牦牛Ihh基因組織表達(dá)分析、SNP檢測(cè)及其基因型組合與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析

李天科，趙娟花，裴 杰，梁春年，郭 憲，秦 文，閻 萍*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050;2.甘肅省牦牛繁育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050； 3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070)

牦牛Ihh基因組織表達(dá)分析、SNP檢測(cè)及其基因型組合與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析

李天科1,2,3，趙娟花1,2，裴 杰1,2，梁春年1,2，郭 憲1,2，秦 文1,2,3，閻 萍1,2,3*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050;2.甘肅省牦牛繁育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050； 3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070)

為了研究牦牛Ihh基因多態(tài)位點(diǎn)基因型組合與生產(chǎn)性狀間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)與牦牛生產(chǎn)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，同時(shí)進(jìn)一步研究Ihh基因在牦牛和黃牛各個(gè)組織的分布和表達(dá)，試驗(yàn)采用高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(High resolution melting curve，HRM)進(jìn)行基因型分型和統(tǒng)計(jì)等位基因頻率，同時(shí)，運(yùn)用熒光定量PCR 分析Ihh基因在牦牛和黃牛不同器官的表達(dá)差異。試驗(yàn)結(jié)果表明，Ihh基因在牦牛和黃牛的所有組織中均表達(dá)。然后采用SHEsis和PHASE軟件對(duì)Ihh基因多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行配對(duì)連鎖不平衡和單倍型分析，采用SPSS17.0進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)單倍型組合與生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)性分析。結(jié)果檢測(cè)到牦牛Ihh基因外顯子3的 2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)5855(C/T)和6383(G/A)。群體遺傳學(xué)分析顯示，2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)均表現(xiàn)為高度多態(tài)(PIC>0.25)；χ2檢驗(yàn)表明，甘南牦牛和大通牦牛群體在兩個(gè)突變位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，而天祝牦牛在2個(gè)突變位點(diǎn)處未達(dá)到Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)；多態(tài)位點(diǎn)配對(duì)連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)突變位點(diǎn)之間存在強(qiáng)連鎖平衡，有4種單倍型組合；基因型組合主要發(fā)現(xiàn)了3種。關(guān)聯(lián)分析表明，Ihh基因2個(gè)突變位點(diǎn)的3種基因型組合對(duì)牦牛體斜長(zhǎng)、體高、胸圍、管?chē)腕w重有顯著差異(P<0.05)，具有CTGA基因型組合的牦牛個(gè)體在體斜長(zhǎng)、體高、胸圍、管?chē)腕w重方面顯著高于CCGG和TTAA型(P<0.05)。因此，綜上推斷Ihh基因基因型組合與牦牛體斜長(zhǎng)、體高、胸圍、管?chē)腕w重存在相關(guān)性。

牦牛；Ihh基因；多態(tài)性；高分辨率熔解曲線；生產(chǎn)性狀；熒光定量；基因表達(dá)

骨骼是脊椎動(dòng)物整個(gè)身體的支架，它們不僅保護(hù)鄰近器官，而且保證了機(jī)體的自由運(yùn)動(dòng)，它們的位置、形狀和尺寸基本決定了動(dòng)物體格的大小。Indian hedgehog(印度豪豬因子，Ihh)是一個(gè)主要的骨發(fā)育調(diào)節(jié)因子，它對(duì)于協(xié)調(diào)軟骨細(xì)胞的增殖，軟骨細(xì)胞的分化和造骨細(xì)胞的分化等軟骨內(nèi)骨發(fā)育過(guò)程是必須的[1-6]。研究發(fā)現(xiàn)，Ihh屬于一個(gè)非常保守的Hedgehog(Hh)分泌信號(hào)家族，在脊椎動(dòng)物中存在其2種同源基因：Sonic Hedgehog(音速豪豬因子，Shh)和Desert Hedgehog(沙漠豪豬因子，Dhh)[7]。Hedgehog 信號(hào)最早是在 1980年從果蠅體內(nèi)分離得到[8]， Hedgehog 的突變可使果蠅胚胎發(fā)育成毛團(tuán)狀，酷似刺猬，故又被稱為刺猬基因[9]。

