豬肝羧酸酯酶1基因的克隆和在原核細胞中的功能性表達

肖啟玲，李朋輝，閆秉芳，楊 路，王喜亮，肖運才，李自力，劉 梅，畢丁仁，石德時*

(1．華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，農(nóng)業(yè)部獸用診斷制劑創(chuàng)制重點實驗室，武漢 430070；3．羅德島大學生物醫(yī)學科學系，藥物基因組學與分子治療中心，金士頓02881，美國)

豬肝羧酸酯酶1基因的克隆和在原核細胞中的功能性表達

肖啟玲1，2，李朋輝1，2，閆秉芳3，楊 路1，2，王喜亮1，2，肖運才1，2，李自力1，2，劉 梅1，2，畢丁仁1，2，石德時1，2*

(1．華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，農(nóng)業(yè)部獸用診斷制劑創(chuàng)制重點實驗室，武漢 430070；3．羅德島大學生物醫(yī)學科學系，藥物基因組學與分子治療中心，金士頓02881，美國)

為獲得有活性的豬肝羧酸酯酶1(PLE1)并研究其功能，利用RT-PCR與常規(guī)PCR方法，從大白豬肝組織中擴增PLE1基因的ORF。將PLE1的ORF序列連接到pET15b原核表達載體，在OrigamiTM2(DE3)中與pGro7質(zhì)粒共誘導表達，純化目的蛋白質(zhì)并檢測其酶活性。測序結(jié)果表明克隆到PLE1基因編碼區(qū)全長1 686 bp的片段，該片段編碼562個氨基酸。SDS-PAGE和Western blotting 結(jié)果顯示，PLE1融合蛋白質(zhì)成功表達，在30 ℃的培養(yǎng)溫度下，IPTG誘導6 h后，PLE1重組蛋白質(zhì)表達量最高，且大部分以可溶性形式存在。酶活性試驗結(jié)果表明，PLE1融合蛋白質(zhì)水解底物p-NPA的酶活力為1.24 U。研究結(jié)果不僅為研究PLE1水解獸藥特性提供高純度的具有原有酶活性的重組蛋白質(zhì)，也為PLE同工酶家族其他重要成員的活性功能研究提供理論依據(jù)和技術(shù)手段。

豬肝羧酸酯酶1；功能性表達；活性檢測

由多種同功酶組成的哺乳動物的羧酸酯酶是一個同工酶超家族，其成員核酸序列高度同源，生物學特性相似，根據(jù)核酸序列同源性該超家族又分為5個亞家族(CES 1～5)，其中絕大部分已發(fā)現(xiàn)的同功酶屬于CES1或CES2亞家族[1-2]。哺乳動物的羧酸酯酶均屬于α/β折疊水解酶類，廣泛存在于機體內(nèi)各種組織中，其中以肝含量最為豐富[3-4]。肝羧酸酯酶可以水解酯類、硫酯類和酰胺類等多種內(nèi)、外源性化合物，對多種藥物、環(huán)境毒物及致癌物有解毒作用[3，5]。大量被設計成酯類前藥的人類臨床藥物(如奧司他韋、CPT-11、洛伐他汀等)就是利用該酶的這種水解作用，在機體內(nèi)這些酯類前藥被水解而生成具有活性的藥物分子發(fā)揮作用[6]。除此之外，哺乳動物羧酸酯酶還參與了跨膜信號轉(zhuǎn)導、生物膜完整性的維持等重要的生理過程[7-9]。

