上皮組織切片鏡下結(jié)構(gòu)完整,假復(fù)層纖毛柱狀上皮分布規(guī)整,黏膜下少量炎癥細(xì)胞浸潤。與正常對(duì)照組小鼠比較,哮喘組小鼠氣道上皮結(jié)構(gòu)破壞,柱狀纖毛上皮細(xì)胞脫落,黏膜下大量炎癥細(xì)胞浸潤。與哮喘組小鼠比較,預(yù)防組、治療組小鼠上皮細(xì)胞的病理改變減輕,炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)量明顯減少,尤以預(yù)防組改善最為明顯。

2 各組小鼠中氣道杯狀細(xì)胞數(shù)量及增生水平 見表1。正常對(duì)照組小鼠氣道上皮中杯狀細(xì)胞的數(shù)量較少，呈現(xiàn)散在分布,內(nèi)含少量著色的黏蛋白顆粒。與正常對(duì)照組比較,哮喘組小鼠氣道杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著增多,呈現(xiàn)簇狀分布,內(nèi)含大量著色的分泌顆粒,同時(shí)管腔中也可見黏蛋白顆粒。吉非替尼預(yù)防組、吉非替尼治療組氣道杯狀細(xì)胞數(shù)量較哮喘組明顯減少,以預(yù)防組最為明顯。

表1 各組小鼠氣道黏膜炎癥水平及杯狀細(xì)胞數(shù)量的比較

注：與正常對(duì)照組相比,*P<0.05；與哮喘組相比,△P<0.05；與預(yù)防組相比,▲P<0.05

3 各組小鼠中肺組織中p-EGFR、EGFR蛋白表達(dá)水平 見表2。與正常對(duì)照組比較，哮喘組小鼠肺組織中p-EGFR、EGFR條帶灰度值明顯增高,預(yù)防組、治療組小鼠肺組織中p-EGFR條帶灰度值明顯減少,預(yù)防組減少最為明顯。

表2 各組小鼠肺組織p-EGFR、EGFR蛋白 表達(dá)水平的比較

注：與正常對(duì)照組相比,*P<0.05；與哮喘組相比,△P<0.05；與預(yù)防組相比,▲P<0.05

4 各組小鼠中氣道上皮細(xì)胞凋亡水平 哮喘組小鼠氣道上皮Acm/Pbm為(15.44±3.456)明顯高于正常組小鼠(5.22±1.324)(P<0.05)；與哮喘組相比，治療組小鼠Acm/Pbm(17.92±3.987)無明顯差異(P>0.05)，而預(yù)防組小鼠Acm/Pbm(25.54±8.232)明顯增加(P<0.05)。

5 相關(guān)性分析 各組小鼠肺組織p-EGFR蛋白表達(dá)水平與氣道杯狀細(xì)胞的數(shù)量，呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系(r2=0.59，P<0.05)，提示p-EGFR蛋白水平與杯狀細(xì)胞數(shù)量即黏液高分泌癥狀的形成密切相關(guān)。

討 論

哮喘急性發(fā)作及緩解患者均存在氣道重塑病理改變，提示氣道重塑與氣道炎癥是兩個(gè)并行發(fā)展且互相影響的病理過程[5]。甚至兒童哮喘也能見到氣道重塑現(xiàn)象。哮喘氣道重塑以氣道組織破壞和脫落、杯狀細(xì)胞化生和增生、氣道平滑肌增生和肥大為主要病理特征[6]，可導(dǎo)致持續(xù)性氣流受限,引起肺功能下降和氣道高反應(yīng)性。杯狀細(xì)胞數(shù)量增多為特征的上皮結(jié)構(gòu)病理改變是上皮重塑的主要特征，是哮喘啟動(dòng)、維持及加重的重要因素之一。當(dāng)前臨床上哮喘控制性藥物(如糖皮質(zhì)激素)主要針對(duì)氣道炎癥改變，而對(duì)上皮重塑作用有限[7],從而對(duì)黏液高分泌的癥狀改善功能有限。