Ihh是細(xì)胞分泌的一種重要的多肽，由 2 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：氨基端結(jié)構(gòu)域(Hh-N)和羧基端結(jié)構(gòu)域(Hh-C)，而且高度保守，具有獨(dú)特的生物活性[10-11]。回顧與Ihh基因相關(guān)的一些研究，可以了解到，Ihh在軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖和分化中起調(diào)節(jié)作用[12]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Ihh在成骨細(xì)胞中也有表達(dá)[13]；K.K.Mak等[14-15]研究發(fā)現(xiàn)，Ihh 既可以單獨(dú)作用于軟骨分化，又可以協(xié)同PTHrP(甲狀旁腺素相關(guān)肽) 形成負(fù)反饋軸機(jī)制，從而維持骨的穩(wěn)定生長(zhǎng)。另也有研究表明，Ihh也在妊娠過(guò)程中介導(dǎo)胚胎的植入，敲除Ihh基因后小鼠不能受孕[16]。表達(dá)試驗(yàn)表明，Ihh在小鼠妊娠第3.5～5.5天的子宮內(nèi)膜腔上皮和腺上皮呈高水平表達(dá)[17]，且分泌期子宮內(nèi)膜Ihh基因表達(dá)明顯高于增殖期[18]。Ihh基因突變方面的研究主要集中在人和小鼠上，Ihh基因突變的小鼠表現(xiàn)出個(gè)體矮小和典型的A1型短指/趾癥表型[19]；在人上Ihh的突變主要造成并趾和短指[20]，這都說(shuō)明Ihh基因與指骨關(guān)節(jié)發(fā)育密切相關(guān)；另外，G.Lettre等研究發(fā)現(xiàn)Ihh基因的單核苷酸多態(tài)性也是人身高差異的主要因素[21]。

目前，對(duì)Ihh基因的相關(guān)研究主要集中在人和小鼠上，而在家畜方面，關(guān)于Ihh基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，鑒于Ihh基因在人和小鼠中具有重要的功能，在牦牛中開(kāi)展對(duì)該基因的相關(guān)研究就顯得尤為重要。鑒于此，筆者從分子水平入手，初步篩查出Ihh基因多態(tài)位點(diǎn)，并進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)基因型組合與生產(chǎn)性狀的相關(guān)性分析，找到與生產(chǎn)性狀相關(guān)的DNA標(biāo)記，為牦牛新品種的選育提供科學(xué)依據(jù)；同時(shí)，以熒光定量PCR法分析了Ihh基因在牦牛和黃牛不同器官的表達(dá)差異，為進(jìn)一步研究Ihh基因在牦牛體內(nèi)的分布、表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用于表達(dá)譜分析的組織樣品采自于6頭成年甘南牦牛和6頭成年黃牛的心、肝、脾、肺、腎、肌肉、小腸和胰，取樣后立即投入液氮中，回實(shí)驗(yàn)室后-80 ℃保存。用GIBCO公司的TRIZOL Reagent 提取組織總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，將RNA稀釋至1 μg·μL-1備用，cDNA第一鏈的合成參考TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

用于遺傳多樣性分析的全血樣品采自3個(gè)中國(guó)地方牦牛品種(包括6月齡的甘南牦牛200頭、6～9月齡的大通牦牛203頭和2～3歲的天祝牦牛208頭)，頸靜脈采血10 mL，ACD抗凝(V(血液)∶V(ACD)=6∶1)，輕微震蕩混勻后，-20 ℃保存?zhèn)溆?。利用Relax Gene血液基因組DNA提取系統(tǒng)(天根，北京)提取基因組DNA，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，使用NANO DROP 2000(Thermo，美國(guó))檢測(cè)提取的DNA濃度并抽取20 μL稀釋到18～22 ng·μL-1作為PCR擴(kuò)增模板，其余母液保存于-80 ℃。實(shí)地測(cè)量4項(xiàng)體尺指標(biāo)(體斜長(zhǎng)、體高、胸圍、管?chē)?和體重。

