miRNA 與大腸癌關(guān)系的研究進展

(大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 消化科，遼寧 大連116011)

徐夢杳，劉麗娜，李春艷

大腸癌是最常見的消化道腫瘤之一，嚴重影響人類健康。近年來，隨著人們生活水平的提高及飲食習慣的改變，大腸癌在中國的發(fā)病率正在逐年攀升。大腸癌早期多無明顯癥狀，許多患者在確診時已是晚期，而大腸癌患者的生存和預后取決于腫瘤的檢出時間，早期診斷對于改善預后有重要作用。

目前大腸癌篩查的方法主要有糞便隱血試驗和結(jié)腸鏡檢查。糞便隱血試驗盡管減少了結(jié)腸癌相關(guān)的死亡率，卻缺乏相應的敏感性和特異性［1］。結(jié)腸鏡檢查是大腸癌診斷的金標準，但因結(jié)腸鏡為有創(chuàng)檢查，病人不適反應多，依從性差，且費用高，故不能用作大范圍篩查。尋找新的具有高敏感性和高特異性的腫瘤標記物對結(jié)腸癌的早期診斷和病情監(jiān)測具有極其重要的意義。

大腸癌的發(fā)生是一個多因素、多階段和多基因的改變協(xié)同作用的過程，癌基因和抑癌基因的表達失調(diào)是結(jié)腸癌發(fā)生的分子基礎(chǔ)。微小RNAs (microRNAs 或miRNAs)是一類內(nèi)源性小片段非編碼的RNA 調(diào)控因子，可作為腫瘤抑制基因或癌基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。近年來的研究顯示，miRNA是有潛力的生物標志物［2］。越來越多的研究表明，miRNA 與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、診斷、轉(zhuǎn)移有很大關(guān)系，miRNA 有望成為新的生物學標志物和治療靶點。近年來，miRNA 與大腸癌的關(guān)系引起越來越多學者的關(guān)注，成為當前研究的熱點。

1 miRNA 在大腸癌中的表達

研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNAs 在大腸癌中表達。早在2003年，Michael 等［3］首先發(fā)現(xiàn)，miRNA 在大腸癌組織與正常結(jié)腸黏膜組織中的表達存在差異性，并明確miR-143 和miR -145 在大腸癌及癌前病變組織中的表達下調(diào)，表明它們或許是抑癌miRNA，抑癌miRNA 的缺失可能導致癌基因過度活躍，從而引起大腸癌的發(fā)生。Arndt 等［4］研究表明，與正常結(jié)腸黏膜組織相比，大腸癌有37 種miRNAs 具有差異性，其中一些miRNAs 的表達改變(包括miR-133a 表達缺失和miR-224 表達增加)與大腸癌的進展相關(guān)。另一研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，大腸癌患者血清中有6 種miRNA(miR-18a、miR-19、miR -19b、miR -15b、miR -29a、miR -335)顯著升高［5］。Bandrés 等［6］通過RT - PCR 技術(shù)對大腸癌和癌旁組織的156 個miRNA 的表達量進行了檢測，確定了13 個異常表達的miRNA，其中最顯著的包括miR -31、miR -96、miR -135b、miR -183、miR-133b、miR-145，前三者的表達無論在組織水平還是細胞水平均上調(diào)，后兩者的表達下調(diào)。其中，miR-31 的表達水平還跟大腸癌的臨床分期密切相關(guān)。后來的學者應用新的篩選工具發(fā)現(xiàn)了更多的miRNA，目前已發(fā)現(xiàn)有超過100 個miRNA 和大腸癌有關(guān)［7］。

2 miRNA 在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用

大腸癌的發(fā)生受到遺傳和環(huán)境因素的作用，涉及癌基因的上調(diào)與抑癌基因的下調(diào)或失活，整個過程表現(xiàn)為多基因、多步驟的協(xié)同累積作用。鑒于miRNA 對基因表達的廣泛影響，miRNA 與大腸癌的發(fā)生密切相關(guān)。大量研究表明，在癌組織中失調(diào)的miRNA 通過多種機制，包括染色體畸變，如擴增、缺失、易位［8］、表觀遺傳因素如DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶［9］、有缺陷的miRNA 加工機制［10］等，促成癌細胞異常的生物學行為，根據(jù)它們在惡性腫瘤發(fā)展中的角色，miRNA 在大腸癌中可能起著癌基因或抑癌基因的作用。

2.1 miRNA 參與大腸癌細胞的生長、凋亡

許多癌基因通過促進細胞增殖及G1期向S 期過渡、逃避凋亡等方式發(fā)揮作用。以這類基因為靶標的miRNA 在癌組織中通常上調(diào)，從而促進腫瘤的形成。如miRNA 家族miR-221/222 已經(jīng)被證實為促癌基因，在大腸癌組織中表達明顯上調(diào)，其靶標是細胞周期調(diào)節(jié)蛋白p27kip1［11］。而許多抑癌基因如miR-34 家族在結(jié)腸癌組織細胞中調(diào)控著下游靶標抗凋亡家族蛋白Bcl-2 的表達，Bcl-2 家族通過阻止線粒體細胞色素C 的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用。抑癌基因miR -34 下調(diào)引起抗凋亡Bcl -2 蛋白的過度表達，參與大腸癌的發(fā)生［12］。

