不同品種蘑菇的培養(yǎng)基質(zhì)中胞外酶活性研究

關(guān)麗杰， 田 璐

(沈陽(yáng)化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院， 遼寧 沈陽(yáng) 110142)

不同品種蘑菇的培養(yǎng)基質(zhì)中胞外酶活性研究

關(guān)麗杰， 田 璐

(沈陽(yáng)化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院， 遼寧 沈陽(yáng) 110142)

該研究分別從9種不同品種的蘑菇培養(yǎng)基質(zhì)中提取幾丁質(zhì)酶和殼聚糖酶2種胞外酶并測(cè)定其酶活力.結(jié)果表明：平菇的培養(yǎng)基質(zhì)中幾丁質(zhì)酶的活性最高，達(dá)33 U/g培養(yǎng)基質(zhì)；金針菇的培養(yǎng)基質(zhì)中殼聚糖酶的活性最高，達(dá)21.062 U/g培養(yǎng)基質(zhì).根據(jù)酶活測(cè)定的結(jié)果選取其中3種酶活較高的培養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行抑菌活性的研究.結(jié)果表明:3種培養(yǎng)基質(zhì)的粗酶液對(duì)蠟樣芽孢桿菌、番茄細(xì)菌性潰瘍病菌和巨大芽孢桿菌3種病原菌均有抑制活性，且對(duì)巨大芽孢桿菌的抑菌活性最強(qiáng).

蘑菇培養(yǎng)基質(zhì)； 幾丁質(zhì)酶； 殼聚糖酶； 酶活力測(cè)定； 抑菌活性

幾丁質(zhì)(chitin)及殼聚糖(chitosan)是自然界中比較豐富的多聚糖，通過(guò)幾丁質(zhì)酶(chitinase)和殼聚糖酶(chitosanase)的作用,幾丁質(zhì)和殼聚糖將分別被降解為乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖.在某些植物病原菌的細(xì)胞壁中含有殼聚糖，在降解殼聚糖的方面，幾丁質(zhì)酶和殼聚糖酶之間沒(méi)有明顯的區(qū)別,二者均能降解不同乙酰化水平的殼聚糖[1]，達(dá)到抑制病原菌的目的.在植物中殼聚糖酶可以抵抗植物病原菌的感染，可作為植物功能調(diào)節(jié)劑，增強(qiáng)植物對(duì)病蟲(chóng)害的防御能力.因此，可以以此開(kāi)發(fā)生產(chǎn)生物農(nóng)藥.而且殼聚糖酶是一種RP蛋白，可以提高植物的抗病能力[2].其降解產(chǎn)物幾丁寡糖和殼寡糖具有許多生物活性，比如抗真菌、抗細(xì)菌、抗癌、抗感染、提高機(jī)體免疫力、降低膽固醇和促進(jìn)鈣的吸收等，且易溶于水，有吸濕性和保濕性，在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和化妝品等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[3-11].

幾丁質(zhì)酶在一定的環(huán)境下能夠水解幾丁質(zhì),幾丁質(zhì)在害蟲(chóng)和植物病原真菌中廣泛存在[12]，所以,幾丁質(zhì)酶在植物病蟲(chóng)害防治中具有重要作用.另外，通過(guò)生化方法制備高純度的幾丁質(zhì)酶還可以作為外用藥物,用于治療人類由真菌引起的疾病.在國(guó)外,幾丁質(zhì)酶還用來(lái)處理幾丁質(zhì)廢物,由于蝦、蟹殼是細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的有利場(chǎng)所,不有效處理廢殼,極易對(duì)環(huán)境造成污染,采用幾丁質(zhì)酶進(jìn)行水解處理,不僅徹底有效而且對(duì)環(huán)境沒(méi)有影響[13-16].

本研究選取9種不同品種蘑菇的培養(yǎng)基質(zhì)，旨在從中提取出幾丁質(zhì)酶及殼聚糖酶，并對(duì)其酶活性及其抑菌活性進(jìn)行研究，為兩種酶的進(jìn)一步分離純化做一些基礎(chǔ)工作.

1 材料與方法

平菇(Pleurotusostreatus)、猴頭菇(Hericiumerinacium)、真姬菇(Hypsizygusmarmoreus)、黃傘菌菇(Pholiotaadipose)、毛木耳(Auriculariapolytricha)、滑子蘑(Pholiotanameko)、大白樁菇(Leucopaxillusgiganteus)、金針菇(Flammulinavelutipes)、金頂側(cè)耳(Pleurotuscornucopiaevar.citrinopileatus)9種蘑菇的培養(yǎng)基質(zhì).