1.2 組織表達(dá)分析

1.2.1 組織表達(dá)譜引物 根據(jù)NCBI網(wǎng)站中黃牛Ihh基因的 mRNA(登錄號(hào)：NM_001076870)，利用Pimer5設(shè)計(jì)定量PCR引物(表1)，內(nèi)參引物選用文獻(xiàn)中牦牛GAPDH引物[22]，引物由TaKaRa公司合成。

表1Ihh基因定量分析引物信息

Table 1 Information of primer sequences for relative analysis within yakIhhgene

引物Primer引物序列(5'-3')Primersequence退火溫度/℃Tm片段長(zhǎng)度/bpLengthIhhF:CCAACTACAATCCAGACATCATCTTR:AGATGGCCAGCGAGTTCAG60.5102GAPDHF:CCACGAGAAGTATAACAACACCR:GTCATAAGTCCCTCCACGAT54.4120

1.2.2 熒光定量PCR 反應(yīng)體系(10 μL)：2 μL RT產(chǎn)物，5 μL SYBR Green熒光染料，上下游引物各1 μL，1 μL ddH2O。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，退火溫度退火30 s，62 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；于60 ℃采集熒光，采用默認(rèn)設(shè)置自動(dòng)生成Ct值。采用2-△△Ct法[22-23]，用GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)Ω鳂颖居脤?shí)時(shí)定量PCR結(jié)果進(jìn)行校正處理，并以胰腺表達(dá)量作為校正者，計(jì)算各樣本Ihh基因的相對(duì)表達(dá)水平。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，取平均值。

1.3 PCR擴(kuò)增

1.3.1 SNP檢測(cè) 參考NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)牛的Ihh基因(登錄號(hào)：NP_001070338)，并結(jié)合牦牛全基因組測(cè)序的序列，采用交叉重疊原理[24]設(shè)計(jì)4對(duì)引物對(duì)Ihh基因外顯子序列進(jìn)行擴(kuò)增(表2)，引物由上海生物工程股份有限公司合成。

PCR擴(kuò)增體系(25 μL)：包括約20 ng·μL-1的基因組DNA 1 μL，10 pmol的上下游引物各1 μL，2×Taq PCR MasterMix(內(nèi)含TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs等)(北京，天根)12.5 μL，滅菌超純水9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，復(fù)性30 s(退火溫度見(jiàn)表2)，72 ℃延伸(時(shí)間見(jiàn)表2)，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

表2 鑒定牦牛Ihh基因突變位點(diǎn)所用引物信息表

Table 2 Information of primer sequences for scanning SNPs within yakIhhgene

引物Primer引物序列(5'-3')Primersequence退火溫度/℃Tm片段長(zhǎng)度/bpLength延伸時(shí)間/sTime擴(kuò)增位置LocusIhh-1F:AAGGACAGGAGAACACCR:GGAGGCAGTCGGGTAGAGG54.334820外顯子1Ihh-2F:TACTGCGTGAGTTTGGATR:GCCTCTTCACCTTCTTGG59.065930外顯子2Ihh-3F:GGAATCCAAACTCCACCCAGR:CACAGCCGCAAAGCAAGA56.752530外顯子3Ihh-4F:TCTTGCTTTGCGGCTGTGR:GGGCTTTCCCTACTTATTC55.3125550外顯子3

1.3.2 DNA測(cè)序分析和HRM小片段法基因分型[24-25]PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根，北京)回收純化送往大連寶生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)DNASTAR軟件比對(duì)分析。針對(duì)所發(fā)現(xiàn)的多態(tài)位點(diǎn)，利用Light Scanner Primer Design Software(Idaho公司，美國(guó))設(shè)計(jì)出用于HRM(High Resolution Melting，高分辨率熔解曲線)分析多態(tài)位點(diǎn)的引物(表3)，對(duì)試驗(yàn)群體樣本進(jìn)行基因型分析。合成1對(duì)高低溫內(nèi)標(biāo)[26](表4)對(duì)熔解曲線進(jìn)行校正，提高分型的精確度。