豬肝羧酸酯酶(pig liver esterase，PLE)屬于哺乳動物羧酸酯酶，是由多種同工酶組成的酶家族，屬于絲氨酸水解酶類，已有研究提示PLE可能在水解和代謝豬內(nèi)、外源性酯類物質(zhì)(包括前藥)的過程中發(fā)揮重要作用[10-11]，且我們的研究已發(fā)現(xiàn)豬肝羧酸酯酶1(PLE1)可水解磺胺類等臨床常用抗菌藥物(待發(fā)表)。PLE家族是目前已知的最復雜的哺乳動物羧酸酯酶家族，因其成員的物理化學性質(zhì)極其相似，故用一般的物理化學方法難以將彼此完全分開，直接從肝組織中提取的PLE是多種同工酶的混合物，因此，用這種提取的混合物得到的試驗結(jié)果也是多種同工酶共同作用的結(jié)果[12-13]。據(jù)報道不同的PLE同工酶亞型具有不同的相對分子質(zhì)量和等電點，并且PLE同工酶各亞型對抑制劑的敏感性和對底物的特異性也都各異。根據(jù)相對分子質(zhì)量和等電點的差異，PLE被分為α-PLE、β-PLE、γ-PLE三種類型[12-15]。A.Hummel等在豬肝中克隆出了7種核苷酸序列高度同源的PLE同工酶亞型，這7種同功酶基因ORF大小均為1 698 bp(最后的12個bp 編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)潴留信號，在進行體外表達時，多將其去掉)[16]，由14個外顯子組成，所有亞型的第1、2、5、7、10、11、13、14外顯子的序列相同，因此利用PLE第1外顯子和第14外顯子的序列設計引物，可克隆到多種PLE同工酶亞型。根據(jù)同源性和酶活性差異，這7種PLE分別被命名為PLE1～6和APLE[9,16-17]。目前只能確定PLE1就是γ-PLE，APLE、PLE2～6與α-PLE、β-PLE的對應關(guān)系還不清楚。

人們對PLE的研究始于20世紀初，但是由于從豬肝中粗提的PLE是多種同工酶的混合物、每批次提取物的成分不穩(wěn)定，嚴重阻礙了人們對PLE的研究和應用。為了獲得高純度的、具有酶活性的PLE，2001年S.Lange等運用基因工程技術(shù)在畢赤酵母中表達γ-PLE，成功獲得能夠水解脯氨酸-β-萘酰胺且具有較強酶活性的γ-PLE，但是產(chǎn)量較低[18]。同時A.Musidlowska等在酵母中表達的具有活性的重組γ-PLE表現(xiàn)出了與粗提PLE明顯不同的水解動力學特性和立體選擇特性[19]。2007年D.B?ttcher等在經(jīng)過基因工程改造和轉(zhuǎn)入分子伴侶pGro7的大腸桿菌表達系統(tǒng)中成功地表達出具有酶活性的γ-PLE[20]。在大腸桿菌表達的γ-PLE具有與酵母表達的γ-PLE相似的生化特性和立體選擇性，并且產(chǎn)量大大提高。

PLE具有強大的水解活性，而且更加重要的是，PLE對底物的水解還具有高度的立體選擇性，因此，PLE在有機化學合成領(lǐng)域是水解酶的主角[21-22]；但長期以來，人們對PLE作為藥物代謝酶角色的研究很少。

受PLE在化學合成中表現(xiàn)出的強大水解活性和哺乳動物羧酸酯酶通過水解作用控制藥物療效和毒副作用的啟發(fā)，作者推測：與其他哺乳動物的羧酸酯酶一樣，PLE可能在某些獸藥的代謝中發(fā)揮不可忽視的作用，與獸藥的療效和毒副作用有緊密關(guān)聯(lián)。為了得到純化的PLE進行藥物代謝研究，對PLE家族的重要成員PLE1進行了克隆和功能性表達。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品采集：大白豬(70日齡)購自湖北天種畜牧股份有限公司。試驗豬經(jīng)頸部放血處死后，立即采取右側(cè)肝組織樣品(約30 g)，用錫箔紙包裹迅速置于液氮中速凍，置-80 ℃凍存。

主要試劑：TaqDNA聚合酶、dNTPs、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、6×Loading Buffer、DL2000、DL15000 Marker、各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶均為大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司產(chǎn)品；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；瓊脂糖購自BIOWEST，DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂粉均購自杭州微生物試劑有限公司，Trizol試劑購自Invitrogen公司；L-Arabinose購自Sigma公司，氨芐青霉素、氯霉素、IPTG、甲酸、甲醇、SDS、甘氨酸、Tris均購自武漢生命科技有限公司；小鼠6×His標簽蛋白質(zhì)單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠IgG多克隆抗體均購自ABGENT公司，蛋白質(zhì)Marker及5×protein loading buffer均購自Fermentas公司，30%的丙烯酰胺購自BIO-RAD公司，Tween-20購自Solarbio公司，TEMED購自Thermo公司。OrigamiTM2(DE3)和pET-15b購自Merck Millipore公司，E.coliDH5α、分子伴侶pGro7和pMD18-T Vector購自TaKaRa公司。