病原菌包括大腸桿菌(Escherichiacoli)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、番茄細(xì)菌性潰瘍病菌(Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis)和巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)4種.

1.2 試 劑

乙二醇幾丁質(zhì)(EGC)購(gòu)自日本W(wǎng)AKO公司；脫乙酰幾丁質(zhì)酶檢測(cè)底物(AZCL-chitosan)購(gòu)自愛(ài)爾蘭Megazyme公司；N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)、營(yíng)養(yǎng)肉湯等試劑均為日本生產(chǎn).

1.3 各種溶液的配制

(1) 硼酸鈉溶液

（四）創(chuàng)新階段：打造共建共治共享的社會(huì)治理格局。2012年，黨的十八大提出“要圍繞構(gòu)建中國(guó)特色社會(huì)主義社會(huì)管理體系，加快形成黨委領(lǐng)導(dǎo)、政府負(fù)責(zé)、社會(huì)協(xié)同、公眾參與、法治保障的社會(huì)管理體制”。首先，首次提出了要構(gòu)建中國(guó)特色社會(huì)主義社會(huì)管理體系，并系統(tǒng)地闡述了社會(huì)管理需要“法治保障”，這一新內(nèi)容表明社會(huì)管理要與法治相結(jié)合。其次，提出要把社會(huì)管理和社會(huì)建設(shè)統(tǒng)一起來(lái)，以“創(chuàng)新社會(huì)管理”來(lái)促進(jìn)社會(huì)建設(shè)。最后，指出要加強(qiáng)創(chuàng)新社會(huì)管理體制，提高社會(huì)管理的科學(xué)化水平，積極鼓勵(lì)社會(huì)主體參與到社會(huì)管理中來(lái)。

稱取4.95 g H3BO3溶于50 mL蒸餾水中，用1 mol/L NaOH調(diào)至pH 9.1.

(2) DMAB(4-二甲氨基苯甲醛)溶液

稱取10 g DMAB溶于100 mL的HCl與冰醋酸混合溶液中，其混合比例為：V(10 mol/L HCl)/V(冰醋酸)=12.5 %.此溶液可在2 ℃保存2個(gè)月，使用時(shí)需用冰醋酸稀釋10倍.

(3) 0.2 mol/L pH 5.0 醋酸-醋酸鈉緩沖液

取0.2 mol/L 醋酸溶液30 mL和0.2 mol/L醋酸鈉溶液70 mL，混勻.

1.4 幾丁質(zhì)酶及殼聚糖酶的提取方法

將10 mL 0.15 mol/L的NaCl溶液加入到1 g 培養(yǎng)基質(zhì)中，于4 ℃冰浴研磨,研磨成勻漿后用無(wú)菌濾紙過(guò)濾，濾液置于無(wú)菌離心管中，10 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液,用0.22 μm的細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾，即制成幾丁質(zhì)酶及殼聚糖酶的粗酶液.

1.5 幾丁質(zhì)酶的酶活力測(cè)定

根據(jù)Reissig[17]的方法，反應(yīng)體系的總體積為500 μL，包含125 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2 %的乙二醇幾丁質(zhì)(EGC)溶液，125 μL 0.2 mol/L pH 5.0 的醋酸-醋酸鈉緩沖液，100 μL H2O和150 μL酶液.30 ℃下水浴1 h,加入0.1 mL硼酸鈉溶液，沸水浴3 min，終止反應(yīng)移入冷水中，再加入3 mL DMAB溶液，混勻后37 ℃水浴20 min，移入冷水中后以蒸餾水為對(duì)照在544 nm處測(cè)吸光度值，根據(jù)N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其酶活力.

一個(gè)酶活力單位(U)定義為：每克培養(yǎng)基質(zhì)1 min內(nèi)催化分解產(chǎn)生1 nmol GlcNAc的還原糖所需的酶量(nmol GlcNAc·min-1·g-1w).

1.6 殼聚糖酶的酶活力測(cè)定

在微量離心管中加入250 μL 0.2 mol/L pH 5.0 的醋酸-醋酸鈉緩沖液，650 μL H2O，100 μL酶液和2 mg 脫乙酰幾丁質(zhì)酶檢測(cè)底物(AZCL-chitosan)，在直立式旋轉(zhuǎn)攪拌器上30 ℃反應(yīng)5 h，然后將混合物在10 000 r/min下冷凍離心5 min，取上清液,以蒸餾水為對(duì)照在660 nm處測(cè)吸光度值，根據(jù)N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其酶活力.