HRM-PCR擴(kuò)增體系(11 μL)：包括20 ng·μL-1的基因組DNA 1 μL，10 pmol的上下游引物各0.2 μL，2×Taq PCR MasterMix(內(nèi)含TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs等)(北京，天根)5 μL，滅菌超純水3.6 μL，10×LC Green飽和染料(美國(guó)，Idaho)1 μL。HRM-PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性20 s，Tm(℃)(表3)退火20 s，72 ℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

高低溫內(nèi)標(biāo)稀釋方法：1 OD內(nèi)標(biāo)單鏈加400 μL水，退火體系：飽和氯化鈉1 μL，內(nèi)標(biāo)互補(bǔ)雙鏈各1 μL，補(bǔ)水至10 μL，95 ℃水浴3 min，然后緩慢降至室溫。

HRM熒光信號(hào)采集：將稀釋好的高低溫內(nèi)標(biāo)各1 μL加入HRM-PCR產(chǎn)物單孔中，95 ℃變性30 s，放入Light Scanner 96(美國(guó)，Idaho)中收集熒光信號(hào)。

表3 HRM分析多態(tài)位點(diǎn)的引物信息表

Table 3 Information of primer sequences for genotyping mutations by HRM

檢測(cè)位點(diǎn)Loci引物序列(5'-3')Primersequence退火溫度/℃Tm片段長(zhǎng)度/bpLength5855(C/T)F:GCAGCTGTCTCCACGCACF:ACCACATCCTCCACCACC64.41126383(G/A)F:GTCCCAACCCAGCCAGCCF:GCAAGCCCACCCAAGAGG65.596

表4 高低溫內(nèi)標(biāo)序列信息表

Table 4 Information of low and high calibrator sequence

高低溫內(nèi)標(biāo)LowandhighcalibratorTm/℃內(nèi)標(biāo)序列(5'-3')CalibratorLow269.85GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-C3High287.92ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAATTTCATTTT-C3

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

各組織中表達(dá)量的差異用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。多態(tài)性根據(jù)群體遺傳學(xué)理論直接計(jì)算得到基因型和等位基因頻率，統(tǒng)計(jì)牦牛群體Ihh基因多態(tài)位點(diǎn)的純和度Ho、雜合度He、有效等位基因數(shù)Ne、多態(tài)信息含量PIC[27-29]，并進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)。采用SPSS17.0軟件對(duì)Ihh基因多態(tài)性位點(diǎn)在不同牦牛群體中的基因型分布進(jìn)行卡方檢測(cè)，考慮到品種、性別、環(huán)境和年齡因素的影響，采用固定模型分析基因型效應(yīng)對(duì)生產(chǎn)性狀的影響。

固定模型：Yijklm=u+Gi+Sj+Ak+Bl+Em+εijklm。

式中，Yijklm為個(gè)體表型記錄，u為群體均值，Gi為標(biāo)記基因型效應(yīng)，Sj為性別因素，Ak為年齡因素，Bl為品種效應(yīng)，Em為環(huán)境因素，εijklm為隨機(jī)誤差。

2 結(jié) 果

2.1 牦牛Ihh基因的組織表達(dá)譜分析

利用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)牦牛和黃牛Ihh基因在心、肌肉、小腸、肺、腎、肝、卵巢和胰各個(gè)組織的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。Ihh基因在牦牛和黃牛所研究的組織中均表達(dá)，其中在牦牛肝中的表達(dá)量顯著高于黃牛(P<0.05)；在牦牛和黃牛的卵巢、肺、腎和胰組織中中度表達(dá)，在心、脾和肌肉組織中牦牛和黃牛表達(dá)量都相對(duì)低。

2.2 牦牛Ihh基因HRM方法的分型

通過(guò)DNA混合池對(duì)牦牛Ihh基因測(cè)序后，應(yīng)用MEGA.5軟件對(duì)拼接得到的Ihh基因序列與黃牛序列進(jìn)行比對(duì)，并結(jié)合測(cè)序峰圖可知，牦牛Ihh基因外顯子3上存在5855(C/T)和6383(G/A)的多態(tài)位點(diǎn)(圖2)，應(yīng)用高分辨率熔解曲線對(duì)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析，結(jié)果如圖3所示。

