中藥頭花蓼對幽門螺桿菌CagA及VacA表達的影響*

張 雁， 張 姝， 羅昭遜， 孫朝琴， 渠 巍， 熊麗娟， 莫 非**

(1.貴陽醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院， 貴州 貴陽 550004；2. 貴陽醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院 臨床檢驗教研室， 貴州 貴陽 550004；3.貴陽市婦幼保健院 檢驗科， 貴州 貴陽 550003；4.貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 檢驗科， 貴州 貴陽 550004)

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中藥頭花蓼對幽門螺桿菌CagA及VacA表達的影響*

張 雁1， 張 姝1， 羅昭遜1， 孫朝琴2， 渠 巍3， 熊麗娟4， 莫 非2**

(1.貴陽醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院， 貴州 貴陽 550004；2. 貴陽醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院 臨床檢驗教研室， 貴州 貴陽 550004；3.貴陽市婦幼保健院 檢驗科， 貴州 貴陽 550003；4.貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 檢驗科， 貴州 貴陽 550004)

目的： 觀察中藥頭花蓼對幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)細胞毒素相關(guān)蛋白(cytotoxin-associated protein,CagA)和空泡毒素(vacuolating cytotoxin,VacA)表達的影響。方法：H.pyloriATCC700392接種于含頭花蓼的哥倫比亞血平板上為實驗組，同批未經(jīng)藥物作用的H.pyloriATCC700392為對照組,分別提取兩組細菌的RNA和蛋白，用Real-time PCR定量檢測頭花蓼作用后cagA和vacA的mRNA表達， ELISA檢測蛋白表達量。結(jié)果： 經(jīng)頭花蓼作用的實驗組與對照組相比，H.pylori的CagA和VacA蛋白表達水平分別降低了36.4%、55.1%(P<0.05)，cagA和vacA的mRNA表達水平分別降低了69%、51%(P<0.05)。結(jié)論: 頭花蓼可能通過下調(diào)cagA和vacA的mRNA和蛋白的表達來發(fā)揮其對H.pylori的抑制作用。

頭花蓼；螺桿菌，幽門；細胞毒素相關(guān)蛋白；空泡毒素

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)感染在世界范圍內(nèi)廣泛存在，發(fā)展中國家感染率高達90%，在我國成人H.pylori感染率超過70%。H.pylori的細胞毒素相關(guān)基因(cytotoxin associated gene,cagA)和空泡毒素基因(vaculating toxin gene,vacA)及其表達產(chǎn)物與H.pylori感染的臨床發(fā)展有密切關(guān)系。cagA是H.pylori的重要毒力因子，與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等疾病均有密切關(guān)系[3-4]。vacA的基因亞型及其表達水平與菌株的致病性有密切的關(guān)系，目前cagA和vacA基因及其蛋白已成為H.pylori致病機制中的研究熱點。中藥頭花蓼是貴州苗族民間常用的一種中藥材，目前已通過大量的體內(nèi)外實驗證實其具有抗H.pylori的作用，本實驗旨在檢測頭花蓼對H.pylori的cagA和vacA基因的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達的影響，探討頭花蓼對H.pylori的主要毒性因子的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

苗藥頭花蓼浸膏粉，棕色粉末，批號20010401，生藥含量為8.72 g/g，由貴州威門藥業(yè)股份有限公司提供；幽門螺桿菌ATCC700392國際標準測序株，購自ATCC(美國菌種保藏中心)，由本課題組保存。哥倫比亞血瓊脂粉、腦心浸液粉(OXOID)，脫纖維滅菌羊血(廣州蕊特生物科技有限公司)，萬古霉素、兩性霉素、多粘菌素B、TMP、冷凍高速離心機(Sigma)，觸酶、氧化酶(梅里埃公司)；蛋白提取試劑、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、Lysozme、DNase、DTT、PMSF(上海生工工程股份有限公司)，BCA工作試劑(碧云天有限公司)，CagA ELISA KIT、VacA ELISA KIT(大連寶生物公司)，TE緩沖液、Trizol(Solarbio)，三氣培養(yǎng)箱(Thermo)，酶標儀(BIORAD)，熒光定量PCR儀(德國ROCHE)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌培養(yǎng)與鑒定

從-80 ℃冰箱中取出幽門螺桿菌ATCC 700392，室溫溶解后傾倒于哥倫比亞血瓊脂平皿內(nèi)，均勻涂布，37 ℃三氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h(5% O2、10% CO2、85% N2，相對濕度95%以上 )，觀察細菌生長情況，穩(wěn)定傳代3次后進行革蘭染色、尿素酶、觸酶和氧化酶的鑒定。