2.2 miRNA 參與大腸癌侵襲與轉(zhuǎn)移

侵襲與轉(zhuǎn)移是腫瘤最顯著的特點，同時也是一個復雜的過程，涉及多種癌基因、抑癌基因、黏附相關(guān)分子、信號轉(zhuǎn)導基因、蛋白水解酶、細胞因子與調(diào)節(jié)因子等。目前研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 通過以下機制參與大腸癌的侵襲與轉(zhuǎn)移:(1)調(diào)節(jié)大腸癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)及黏附力。Kong 等［13］證實miR -155 的表達上調(diào)可增加腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移力，其機制可能是miR-155 在TGF-13/Smad4 信號通路中通過下調(diào)其靶基因RhoA 的表達，誘導EMT 的發(fā)生，促進大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移。(2)調(diào)控癌基因、抑癌基因及大腸癌轉(zhuǎn)移基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，miR -21 與程序性死亡因子4 蛋白(PDCD4)基因在結(jié)腸癌組織中的表達呈負相關(guān)，其中PDCD4 蛋白的表達水平顯著低于正常結(jié)腸黏膜組織［14］。這說明miR -21 可負向調(diào)控PDCD4 表達，從而導致大腸癌細胞侵襲、血管浸潤和轉(zhuǎn)移的發(fā)生。(3)調(diào)節(jié)大腸癌細胞DNA甲基化模式。如miR-342 靶向抑制DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTl)的表達，抑制細胞增殖［15］。(4)調(diào)節(jié)大腸癌血管的生成。如miR -107 簇基因族可通過抑制低氧誘導因子的表達，間接促進血管內(nèi)皮生長因子的表達，從而促進腫瘤血管的生成，導致大腸癌細胞發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移［16］。

3 miRNA 在大腸癌診斷中的作用

研究表明，除了在大腸癌組織中可檢測到miRNA 表達外，患者的血漿或血清中也可檢測到miRNA，miRNA 有可能成為新的腫瘤診斷候選分子標記物。源于腫瘤的miRNA 在血液中避開了內(nèi)源性核糖核酸酶的活性，具有相當穩(wěn)定的存在形式，這些腫瘤miRNA 可在福爾馬林固定標本和患者的血液、體液標本中穩(wěn)定表達，且目前包括熒光定量qRT -PCR 在內(nèi)的檢測手段使得miRNA 的檢測方便易行。因此，miRNA 作為新的腫瘤標記物，對腫瘤的診斷將起到十分重要的作用［17］。

健康人血液中的100 多種miRNA 已得到確認，其表達譜與大腸癌患者的幾種腫瘤特異性miRNA表達譜有明顯的差異。有學者通過與健康對照組比較，發(fā)現(xiàn)大腸癌患者血漿miRNA17 -3p 和miRNA-92a 的表達水平顯著升高，且這兩種miRNAs 的水平在手術(shù)切除腫瘤組織后顯著下降［18］，故其有望作為大腸癌患者診斷及術(shù)后監(jiān)測指標。miR -29a 是大腸癌的另一診斷標志物，它被證實可以區(qū)別出正常對照組與大腸癌及腺瘤，敏感性分別為69% 和62.25%，特異性分別為89.1%和84.7%，進一步實驗表明，與腺瘤組相比較，miR -29a 在大腸癌患者血漿中的水平顯著提高，其表達與TNM 分期相關(guān)［19］。隨著對miRNA 的深入研究，根據(jù)血液中檢測的這種獨特的miRNA 表達譜，可對具有中等或高風險的腸息肉患者進行監(jiān)測，從而減少對高?；颊咝心c鏡檢查的頻率。

有研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌患者血清中存在69 種特異性miRNA;同時發(fā)現(xiàn)一組由14 種血清miRNA 組成的獨特表達譜在大腸癌中表達，而在肺癌中未發(fā)現(xiàn)其表達［20］。每種腫瘤都有特異的miRNA 的表達譜，進一步說明其與腫瘤分類和復發(fā)預測的關(guān)系，但miRNA 仍具有多種腫瘤重疊表達的特點，故只依據(jù)單一的miRNA 還不足以做出精確診斷，仍需在血液方面建立與健康人年齡相匹配的miRNA 表達譜，根據(jù)這些特異的miRNA 表達譜，對大腸癌高風險患者進行監(jiān)測與診斷。

4 miRNA 與大腸癌治療反應的關(guān)系

miRNA 是內(nèi)源性產(chǎn)生且具有對機體毒性小的特點，在臨床治療上有較好的應用前景。由于目前發(fā)現(xiàn)的miRNA 在腫瘤中表達存在上調(diào)與下調(diào)，應用miRNA 治療腫瘤主要有兩種策略:一類是針對于miRNA 表達上調(diào)的疾病，在治療中需要目標miRNA與注射的互補RNA 序列相結(jié)合而失去活性、保持沉默，使疾病相關(guān)miRNA 下調(diào);另一類是包括許多腫瘤在內(nèi)的與miRNA 下調(diào)相關(guān)的疾病，在miRNA 類似物作用下使miRNA 上調(diào)，從而達到治療的目的。