圖1 Ihh 基因在牦牛和黃牛不同組織器官的表達(dá)模式Fig.1 Transcript levels of Ihh gene by quantitative real-time PCR in cattle and yak

圖2 2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的測(cè)序峰圖Fig.2 The sequencing peak graph of 2 loci

圖3 2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)HRM分型曲線Fig.3 The HRM analysis at 2 loci

5855(C/T)基因型判定：擴(kuò)增包含多態(tài)性位點(diǎn)在內(nèi)的112 bp的DNA片段，然后將擴(kuò)增通過(guò)Light Scanner(美國(guó)，Idaho)掃描分型，其基本原理是通過(guò)LC Green飽和染料和DNA進(jìn)行結(jié)合，然后通過(guò)Light Scanner高分辨率分析系統(tǒng)升溫，并收集熒光信號(hào)得到熔解曲線，在熔解曲線形成過(guò)程中，由于核酸分子物理性質(zhì)的不同，從而導(dǎo)致熔解曲線的不同，達(dá)到區(qū)分不同樣品的目的。結(jié)果表明，熔解曲線分析有3種基因型：CC、CT和TT(圖3A)。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，CC基因型屬于優(yōu)勢(shì)基因型，個(gè)體數(shù)明顯多于其他基因型。

6383(G/A) 基因型判定：擴(kuò)增包含多態(tài)性位點(diǎn)在內(nèi)的98 bp的DNA片段，然后將擴(kuò)增通過(guò)Light Scanner(美國(guó)，Idaho)掃描，通過(guò)熔解曲線分析出有3種基因型，GG、GA和AA(圖3B)。 統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，GG基因型屬于優(yōu)勢(shì)基因型，個(gè)體數(shù)明顯多于其他基因型。

2.3 不同牦牛群體Ihh基因多態(tài)位點(diǎn)遺傳多態(tài)性的分析

2.3.1 不同牦牛群體Ihh基因突變位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率 在Ihh基因5855(C/T)突變位點(diǎn)處，3個(gè)牦牛品種的優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镃(表5)；在Ihh基因6383(G/A)突變位點(diǎn)處，3個(gè)牦牛品種的優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镚(表5)，它們的等位基因頻率基本均在0.7以上。

表5Ihh基因突變位點(diǎn)5855(C/T)和6383(G/A)的基因型及等位基因頻率

Table 5 Genotypes and allele frequence of 5855(C/T) and 6383(G/A) in theIhhgene

位點(diǎn)Loci品種Breed基因型頻率Genotypicfrequency等位基因頻率Allelicfrequency5855(C/T)甘南牦牛CC(122)0.61CT(32)0.16TT(46)0.23C0.69T0.31大通牦牛CC(138)0.68CT(54)0.266TT(11)0.054C0.813T0.187天祝牦牛CC(147)0.707CT(20)0.096TT(41)0.197C0.755T0.2456383(G/A)甘南牦牛GG(149)0.745GA(18)0.09AA(33)0.165G0.79A0.21大通牦牛GG(133)0.655GA(42)0.207AA(28)0.138G0.759A0.241天祝牦牛GG(124)0.596GA(38)0.183AA(46)0.221G0.688A0.312

2.3.2 不同牦牛群體Ihh基因群體遺傳特性 多態(tài)位點(diǎn)5855(C/T)在甘南牦牛和大通牦牛群體中，表現(xiàn)為高度多態(tài)(PIC>0.5)，天祝牦牛表現(xiàn)為中度多態(tài)(0.50.5)，在甘南牦牛群體中表現(xiàn)為中度多態(tài)(PIC<0.5)(表6)。另外Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在多態(tài)位點(diǎn)5855(C/T)和(6383(G/A)處，甘南牦牛和大通牦牛均未達(dá)到Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)，天祝牦牛達(dá)到了Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