1.2.2 實驗分組

實驗組：生長良好的H.pyloriATCC700392接種于含1/2 最低抑菌濃度(MIC)頭花蓼含藥平板上連續(xù)培養(yǎng)3代，72 h/代；對照組：同批未經(jīng)藥物作用的H.pyloriATCC700392，連續(xù)培養(yǎng)3代，72 h/代。

1.2.3 CagA和VacA蛋白檢測

H.pylori蛋白的提取及定量 將生長良好的每組細菌刮取于離心管中離心后收集細菌沉淀，按每100 mg的菌體加入0.5 mL的提取試劑，吹打均勻，將其放置搖床上室溫震蕩20 min再次離心后收集上清液；再加入提取試劑重復(fù)提取一次，將兩次提取的上清液合并，配制濃度梯度的標準品，根據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度。ELISA按CagA ELISA KIT、VacA ELISA KIT說明書取原倍標準品依次倍比稀釋，同時將樣品稀釋2倍，分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔進行操作，450 nm波長測量各孔的吸光度(D值)；以樣品吸光度值為縱坐標，濃度為橫坐標，用Excel表格制作標準曲線；實驗重復(fù)3次。

1.2.4cagA和vacA基因檢測

1.2.4.1 提取mRNA 將兩組標本用腦心浸液肉湯調(diào)細菌懸液至108CFU/mL，取標本1 mL離心，去上清后用Trizol法提取標本的mRNA，室溫干燥5 min加入20 μL TE緩沖液，充分溶解mRNA；取2 μL mRNA加入98 μL TE緩沖液稀釋50倍后在紫外分光光度儀下檢測RNA濃度及D260/D280比值。

1.2.4.2 Real-time PCR 根據(jù)TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，所有操作均在冰上進行。應(yīng)用SYBR ?Premix Ex TaqTMII試劑盒在ROCHE LightCycler480熒光定量PCR儀上檢測，以對照組和實驗組的cDNA為模板，分別擴增內(nèi)參基因gryB( DNA旋轉(zhuǎn)酶B亞單位 )與靶基因cagA、vacA。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成(表1)。

表1 PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for each genes

1.3 統(tǒng)計處理

2 結(jié)果

2.1H.pylori菌株的培養(yǎng)與鑒定

H.pylori國際標準測序株 ATCC 700392 在普通哥倫比亞血平皿上培養(yǎng)72 h后，菌落細小呈針尖狀、無色半透明、光滑濕潤。涂片革蘭氏染色后鏡檢，細菌為螺旋狀、S形或弧形的革蘭氏陰性菌，生化鑒定試驗?zāi)蛩孛浮⒀趸?、觸酶均為陽性(圖1)。

2.2 頭花蓼對H.pylori的CagA和VacA蛋白水平的影響

經(jīng)頭花蓼作用后CagA和VacA的蛋白表達水平明顯降低，與對照組相比，CagA、VacA 表達量分別降低了36.4%、55.1%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

注：A為油鏡下H.pylori形態(tài)， B為H.pylori 觸酶試驗，C為H.pylori 氧化酶試驗，D為H.pylori尿素酶試驗

表2 頭花蓼作用后CagA和VacA的蛋白表達量Tab.2 H. pylori CagA and VacA protein expression in Polygonum captitatum

(1)與對照組相比，P<0.05

2.3 頭花蓼對H.pylori的cagA和vacAmRNA水平的影響

Real-timePCR顯示gryB和cagA、vacA融解曲線均為單峰，表明PCR擴增為特異性擴增。經(jīng)頭花蓼作用后cagA和vacA的mRNA表達水平下降，與對照組相比，cagA、vacA表達量分別降低了69%和51%(P<0.05)。見表3。

表3 頭花蓼作用后 cagA和vacA 基因表達Tab.3 H. pylori cagA and vacA gene expression in Polygonum captitatum

(1)與對照組相比，P<0.05

3 討論

頭花蓼具有清熱利濕、解毒止痛、和血散瘀、利尿通淋等功效，其主要成分黃酮類化合物(FVD)有調(diào)節(jié)多藥耐藥、抗腫瘤、抗炎、抗微生物等多種活性；頭花蓼的另一種主要成分為沒食子酸，可能通過特異性地凝固細菌蛋白、破壞細菌細胞膜結(jié)構(gòu)等，從而改變細菌生理狀態(tài)達到抗菌作用。本研究小組體外抗菌活性實驗研究證實頭花蓼水提物對幽門螺桿菌ATCC700392有較好的抗菌活性，MIC為4 g/L。與已研究的傳統(tǒng)單味中藥比較發(fā)現(xiàn)，頭花蓼抗H.pylori的活性優(yōu)于田基黃提取物、苦參、金銀花等。