1.2 肝組織總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和PLE基因克隆

按照Trizol試劑盒說明書提取肝組織總RNA，取2 μg總RNA用于RT-PCR。參照GenBank中收錄的PLE1的cDNA序列(登錄號：X63323)，利用Primer Premier 5.0設計1對引物(PLE-up：5′-GGAATTCCATATGATGTGGCTTCTCCCGCT-3′，劃線為NdeⅠ酶切位點；PLE-down：5′-CCGCTC-GAGCTTTATCTTGGGTGGCT-3′，劃線為XhoⅠ酶切位點)進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠回收擴增片段，并將該片段克隆到pMD18-T載體，隨后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。將所獲得的PLE基因T-A克隆質(zhì)粒進行NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，篩選出陽性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測序，利用DNAStar軟件對測序結(jié)果進行比對與拼接，在線運行Blast及利用BioEdit軟件分析測序結(jié)果，將測序結(jié)果與已發(fā)表的PLE1序列(登錄號：X63323)比對，獲得的正確重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-PLE1。

1.3PLE1原核表達載體構(gòu)建及鑒定

以pMD18-T-PLE1質(zhì)粒為模板、上述PLE-up和PLE-down為引物PCR擴增PLE1片段。PCR擴增的PLE1片段和pET-15b分別用NdeⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，膠回收目的片段和載體pET-15b，T4 DNA ligase連接后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，重組質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳和測序鑒定分析。將獲得的具有正確讀碼框的陽性重組質(zhì)粒命名為pET15b-PLE1。

1.4 PLE1功能性表達及SDS-PAGE分析

首先將分子伴侶pGro7轉(zhuǎn)化OrigamiTM2(DE3)感受態(tài)細胞，在LB(Chl+)瓊脂平板上篩選出陽性菌落后命名為Origami-pGro7并擴大培養(yǎng)用來重新制備感受態(tài)細胞，再取1 μL的pET15b-PLE1轉(zhuǎn)化制備好的Origami-pGro7感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布LB(Amp+和Chl+)瓊脂平板進行篩選。37 ℃培養(yǎng)16 h后隨機挑取平板上的單個菌落擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后用NdeⅠ和XhoⅠ進行雙酶切鑒定。篩選出的陽性克隆命名為Origami-pGro7-PLE1。

將經(jīng)鑒定正確的陽性克隆子接種于LB(Amp+和Chl+)培養(yǎng)液中(1%比例)，首先誘導分子伴侶pGro7表達，加入L-Arabinose至終濃度為1 mg·mL-1，30 ℃搖床200 r·min-1培養(yǎng)2～3 h至菌液OD600 nm為0.6～0.8 時加入IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，分別于誘導3、6、9、12、24 h后取1 mL菌液12 000 r·min-1離心2 min收集菌體，加入滅菌ddH2O 40 μL重懸細菌，混勻后加入SDS上樣緩沖液，煮沸5～10 min使蛋白質(zhì)變性，SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍染色檢測分析重組蛋白質(zhì)的表達情況。

按照上述方法的最佳培養(yǎng)時間(IPTG誘導6 h)，大量培養(yǎng)表達PLE1。同時設置OrigamiTM2(DE3)和Origami-pGro7兩個對照組，在IPTG誘導6 h后3組菌液各取1 mL制備SDS-PAGE電泳樣品。Origami-pGro7-PLE1在IPTG誘導6 h后收集菌體，用壓力細胞破碎儀破碎菌體，直至溶液清亮。4 ℃ 12 000 r·min-1離心30 min，收集上清和沉淀并分別取樣制備SDS-PAGE電泳樣品。SDS-PAGE電泳分析重組蛋白質(zhì)的表達形式。