表6Ihh基因突變位點(diǎn)5855(C/T)和6383(G/A)的遺傳多態(tài)性

Table 6 Genetic diversity of 5855(C/T) and 6383(G/A) of theIhhgene

位點(diǎn)Loci品種Breed純合度Homozygosity雜合度Heterozygosity有效等位基因數(shù)Effectiveallelenumbers多態(tài)信息含量PolymorphicinformationcontentHWE卡方χ2P值Pvalue5855(C/T)甘南牦牛0.4250.5752.3530.5360.073P<0.01大通牦牛0.4650.5352.1510.5320.436P<0.05天祝牦牛0.5390.4611.8550.4222.404P>0.056383(G/A)甘南牦牛0.5820.4181.7180.3881.679P<0.05大通牦牛0.4480.5522.2320.5360.657P<0.05天祝牦牛0.4040.5962.4750.5612.674P>0.05

2.4 不同牦牛群體Ihh基因不同基因型組合與體尺性狀的關(guān)聯(lián)性分析

對(duì)各牦牛群體Ihh基因各多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行HRM分型統(tǒng)計(jì)后，運(yùn)用SHEsis軟件進(jìn)行位點(diǎn)間的連鎖不平衡分析，2個(gè)位點(diǎn)間可能存在強(qiáng)連鎖不平衡(D’>0.75，r2>0.33)；同時(shí)，在3個(gè)牦牛群體中發(fā)現(xiàn)了4種單倍型組合(表7)。參照鮑斌等[30]研究方法從基因型組合角度出發(fā)，選取3個(gè)牦牛群體中共同的基因型組合CCGG、TTAA和CTGA(表8)運(yùn)用SPSS17.0軟件分析這3種基因型組合與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性。由表9可知，甘南牦牛基因型組合對(duì)體重有顯著影響(P<0.05)，對(duì)體長(zhǎng)、體高、胸圍和管?chē)町惒伙@著(P>0.05)；由表9可知，大通牦牛基因型組合對(duì)體長(zhǎng)、體高、胸圍、管?chē)腕w重都有顯著影響(P<0.05)；由表9可知，天祝牦?；蛐徒M合對(duì)胸圍和體重有顯著影響(P<0.05)，而在體長(zhǎng)、體高和管?chē)矫娌町惒伙@著(P>0.05)?？傮w比較發(fā)現(xiàn)CTGA基因型組合在各個(gè)牦牛群體中都具有較高的生產(chǎn)性狀。

表7 牦牛Ihh基因多態(tài)位點(diǎn)的分布及頻率

Table 7 The haplotype frequencies and distribution of SNPs inIhhgene

品種Breed單倍型組合HaplotypecombinationCGTACATG甘南牦牛286(0.688)71(0.177)26(0.064)0大通牦牛303(0.748)102(0.245)28(0.067)4(0.010)天祝牦牛274(0.685)82(0.205)2(0.005)42(0.105)

表8 牦牛Ihh基因突變位點(diǎn)5855(C/T)和6383(G/A)基因型組合

Table 8 Genotype at theIhhgene for the 5855(C/T) and 6383(G/A) SNPs in yak populations

表9 甘南牦牛、大通牦牛和天祝牦牛Ihh基因不同基因型組合與生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)分析

Table 9 Association of differentIhhgenotypes combinations with production traits in Gannan，Datong and Tianzhu yaks

品種Breed基因型Genotype體長(zhǎng)/cmBodylenghth體高/cmBodyheight胸圍/cmChestgirth管?chē)?cmTubegirth體重/kgWeight甘南牦牛CCGG(122)83.91±0.81985.54±0.998106.79±1.09911.66±0.13786.74±3.133aCTGA(5)83.60±0.66885.57±0.727107.49±1.74111.59±0.11285.66±1.622aTTAA(32)82.77±1.13884.46±0.090104.18±1.79111.78±0.13978.05±1.715b大通牦牛CCGG(119)85.86±0.971a85.32±0.725a113.97±1.186a11.88±0.047a72.71±1.238abCTGA(15)86.96±0.621a86.61±0.604b109.87±1.006b11.91±0.066ab76.60±2.023aTTAA(41)84.10±0.758b85.77±0.691a109.56±1.145b12.06±0.057b70.92±1.531b天豬牦牛CCGG(139)113.50±0.391110.4±0.654145.42±0.558A13.64±0.393210.48±1.455abCTGA(36)117.57±1.426114.08±0.753156.86±0.791C14.07±0.701223.42±1.126aTTAA(7)115.87±0.419109.43±1.485150.75±0.8865B13.55±0.202196.37±0.871b