一個(gè)酶活力單位(U)定義為：每克培養(yǎng)基質(zhì)1 min內(nèi)催化分解1 μg AZCL-chitosan所需的酶量(μg Azcl-chitosan·min-1·g-1w).

1.7 粗酶液抑菌活性檢測(cè)

在10 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中分別接種大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、馬鈴薯環(huán)腐病菌和巨大芽孢桿菌，37 ℃、150 r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng).然后取150 μL的過(guò)夜細(xì)菌培養(yǎng)液加入到20 mL 44 ℃ 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5 %的瓊脂培養(yǎng)基中，輕輕混勻后即制成混菌平板.用孔徑為0.8 cm的無(wú)菌打孔器在凝固后的混菌平板上打孔，每個(gè)孔中注入150 μL的粗酶液，以同樣的混菌平板每個(gè)孔中注入150 μL蒸餾水為空白對(duì)照，30 ℃培養(yǎng)72 h后記錄抑菌情況.通過(guò)測(cè)量抑菌圈直徑的大小，檢測(cè)粗酶液抑菌活性.

2 結(jié)果與分析

2.1 9種不同品種蘑菇的培養(yǎng)基質(zhì)中幾丁質(zhì)酶的酶活力

提取9種不同品種蘑菇培養(yǎng)基質(zhì)的粗酶液，測(cè)定其幾丁質(zhì)酶的酶活力.研究發(fā)現(xiàn)：不同品種蘑菇的培養(yǎng)基質(zhì)中所含的幾丁質(zhì)酶酶活力差異很大.由圖1可看出：在從9種蘑菇的培養(yǎng)基質(zhì)中所提取出來(lái)的粗酶液中，幾丁質(zhì)酶酶活力由高到低分別為平菇33 U/g培養(yǎng)基質(zhì)，金針菇25.868 U/g培養(yǎng)基質(zhì)，猴頭菇21.131 U/g培養(yǎng)基質(zhì)，滑子蘑9.695 U/g培養(yǎng)基質(zhì)，真姬菇7.164 U/g培養(yǎng)基質(zhì)，黃傘菌菇5.881 U/g培養(yǎng)基質(zhì)，毛木耳4.086 U/g培養(yǎng)基質(zhì)，金頂側(cè)耳3.828 U/g培養(yǎng)基質(zhì)，大白樁菇1.392 U/g培養(yǎng)基質(zhì).可見(jiàn)，平菇、金針菇和猴頭菇的培養(yǎng)基質(zhì)中幾丁質(zhì)酶的酶活均較高，由此推斷在這3種蘑菇的培養(yǎng)基質(zhì)中幾丁質(zhì)酶的含量較高.

1 平菇 2 猴頭菇 3 真姬菇 4 黃傘菌菇 5 毛木耳 6 滑子蘑 7 大白樁菇 8 金針菇 9 金頂側(cè)耳

圖1 9種不同品種蘑菇的培養(yǎng)基質(zhì)中幾丁質(zhì)酶的酶活力

Fig.1 The activity of chitinase from 9 species of mushroom waste medium

2.2 9種不同品種蘑菇的培養(yǎng)基質(zhì)中殼聚糖酶的酶活力

用同樣的方法提取9種不同品種蘑菇的培養(yǎng)基質(zhì)的粗酶液，測(cè)定其殼聚糖酶的酶活力.研究發(fā)現(xiàn)：不同品種蘑菇的培養(yǎng)基質(zhì)中所含的殼聚糖酶酶活力的差異也很大.由圖2可看出：在從9種蘑菇的培養(yǎng)基質(zhì)中所提取出來(lái)的粗酶液中，殼聚糖酶酶活力由高到低分別為金針菇21.062 U/g培養(yǎng)基質(zhì)，猴頭菇19.48 U/g培養(yǎng)基質(zhì)，平菇8.095 U/g培養(yǎng)基質(zhì)，毛木耳3.416 U/g培養(yǎng)基質(zhì)，滑子蘑2.761 U/g培養(yǎng)基質(zhì)，黃傘菌菇1.942 U/g培養(yǎng)基質(zhì)，大白樁菇1.404 U/g培養(yǎng)基質(zhì)，真姬菇0.975 U/g培養(yǎng)基質(zhì)，而測(cè)得金頂側(cè)耳的培養(yǎng)基質(zhì)中殼聚糖酶的酶活為0，說(shuō)明其培養(yǎng)基質(zhì)中不含有殼聚糖酶.可見(jiàn)，除金針菇、猴頭菇和平菇的培養(yǎng)基質(zhì)中殼聚糖酶的酶活較高外，其余種類蘑菇的培養(yǎng)基質(zhì)中殼聚糖酶的酶活均比較低,由此可以推斷金針菇、猴頭菇和平菇這3種蘑菇的培養(yǎng)基質(zhì)中殼聚糖酶的含量較高，與幾丁質(zhì)酶的含量相吻合，故推斷這兩種酶在此3種蘑菇的培養(yǎng)基質(zhì)中是同時(shí)存在的.