1.5 Western blotting檢測PLE1的表達

原核表達產(chǎn)物變性處理后進行SDS-PAGE 電泳，電泳完成后將產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜。5%脫脂牛奶(0.5%TBST配制)封閉1 h，棄去封閉液后加入抗His-tag抗體，室溫作用1 h，TBST洗滌雜交膜3次后再加入辣根過氧化物酶標記兔抗小鼠IgG反應0.5～1 h，暗室顯影。

1.6 PLE1融合蛋白的純化

取400 mL IPTG誘導表達6 h的菌液，離心菌體，在4 ℃下，用壓力細胞破碎儀破碎菌體至溶液透亮，12 000 r·min-1離心30 min收集上清液，上清液用0.45 μm濾膜過濾后，用HisTrap FF crude親和層析柱純化。

1.7 PLE1酶活力單位測定

2 結(jié) 果

2.1PLE基因的RT-PCR擴增結(jié)果和PLE1的克隆

提取大白豬肝總RNA，以RT-PCR的方法克隆得到PLE各亞型基因混合物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增片段大小為1 700 bp左右(圖1)，與預期大小(1 686 bp)相符。

回收PLE各亞型混合片段連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落經(jīng)測序鑒定得到PLE1、PLE6等多個PLE亞型，而且還分離出多種之前未發(fā)現(xiàn)的亞型(結(jié)果待發(fā)表)?？寺～@得的PLE1基因ORF序列見圖2，與已發(fā)表的PLE1ORF序列 (登錄號：X63323) 相似性99%。

M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標準；1～3.PLE基因產(chǎn)物M.DL2000 DNA marker；1-3.PLE gene products圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR擴增PLE基因Fig.1 Agarose gel electrophrosis of PLE gene products amplified by RT-PCR

2.2PLE1原核表達載體的構(gòu)建和雙酶切鑒定

將PLE1連接到pET15b表達載體，重組質(zhì)粒pET15b-PLE1雙酶切鑒定結(jié)果如圖3所示。經(jīng)測序，PLE1序列正確，無突變，讀碼框正確。

2.3PLEI基因的功能性表達和融合蛋白質(zhì)的純化

IPTG誘導結(jié)束后收集菌體，SDS-PAGE分析融合蛋白質(zhì)表達情況(圖4、5)。結(jié)果顯示：(1)如圖4所示，相對分子質(zhì)量為60 ku的分子伴侶pGro7誘導表達成功(第2泳道)， 61 ku的PLE1也表達成功(第3泳道)，因為分子伴侶與PLE1的相對分子質(zhì)量接近，所以第3泳道的條帶應該包含了分子伴侶與PLE1。(2)如圖5所示，IPTG誘導6 h后，PLE1重組蛋白質(zhì)表達量最高。檢測細胞碎片的上清(圖4泳道4)和沉淀(圖4泳道6)的對比結(jié)果表明，PLE1重組蛋白質(zhì)主要以可溶性形式存在。利用His層析柱對上清進行純化，如圖4(泳道5)、圖5(泳道6、7)所示，純化效果良好。

圖2 pMD18-T-PLE1基因ORF序列Fig.2 PLE1 ORF sequence in pMD18-T-PLE1

M1.DL15000 DNA相對分子質(zhì)量標準；1. NdeⅠ、XhoⅠ消化的pET15b-PLE1；M2.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標準M1.DL15000 DNA marker；1.pET15b-PLE1 digested by NdeⅠ and XhoⅠ；M2.DL2000 DNA marker圖3 pET15b-PLE1雙酶切鑒定Fig.3 Identification of pET15b-PLE1 recombinant plasmid with double restriction enzymes

1.Origami WT對照；2.Origami-pGro7對照；3.Origami-pGro7-PLE1；M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；4.Origami-pGro7-PLE1上清；5.His-tag純化PLE1;6.Origami-pGro7-PLE1包涵體1.Control 1 (Origami WT)；2.Control 2 (Origami-pGro7)；3.Origami-pGro7-PLE1；M.Protein molecular weight marker；4.The supernatant of sample from lane 3；5.His-tag-purified PLE1;6.Inclusion body fraction of sample from lane 3圖4 PLE1和pGro7共表達的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of coexpression of PLE1 and pGro7