同列相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

The same letters within the same column show no significant difference(P>0.05)，the different letters show significant difference(P<0.05).The same as below

3 討 論

在長(zhǎng)骨發(fā)育過(guò)程中，Ihh主要表達(dá)在肥大軟骨細(xì)胞區(qū)域。Ihh基因敲除的小鼠顯示出軟骨細(xì)胞增殖減少，肥大軟骨細(xì)胞增加和造骨細(xì)胞缺失等多方面的骨發(fā)育異常[31-32]。本試驗(yàn)研究的牦牛和黃牛的8個(gè)組織中，均檢測(cè)到Ihh基因mRNA的表達(dá)，說(shuō)明Ihh基因是黃牛和牦牛很多組織細(xì)胞功能所必需。

牛的生長(zhǎng)性狀屬微效多基因控制的數(shù)量性狀，常規(guī)的表型選擇，精確性較差，遺傳進(jìn)展緩慢。而且關(guān)于調(diào)控牛生長(zhǎng)的機(jī)理目前還不清楚，主效基因還沒(méi)有確定，目前可能與生產(chǎn)性狀有關(guān)的候選基因主要有GH[33]、GHR[34-35]和IGF[36-37]等,而牛的Ihh基因位于2號(hào)染色體107722665～107728939位置，通過(guò)與牛2號(hào)染色體上的 QTL數(shù)據(jù)(http://www.animalgenome.org/QTLdb/pubs.php)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在包括Ihh基因在內(nèi)的106.5～115.4 cm的QTL區(qū)域主要與體尺性狀、產(chǎn)犢、結(jié)核病和乳房炎等性狀有關(guān)，而且研究發(fā)現(xiàn)Ihh基因突變的小鼠(E95K突變)表現(xiàn)出個(gè)體矮小和典型的A1型短指/趾癥表型—第2～第4 指中指節(jié)嚴(yán)重縮短，第5指中指節(jié)缺失[19]，在人上Ihh基因的突變主要造成并趾和短指[20]，這都證明Ihh基因與指骨關(guān)節(jié)發(fā)育密切相關(guān)。因此把Ihh基因作為影響牛生產(chǎn)性狀的候選基因進(jìn)行研究。

本試驗(yàn)通過(guò)DNA混合池測(cè)序得到甘南牦牛Ihh基因2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，均位于外顯子3上，在群體中均存在3種基因型和2種等位基因， TT和AA分別為其優(yōu)勢(shì)基因型，其優(yōu)勢(shì)等位基因頻率都達(dá)到了0.7以上，這可能與樣本的品種、家系和自然環(huán)境有關(guān)系。按照D.Botstein等[29]提出衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標(biāo)(PIC)的標(biāo)準(zhǔn)，本試驗(yàn)中所檢測(cè)到的2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)雜合度及PIC值都在高等水平，故這2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)均為高度多態(tài)，遺傳變異高，選擇余地大。 Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)表明，在2個(gè)突變位點(diǎn)處，甘南牦牛和大通牦牛均未達(dá)到哈代-溫伯格平衡(P<0.05)，這可能是因?yàn)楦誓详笈：痛笸笈］^長(zhǎng)期的人工選育，人為的因素為其不處于Hardy-Weinberg平衡的主要因素；而2個(gè)突變位點(diǎn)在天祝牦牛中均達(dá)到Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，可能因牦牛種群是一個(gè)較為原始的封閉種群，長(zhǎng)期處于閉鎖繁育狀態(tài)，從而處于動(dòng)態(tài)平衡。