蛋白酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在氣道上皮細(xì)胞活化與增殖中發(fā)揮重要作用，是氣道上皮組織損傷和修復(fù)機(jī)制中必要和充分條件。EGFR是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,經(jīng)EGF、TGF-α、TNF-α、HB-EGF等因子激活后發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。哮喘患者氣道上皮組織高表達(dá)EGFR，與組織損傷、病情嚴(yán)重程度相一致[1]。吉非替尼可阻滯EGFR酪氨酸激酶磷酸化，給予哮喘小鼠吉非替尼干預(yù)可抑制氣道杯狀細(xì)胞增生，減輕氣道黏液高分泌癥狀，控制氣道炎癥[8]，研究證實(shí)EGFR抑制劑可抑制哮喘大鼠氣道上皮細(xì)胞增殖[9],但對(duì)氣道上皮細(xì)胞凋亡的作用尚未見報(bào)道。

本研究構(gòu)建哮喘模型后，觀察到氣道上皮組織脫落、氣道杯狀細(xì)胞增生及炎癥細(xì)胞廣泛浸潤等病理改變，與相關(guān)報(bào)道[10]一致，證實(shí)該哮喘小鼠模型出現(xiàn)氣道重塑。給予預(yù)防和治療性吉非替尼干預(yù)后，上述癥狀均有所減輕，以吉非替尼預(yù)防組改善最為明顯。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠氣道上皮組織高表達(dá)EGFR，與文獻(xiàn)[7]一致；吉非替尼干預(yù)后活化的EGFR(p-EGFR)表達(dá)減少，以吉非替尼預(yù)防組減少最為顯著,這一趨勢(shì)與干預(yù)后氣道重塑的相關(guān)病理改變相一致，提示EGFR信號(hào)傳導(dǎo)在哮喘小鼠氣道重塑中發(fā)揮重要作用,證實(shí)通過吉非替尼阻滯EGFR信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)哮喘小鼠氣道重塑的防治具有一定作用，且早期預(yù)防性干預(yù)效果最佳。

既往研究發(fā)現(xiàn)與EGFR具有抑制氣道上皮細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。Bax/Bcl-2在細(xì)胞中比例決定凋亡進(jìn)程，研究發(fā)現(xiàn)EGFR可上調(diào)體外培養(yǎng)氣道上皮細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡[11]，而EGFR信號(hào)傳導(dǎo)下游通路PI3K/AKT的激活可誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax絲氨酸184磷酸化，促進(jìn)Bax停留在細(xì)胞質(zhì)中以及增加Bax與抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-xL形成異二聚體的作用，也具有抑制凋亡作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，吉非替尼預(yù)防組小鼠氣道新生上皮細(xì)胞的凋亡數(shù)量明顯增加，但吉非替尼治療組較哮喘組差異不顯著。吉非替尼預(yù)防與治療兩種干預(yù)措施在誘導(dǎo)凋亡方面的差異，提示藥物的干預(yù)時(shí)機(jī)只有與增殖細(xì)胞的周期達(dá)到某種契合時(shí)方能表現(xiàn)出預(yù)期的效應(yīng)。通過誘導(dǎo)新生細(xì)胞特別是杯狀細(xì)胞的凋亡，是吉非替尼實(shí)現(xiàn)一定程度逆轉(zhuǎn)氣道重塑的主要機(jī)制之一。除Bax/Bcl-2之外，可能還有其它途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡，通過阻斷EGFR信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)凋亡機(jī)制仍待深入研究。

總之，吉非替尼通過阻斷EGFR作用于氣道上皮這一哮喘發(fā)病的第一防線，能夠降低氣道炎癥水平、減少杯狀細(xì)胞數(shù)量及黏液高分泌，并通過凋亡途徑減少上皮新生細(xì)胞達(dá)到一定的逆轉(zhuǎn)氣道上皮重塑的作用，為哮喘氣道重塑的防治提供了新的思路。

[1] Wong WS.Inhibitors of the tyrosine kinase signaling cascade for asthma[J].Curr Opin Pharmacol, 2005,5(3)：264-271.

[2] Ciardiello F,Tortora G.EGFR antagonists in cancer treatment[J].N Engl J Med,2008,358(11)：1160-1174.