1 平菇 2 猴頭菇 3 真姬菇 4 黃傘菌菇 5 毛木耳 6 滑子蘑 7 大白樁菇 8 金針菇 9 金頂側(cè)耳

2.3 粗酶液抑菌作用

以大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、番茄細(xì)菌性潰瘍病菌和巨大芽孢桿菌為病原菌，結(jié)合幾丁質(zhì)酶和殼聚糖酶活力的測(cè)定結(jié)果，選取幾丁質(zhì)酶及殼聚糖酶酶活均較高的培養(yǎng)基質(zhì)，即平菇、猴頭菇及金針菇的培養(yǎng)基質(zhì)的粗酶液進(jìn)行抑菌活性研究.

測(cè)量抑菌圈直徑見(jiàn)表1.可見(jiàn)，3種蘑菇培養(yǎng)基質(zhì)的粗酶液中平菇培養(yǎng)基質(zhì)的粗酶液對(duì)大腸桿菌沒(méi)有抑菌活性，但對(duì)其他3種病原菌均有抑菌活性，且對(duì)番茄細(xì)菌性潰瘍病菌和巨大芽孢桿菌的抑菌活性差異不大，其中對(duì)番茄細(xì)菌性潰瘍病菌的抑菌活性最高，抑菌圈直徑達(dá)2.02 cm；其次是巨大芽孢桿菌，抑菌圈直徑為1.92 cm；最后為蠟樣芽孢桿菌，抑菌圈直徑為1.15 cm.猴頭菇培養(yǎng)基質(zhì)的粗酶液對(duì)大腸桿菌也沒(méi)有抑菌活性，但對(duì)其他3種病原菌均有抑菌活性，且差異不大，其中對(duì)巨大芽孢桿菌的抑菌活性最高，抑菌圈直徑達(dá)2.20 cm；其次是番茄細(xì)菌性潰瘍病菌，抑菌圈直徑為2.03 cm；最后為蠟樣芽孢桿菌，抑菌圈直徑為1.85 cm.金針菇培養(yǎng)基質(zhì)的粗酶液對(duì)4種病原菌均有抑菌活性，除對(duì)大腸桿菌抑制活性較小外，對(duì)其余3種病原菌的抑菌活性差異不大，其中對(duì)巨大芽孢桿菌的抑菌活性最高，抑菌圈直徑達(dá)2.18 cm；其次是蠟樣芽孢桿菌，抑菌圈直徑為2.06 cm；再次是番茄細(xì)菌性潰瘍病菌，抑菌圈直徑為1.93 cm，最后是大腸桿菌，抑菌圈直徑為1.31 cm.

通過(guò)以上結(jié)果可以看出：對(duì)于大腸桿菌，只有金針菇培養(yǎng)基質(zhì)的粗酶液對(duì)其有輕微的抑制活性，而平菇和猴頭菇的培養(yǎng)基質(zhì)的粗酶液對(duì)其均沒(méi)有抑制活性；對(duì)于蠟樣芽孢桿菌，金針菇培養(yǎng)基質(zhì)的粗酶液對(duì)其抑制活性最強(qiáng)，猴頭菇次之，平菇最弱；對(duì)于番茄細(xì)菌性潰瘍病菌，猴頭菇培養(yǎng)基質(zhì)的粗酶液對(duì)其抑制活性最強(qiáng)，平菇次之，金針菇最弱；對(duì)于巨大芽孢桿菌，猴頭菇培養(yǎng)基質(zhì)的粗酶液對(duì)其抑制活性最強(qiáng)，金針菇次之，平菇最弱.