在大腸癌患者治療中，對于那些上調(diào)的miRNA，目前公認的治療方法是使miRNA 沉默，主要是應用miRNA 寡核苷酸(AMO)。在生理條件下，AMO 可以利用所具有的miRNA 的互補序列與miRNA 緊密結(jié)合，這種結(jié)合較穩(wěn)定，不容易解離，從而可以有效地降低miRNA 的活性。

針對在腫瘤中下調(diào)的miRNA，轉(zhuǎn)染pre -miRNA 以糾正miRNA 的表達下調(diào)，從而抑制腫瘤細胞的增殖或誘導凋亡。Vidic 等［21］通過體外實驗，電轉(zhuǎn)染特異的miRNA，靶向作用于K -ras 突變體，可以降低腫瘤細胞的存活率，未見不良反應。Liu等［22］對81 個大腸癌組織及配對正常組織中的miR-195 進行測定，顯示其在癌組織中的水平顯著下調(diào)，進一步將miR -195 體外轉(zhuǎn)染大腸癌細胞系HT29 后，結(jié)果顯示促進腫瘤細胞凋亡。Ruzzo 等［23］用定量RT - PCR 技術(shù)在結(jié)腸癌組織和細胞系DLD-1、SW480、COLO -201 中均檢測到let -7 表達水平明顯降低，將let -7a -1 前體轉(zhuǎn)染入結(jié)腸癌細胞系DLD-1 和SW480，可觀察到劑量依賴性生長抑制作用。

miRNA 也同樣影響著化療藥物的抗腫瘤作用。體外和體內(nèi)試驗研究表明miR -129 可增加5 -Fu的細胞毒性效應，從而提高腫瘤對5 - Fu 的敏感性［24］。miR-143 在結(jié)腸癌中表達下調(diào)，有研究發(fā)現(xiàn)，通過在結(jié)腸癌細胞中上調(diào)miR -143 的表達，間接通過Bcl-2 等蛋白的下調(diào)而增加了5 -Fu 的細胞毒性，從而達到更好的化療效果［25］。盡管有這些研究成果，還需要更多的研究去發(fā)現(xiàn)對大腸癌的治療更有幫助的miRNAs。

5 miRNA 在大腸癌預后判斷中的作用

越來越多的證據(jù)顯示對某些特殊的腫瘤來說，miRNA 的表達方式是獨一無二的，故被認為是一種潛在的癌癥預后評估標志物。不同miRNA 的表達，有助于大腸癌的預后判斷。一項對按國際抗癌聯(lián)盟(UICC)標準治療的大腸癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，miR -152 和miR-148 的表達水平與大腸癌患者的預后相關(guān)，二者表達水平越低，腫瘤病灶越大且分化程度較低［26］。Schetter 等［27］的研究中比較了兩組Ⅱ期結(jié)腸癌及毗鄰正常組織的miRNA 表達譜，發(fā)現(xiàn)37個miRNA 存在表達差異，其中miR -20、miR -21、miR -106、miR -181 和miR -203 可能與預后相關(guān)，并隨著其在腫瘤組織中的高表達，患者存活率降低。另有研究顯示，miR -320 和miR -498 表達水平高的Ⅱ期結(jié)腸癌患者比那些低表達的患者無復發(fā)生存期要短［28］。

此外，還有許多研究顯示miRNA 表達異常與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，如miR-129 和miR -137 在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者中表達不同，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的表達量高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者［29］。Alina 等［30］對110 例有復發(fā)和無復發(fā)的I 期和Ⅱ期大腸癌患者研究發(fā)現(xiàn)，在大腸癌I 期，所檢測的903 種miRNA 在大腸癌組織中的表達無論是在有復發(fā)組還是無復發(fā)組均沒有差異;而在大腸癌Ⅱ期，miRNA-29a 在大腸癌組織中表達下調(diào)者預后更好，生存時間更長。上述研究表明，多種miRNA在大腸癌組織的表達與腫瘤的生長、淋巴結(jié)和器官的轉(zhuǎn)移及病人的生存期有關(guān)，miRNA 有望成為大腸癌預后判斷的標志物。

6 小 結(jié)

miRNA 在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程中均起重要作用，進一步明確miRNA 的作用機制將有助于了解大腸癌發(fā)生的分子生物學過程，為大腸癌的診斷、治療及預后提供新的思路。血清miRNA 作為分子標志物，與腫瘤的生物學機制密切相關(guān)，具有無創(chuàng)、簡單、便捷、易于普查等特點，可能有助于改進疾病診斷，增加對預后估計的準確性，因而擁有廣闊的發(fā)展前景。然而，miRNA 與其靶基因的相互作用是一個復雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，既往研究結(jié)果亦顯示，一個miRNA 可以調(diào)節(jié)多個靶基因，一個靶基因又可以受多個miRNA 調(diào)節(jié)，二者關(guān)系錯綜復雜，全面研究miRNA 的功能及構(gòu)建miRNA 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分困難，有待于進一步深入研究。

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