試驗(yàn)中對(duì)不同牦牛品種2個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析后，發(fā)現(xiàn)2個(gè)突變位點(diǎn)有強(qiáng)連鎖不平衡，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)了4種單倍型組合，發(fā)現(xiàn)了主要的3種基因型組合，對(duì)3種基因型組合與生產(chǎn)性狀間的相關(guān)性分析表明，CCGG、CTGA和TTAA的3種基因型組合可能與牦牛的生產(chǎn)性狀相關(guān)，而在這3種組合中，CTGA具有較高的生產(chǎn)性能，但在群體中數(shù)目少，需要加大人工選育。同時(shí)，這種相關(guān)性分析降低了單個(gè)突變位點(diǎn)受環(huán)境、其他位點(diǎn)和其他相關(guān)微效基因的影響[38]，得到較可靠的基因型效應(yīng)估計(jì)值，在評(píng)估品種和種群的遺傳改良時(shí)更準(zhǔn)確。

4 結(jié) 論

Ihh基因2個(gè)突變位點(diǎn)的3種基因型組合對(duì)牦牛體斜長(zhǎng)、體高、胸圍、管?chē)腕w重均有不同程度的影響，具有CTGA基因型組合的牦牛個(gè)體可能體型更大，因此，Ihh基因可以作為主效候選基因或與主基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，將來(lái)可以嘗試通過(guò)人工干預(yù)，擴(kuò)大有利基因型組合個(gè)體的數(shù)目。

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(編輯 郭云雁)

Tissue Expression，SNP Detection and Association of Genotype Combination ofIhhGene with Production Traits in Yak

LI Tian-ke1,2,3，ZHAO Juan-hua1,2，PEI Jie1,2，LIANG Chun-nian1,2， GUO Xian1,2，QIN Wen1,2,3，YAN Ping1,2,3*

(1.LanzhouInstituteofHusbandryandPharmaceuticalSciences，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Lanzhou730050，China;2.KeyLaboratoryofYakBreedingEngineering，Lanzhou730050，China;3.CollegeofAnimalScienceandTechnology，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

The objective of this study was to identify the polymorphisms ofIhhgene and their correlation with production traits，then to detect the molecular markers related to production traits，and investigate distribution and expression in tissues detected in yak and cattle.At the same time，RT-PCR method was used to detect the expression ofIhhgene in different tissues in yak and cattle.BLAST and Chromas were used to screen the SNPs inIhhgene by the wave height of sequencing map.The genotypes were determined by high-resolution melting curve(HRM) and the alleles frequency was estimated.The PHASE and SHEsis softwares were used to analyze matching chain disequilibrium and haplotype，respectively.The SPSS17.0 software was used for association analysis.Two SNPs(5855(C/T) and 6383(G/A)) ofIhhgene were indentified in the population，which were on exon 3.Through population genetics analysis，the results showed that 2 loci were at high polymorphic status(PIC>0.25).The χ2tests showed that the 2 loci were in the status of Hardy-Weinberg equilibrium(P<0.05) in Gannan and Datong yaks; the 2 loci were not all in the status of Hardy-Weinberg equilibrium(P>0.05) in Tianzhu yak.Analysis of matching chain disequilibrium and haplotype showed that there was a strengh linkage equilibrium between the 2 loci with 4 haplotype combinations and 3 genotype combinations.Analysis of association of polymorphism with body measurement traits at all mutation loci showed that 3 genotype combinations had significant effects on body height，body length，weight，tube girth and herrt girth(P<0.05).Yak with CTGA genotype combination had higher body height，body length，weight，tube girth and herrt girth than individuals with CCGG and TTAA.The result of expression showed thatIhhgene was expressed in 8 different tissues.The results suggest thatIhhgene may have potential effects on production traits in the above mentioned yak populations and could be used for marker-assisted selection.

yak；Ihhgene；polymorphism；HRM；production traits；RT-PCR；gene expression

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.007

2014-01-25

甘肅牧區(qū)生產(chǎn)生態(tài)生活優(yōu)化保障技術(shù)集成與示范(2012-2016)(2012BAD13B05)；甘肅省科技重大專項(xiàng)計(jì)劃(1102NKDA027)

李天科(1987-)，男，碩士生，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail:litianke1987@163.com

*通信作者：閻 萍，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail:pingyan@sohu.com

S832.85；S813.3

A

0366-6964(2015)01-0050-10