表1 不同品種蘑菇培養(yǎng)基質(zhì)粗酶液的抑菌活性

3 結(jié) 論

研究選取了9種不同品種蘑菇的培養(yǎng)基質(zhì)，從中提取粗酶液后對(duì)其酶活進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：相同品種蘑菇的培養(yǎng)基質(zhì)中幾丁質(zhì)酶和殼聚糖酶的活性不同，其中幾丁質(zhì)酶活性最高的是平菇的培養(yǎng)基質(zhì)，酶活達(dá)33 U/g培養(yǎng)基質(zhì)；殼聚糖酶活性最高的是金針菇的培養(yǎng)基質(zhì)，酶活達(dá)21.062 U/g培養(yǎng)基質(zhì).

結(jié)合酶活檢測(cè)的結(jié)果，選取幾丁質(zhì)酶和殼聚糖酶活性均較高的3種蘑菇的培養(yǎng)基質(zhì)，分別為平菇、猴頭菇和金針菇的培養(yǎng)基質(zhì)，提取粗酶液后進(jìn)行抑菌活性研究.結(jié)果表明3種粗酶液對(duì)蠟樣芽孢桿菌、番茄細(xì)菌性潰瘍病菌和巨大芽孢桿菌均有抑制活性，除平菇培養(yǎng)基質(zhì)的粗酶液對(duì)蠟樣芽孢桿菌的抑制活性較小外，其余的抑菌活性均差異不大，抑菌圈直徑均在2 cm左右；3種蘑菇的培養(yǎng)基質(zhì)中，只有金針菇培養(yǎng)基質(zhì)的粗酶液對(duì)大腸桿菌有抑制活性且較小外，其余2種均沒(méi)有，說(shuō)明這3種蘑菇培養(yǎng)基質(zhì)的粗酶液對(duì)大腸桿菌的抑制效果均不好，但對(duì)其他3種病原菌的抑制效果均很明顯.

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，蘑菇的培養(yǎng)基質(zhì)為廢棄物，人們只能用它燒火或直接丟棄，對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重污染且產(chǎn)生了巨大浪費(fèi).本研究從這些廢棄物中提取出了應(yīng)用廣泛的幾丁質(zhì)酶及殼聚糖酶，起到廢物回收利用的作用，減輕了環(huán)境的污染，對(duì)酶的研究及環(huán)境保護(hù)具有重要意義.

幾丁質(zhì)酶及殼聚糖酶不僅可以降解自然界中的幾丁質(zhì)和殼聚糖，產(chǎn)生許多有用的產(chǎn)物,而且有些幾丁質(zhì)酶和殼聚糖酶自身還兼具溶菌酶活性,可分解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖,從而具有抗菌作用,對(duì)細(xì)菌、真菌、昆蟲(chóng)、螨等表現(xiàn)出一定抗性[18-19].目前，雖然對(duì)幾丁質(zhì)酶及殼聚糖酶的研究報(bào)道較多，但大多是從動(dòng)植物及微生物中提取的，而本文是從蘑菇的廢棄培養(yǎng)基質(zhì)中提取，具有一定的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值.但由于其多樣性、調(diào)控機(jī)理的復(fù)雜性，再加上從自然界中分離到的酶活性不是太高，因此，距離工業(yè)應(yīng)用的要求還有一定距離.今后應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)幾丁質(zhì)酶及殼聚糖酶的基礎(chǔ)理論研究，并利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)對(duì)現(xiàn)有的幾丁質(zhì)酶及殼聚糖酶進(jìn)行定向改造或篩選出新的活性更強(qiáng)的幾丁質(zhì)酶，以適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的需要.

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antimicrobial activity

Activity of Extracellular Enzyme from Different Species of Mushroom Waste Media

GUAN Li-jie， TIAN Lu

(Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang 110142, China)

This experiment extracted chitinase and chitosanase from 9 species of mushroom waste media and then determined their enzyme activity.The research showed that the chitinase activity of waste medium of Pleurotus ostreatus could reach to 33 U/g waste medium,which was the best;the chitosanase activity of waste medium of Flammulina velutipes could reach to 21.062 U/g waste medium,which was the best.According to the result,3 species of mushroom waste media whose chitinase and chitosanase activity were higher were screened to assay their antimicrobial activity.The research showed that this 3 species of crude extract of chitinase and chitosanase from waste medium all had inhibitory activity against Bacillus cereus,Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis and Bacillus megaterium,which was the best.

mushroom waste medium； chitinase； chitosanase； determination of enzyme activity；

2013-11-06

關(guān)麗杰(1968-)，女(滿族)，遼寧沈陽(yáng)人，副教授，博士，主要從事生物農(nóng)藥及植物病理學(xué)的研究.

2095-2198(2015)02-0118-05

10.3969/j.issn.2095-2198.2015.02.005

Q556+.2

A