1～5.Origami-pGro7-PLE1 IPTG 30 ℃分別誘導3、6、9、12、24 h;M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；6、7.His-tag純化 PLE1-5.Origami-pGro7-PLE1 induced for 3，6，9，12，24 h，respectively，by IPTG at 30 ℃；M.Protein molecular weight marker；6，7.His-tag-purified PLE圖5 pET15b-PLE1重組蛋白的純化Fig.5 Purified recombinant proteins of pET15b-PLE1

2.4 Western blotting檢測PLE1的表達

為了證明PLE1重組蛋白的表達，用抗His-tag抗體對PLE1重組蛋白質(zhì)進行鑒定，結(jié)果如圖6所示，出現(xiàn)大小符合預期61 ku的目標條帶。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1.Origami IPTG 30 ℃誘導6 h；2.Origami-pGro7 IPTG 30 ℃誘導6 h；3.Origami-pGro7-PLE1 IPTG 30 ℃誘導6 hM.Protein molecular weight marker；1.Origami induced for 6 h by IPTG in 30 ℃；2.Origami-pGro7 induced for 6 h by IPTG in 30 ℃；3.Origami-pGro7-PLE1 induced for 6 h by IPTG in 30 ℃圖6 pET15b-PLE1重組蛋白Western blotting鑒定Fig.6 Identification of pET15b-PLE1 recombinant protein by Western blotting

2.5 PLE1重組蛋白酶活性的檢測

通用底物p-NPA檢測純化重組PLE1蛋白酶活性試驗的結(jié)果顯示，Origami-pGro7-PLE1上清具有酶活性，可水解p-NPA產(chǎn)生p-NP，使溶液顏色由白變黃。

3 討 論

作者通過T-A克隆法不僅分離到了PLE1等多個已見報道的PLE同工酶亞型，而且還克隆到多種重復出現(xiàn)且尚未見報道的PLE新亞型，提示先前報道的PLE同工酶亞型種類尚不完全，存在未被發(fā)現(xiàn)的其他亞型，這更說明了PLE家族的復雜性。

為了表達出以可溶性形式存在且具有原有酶活性的PLE1融合蛋白，作者選取了具有trxB和gor雙突變的OrigamiTM2(DE3)為宿主菌，該菌可形成氧化性微環(huán)境利于重組蛋白質(zhì)二硫鍵的正確折疊，從而更有利于融合蛋白質(zhì)的可溶表達，同時其抗性少，對卡那霉素敏感，適用范圍廣；選擇含有T7啟動子的pET15b為表達載體，OrigamiTM2(DE3)能表達T7 RNA聚合酶，能夠保證pET15b載體上T7啟動子對外源蛋白表達的高效性和專一性[23-24]，此外，該載體結(jié)構(gòu)簡單，能夠表達含有His-tag的外源蛋白質(zhì)，His-tag相對分子質(zhì)量相對PLE1可以忽略不計，不僅不影響外源蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和功能，并且易于外源蛋白質(zhì)的純化從而獲得高純度的重組蛋白質(zhì)；同時選取pGro7作為表達的輔助質(zhì)粒，通過表達分子伴侶pGro7輔助重組蛋白質(zhì)正確折疊，從而大大提高了PLE1重組蛋白質(zhì)的可溶性。對誘導表達條件優(yōu)化的研究顯示：30 ℃條件下表達可以增加PLE1重組蛋白質(zhì)正確折疊的比例，使之以可溶性形式存在，這可能是因為在30 ℃條件下大腸桿菌的生長速率下降，利于對真核蛋白質(zhì)進行翻譯后的修飾和正確折疊；接菌后先用L-Arabinose誘導pGro7表達，使小量分子伴侶pGro7先于重組蛋白質(zhì)存在，可提高輔助效率；與之前D.B?ttcher等用IPTG誘導表達24 h的研究結(jié)果[20]相比，本研究發(fā)現(xiàn)IPTG誘導表達24 h重組蛋白質(zhì)表達量并不是最大，而是誘導6 h后PLE1的產(chǎn)量達到最大，推測可能是因為細菌培養(yǎng)超過6 h后逐漸進入衰退期，代謝產(chǎn)物和有害有毒物累積造成菌液性質(zhì)改變，如酸堿度等，而不利于重組蛋白質(zhì)表達，同時重組蛋白質(zhì)也可能降解。