[3] Shi ZO,Fischer MJ,De Sanctis GT,etal.IFN-gamma, but not Fas, mediates reduction of allergen-induced mucous cell metaplasia by inducing apoptosis[J].J Immunol,2002,168(9)：4764-4771.

[4] Henderson WJ,Tang LO,Chu SJ,etal.A role for cysteinyl leukotrienes in airway remodeling in a mouse asthma model[J].Am J Respir Crit Care Med,2002,165(1)：108-116.

[5] Pohunek P,Warner JO,Turzikova J,etal.Markers of eosinophilic inflammation and tissue re-modelling in children before clinically diagnosed bronchial asthma[J]. Pediatr Allergy Immunol,2005,16(1)：43-51.

[6] Yamaguchi M,Niimi A, Matsumoto H,etal. Sputum levels of transforming growth factor-beta1 in asthma: relation to clinical and computed tomography findings[J].J Investig Allergol Clin Immunol, 2008,18(3)：202-206.

[7] Takizawa H. Novel strategies for the treatment of asthma[J]. Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov, 2007,1(1)：13-19.

[8] Hur GY,Lee SY,Lee SH,etal.Potential use of an anticancer drug gefinitib, an EGFR inhibitor, on allergic airway inflammation[J].Exp Mol Med,2007,39(3)：367-375.

[9] 龍懷聰,王曾禮,肖邦榕,等.表皮生長因子受體對(duì)支氣管哮喘大鼠氣道重塑的影響[J].中華結(jié)核和呼吸雜志, 2014,27(11)：774-775.

[10] Chen M,Lv Z,Jiang S.The effects of triptolide on airway remodelling and transforming growth factor-beta(1)/Smad signalling pathway in ovalbumin-sensitized mice[J].Immunology,2011,132(3)：376-384.

[11] Casalino-Matsuda SM, Monzon ME,Forteza RM.Epidermal growth factor receptor activation by epidermal growth factor mediates oxidant-induced goblet cell metaplasia in human airway epithelium[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2006,34(5)：581-591.

(收稿：2014-11-11)

The inhibitive effects of gefinitib on the airway epithelium remodeling of bronchial asthma in mice

Department of Respiratory and Critical Care Medicine，Xijing Hospital, Fourth Military

Medical University (Xi’an 710032) Song Jiao Ma Zhanping Liu Dapeng et al

Objective：To evaluate the treatment effects of gefinitib,a selective Epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor, on the airway remodeling in asthmatic mice.Methods： BALB/c mice were randomly divided into a sham-challenged asthmatic group, an asthma group, a gefinitib prevention group (prevention group), and a gefinitib treatment group (treatment group). HE staining detected the inflammatory lesions of lung tissues and the proliferation of airway epithelium in mice of all groups. PAS staining detected the cell counting and mucus secretion of airway goblet cells in mice of all groups. TUNEL method detected apoptosis of lung tissues in mice of all groups. Western blot method was used to detecte p-EGFR and EGFR protein expression of lung tissues in mice of all groups. Results：Compared with the sham-challenged asthmatic group, there were more significant inflammatory lesions of lung tissues, increasing numbers of airway goblet cells in mice of asthma group. These pathological change were improved in mice of both prevention group and treatment group and especially in the prevention group (P<0.05, respectively). Compared with the asthma group, there were significantly less expression of p-EGFR in mice of both prevention group and treatment group and especially in the prevention group (P<0.05, respectively). Compared with the asthma group, the apoptosis rate of airway epithelium was increased in mice of prevention group (P<0.05), and there was no significant difference between the asthma group and treatment group (P>0.05). Conclusion： Gefinitib have some protective effects on airway epithelium remodeling of asthmatic mice, and its mechanism may be blocking the EGFR signaling and inducing the apoptosis of asthma airway epithelial cells.

Receptor,epidermal growth factor Asthma Airway remodeling Apoptosis

*國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81070029)

受體,表皮生長因子 哮喘 氣道重塑 細(xì)胞凋亡

R562.25

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.06.002

△新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第二師庫爾勒醫(yī)院呼吸科

#陜西省中醫(yī)藥研究院

▲通訊作者