CagA陽性菌與胃炎的嚴重程度有關(guān)聯(lián)，與胃癌的風(fēng)險高度相關(guān)，在胃炎發(fā)展成胃癌過程中起著重要作用[7-8]。CagA被注入胃黏膜細胞內(nèi)，通過多個途徑從多方面引起黏膜細胞的損傷。比如細胞極性改變，骨架重組，它還能使細胞從G1期轉(zhuǎn)向S期，引起細胞增殖異常、轉(zhuǎn)化等[9]。VacA可使胃黏膜上皮發(fā)生空泡樣變性，壞死；此外，VacA還能特異地抑制細胞的增殖，使胃潰瘍的愈合延遲，并使其愈合后的斑痕較差[10]。有研究顯示CagA和VacA具有高度相似的分子系統(tǒng)發(fā)育樹，并且所有H.pylori菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹中具有相同的分布特點，因此cagA和vacA基因可能具有共進化的遺傳關(guān)系[11]。

本實驗結(jié)果顯示頭花蓼作用H.pylori后cagA和vacA在基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平方面均發(fā)生顯著下調(diào)(P<0.05)，但cagA和vacA的mRNA表達水平比CagA和VacA的蛋白表達水平下調(diào)幅度明顯。推測中藥頭花蓼抑制H.pylori生長的機制可能是通過下調(diào)其cagA和vacA的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，由轉(zhuǎn)錄下調(diào)而引起CagA和VacA的蛋白水平下調(diào)，從而達到對H.pylori進行抑制，也可能是頭花蓼分別下調(diào)cagA、vacA的基因轉(zhuǎn)錄和CagA、VacA的蛋白翻譯過程，從兩個調(diào)控水平分別對H.pylori起抑菌作用。H.pylori感染后能引起慢性胃炎，有部分感染者終生攜帶該菌，細菌的毒力和宿主的免疫力處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)。中藥頭花蓼下調(diào)H.pylori主要毒力因子CagA和VacA的表達，在細菌和宿主的平衡中間接地支持宿主一方，雖不能徹底消滅細菌，但對抗菌、減輕細菌對宿主的損害起到重要作用。目前的研究多以西藥體內(nèi)抑制H.pylori為主，藥物對H.pylori主要毒力因子的抑制方面探索較少，而用中藥去抑制H.pylori的兩個主要毒力因子CagA和VacA的研究未見報道，因此該研究或能夠為中藥抗H.pylori的機理提供了有價值的線索。

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(2015-03-02收稿，2015-05-01修回)

中文編輯： 周 凌；英文編輯： 劉 華

Effect of Chinese MedicinePolygonumcapitatumon Expression ofHelicobacterpyloriCagA and VacA

ZHANG Yan1, ZHANG Shu1, LUO Zhaoxun1, SUN Chaoqin2, QU Wei3, XIONG Lijuan4, MO Fei2

(1.CollegeofLaboratory,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,CollegeofLaboratory,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.DepartmentofLaboratory,GuiyangMaternalandChildHealth-careHospital,Guiyang550004,Guizhou,China; 4.Departmentoflaboratory,SecondHospitalAffiliatedtoGuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To study the effect of traditional Chinese medicinePolygonumcapitatumon expression ofcagAandvacAofHelicobacterpylori(H.pylori). Methods:H.pyloriATCC700392 vaccinated in Colombia blood AGAR containingPolygonumcaptitatumwas defined as experimental group, while the same batchH.pyloriATCC700392 withoutPolygonumcaptitatumas control group. After continuous and stable culture, bacterial RNA and protein were extracted respectively in two groups. Real-Time PCR was adopted to detect the mRNA expression of cagA and vacA, and ELISA was used to detect the protein expression of CagA and VacA. Results: Compared with control group, the protein expression of CagA and VacA in experimental group decreased 36.4% and 55.1%, respectively(P<0.05), while mRNA expression levels also decreased significantly, 69% and 51%, respectively(P<0.05). Conclusion:Polygonumcaptitatumpossibly exerts its inhibitory effect onH.pylorithrough inhibiting the expression of cagA and vacA.

Polygonumcapitatum;Helicobacterpylori; cytotoxin-associated protein; vacuolating cytotoxin

高等學(xué)校特色專業(yè)建設(shè)項目(2010)15； 貴州省科技廳、貴陽醫(yī)學(xué)院聯(lián)合基金資助項目黔科合LG(2012)054號和黔科合LG(2012)012號； 貴州省科技計劃課題黔科合J字(2014)2027號； 貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院博士基金(2014)； 貴州省2014年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201410660014)； 2014年地方高校國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201410660014)

時間：2015-05-21

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150521.1248.016.html

R378; R961

A

1000-2707(2015)05-0455-04

**通信作者 E-mail:354406804@qq.com