本研究中，PLE1重組蛋白質(zhì)以可溶性形式在上清中表達。加入蛋白質(zhì)保護劑采用壓力破碎法破碎菌體，在此過程中最大程度地降低了破碎對重組蛋白質(zhì)的損害。由于PLE1重組蛋白質(zhì)中的His-tag可以與 Ni-NTA樹脂結(jié)合，可采用Ni-NTA His·Bind樹脂進行純化，該方法技術(shù)成熟、操作簡便且不影響酶活性。純化過程中發(fā)現(xiàn)洗脫液中咪唑的濃度為500 mmol·L-1時，洗脫效率最高，純化效果最好，提高了PLE1重組蛋白酶的濃度。

根據(jù)檢測PLE酶活性的通用方法[17,18,20]，以p-NPA為底物，檢測PLE1重組蛋白酶的活力為1.24 μmol·mg-1·min-1，表明來源于高等動物的PLE1在原核細胞中實現(xiàn)了功能性表達，其酶活性達到進行后續(xù)水解獸藥研究的要求。

4 結(jié) 論

克隆了包括PLE1在內(nèi)的多種PLE同工酶基因，并在原核細胞-大腸桿菌中實現(xiàn)了PLE1的功能性表達，純化的重組PLE1水解p-NPA的活力為1.24 U，為進一步開展PLE1水解獸藥特性等研究奠定了物質(zhì)基礎，也為PLE同工酶家族其他重要成員的功能性表達及酶活性研究、其他生理功能研究搭建了技術(shù)平臺。

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(編輯 白永平)

Cloning and Functional Expression of Pig Liver Esterase 1 Gene in Prokaryotic Cells

XIAO Qi-ling1，2，LI Peng-hui1，2，YAN Bing-fang3，YANG Lu1，2，WANG Xi-liang1，2，XIAO Yun-cai1，2，LI Zi-li1，2，LIU Mei1，2,BI Ding-ren1，2，SHI De-shi1，2*

(1．StateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology,CollegeofVeterinaryMedicine，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China；2.KeyLaboratoryofDevelopmentofVeterinaryDiagnosticProductsofMinistryofAgriculture,CollegeofVeterinaryMedicine,HuazhongAgricultural
University,Wuhan430070,China;3．DepartmentofBiomedicalSciences，CenterforPharmacogenomicsandMolecularTherapy，UniversityofRhodeIsland，Kingston02881，USA)

In order to obtain active pig liver carboxylesterase 1 (PLE1) and study its function，PLE1 were obtained by RT-PCR and normal PCR from large white pig liver.PLE1 ORF was linked into the prokaryotic expression vector pET15b，and was functional expressed inE.coliOrigamiTM2(DE3) cells which were transformed ahead with pGro7.The target protein was purified and its enzyme activity was tested.The sequencing results showed that total length of PLE1 ORF is 1 686 bp，which coding 562 aa.The SDS-PAGE and Western Blotting results demonstrated that recombinant protein PLE1 was expressed successfully，and the highest amount was acquired after culture in 30 ℃ for 6 h，and most of the protein is soluble，and the recombinant PLE1 hydrolysis activity for p-NPA is 1.24 U.The research results not only provide high purity active PLE1 for the study of PLE1 hydrolysis of veterinary medicine，but also provide the theory basis，technical methods for the function study of other important PLE isoenzymes.

pig liver carboxylesterase 1；functional expression；activity measurement

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.04.020

2014-07-04

國家自然科學基金(31372484)；湖北省自然科學基金(2012FFB02906)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金(2011PY117)

肖啟玲(1989-)，女，四川達州人，碩士，主要從事藥物代謝酶的分子生物學研究，Tel：027-87280032，E-mail：xiaoqilingk@sina.com

*通信作者：石德時，E-mail：rock@mail.hzau.edu.cn

S852

A

0366-6964(2015)04-0650-07