非編碼小RNA (RyhB)調(diào)控禽致病性大腸桿菌毒力相關(guān)基因的分析

尹 磊，祁克宗， 涂 健，周秀紅，劉紅梅，王 曼，張艷娜

(安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥 230036)

非編碼小RNA (RyhB)調(diào)控禽致病性大腸桿菌毒力相關(guān)基因的分析

尹 磊，祁克宗*， 涂 健，周秀紅，劉紅梅，王 曼，張艷娜

(安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥 230036)

以小RNA(RyhB)為研究對象，探索RyhB對禽致病性大腸桿菌相關(guān)毒力基因的調(diào)控研究。采用Red同源重組技術(shù)構(gòu)建APEC野生株(AE17)RyhB的缺失株△RyhB以及構(gòu)建出回復株△RyhB-comp。運用活菌計數(shù)法分別觀察AE17、△RyhB、△RyhB-comp黏附雞胚成纖維細胞DF-1的能力，并且利用Real-time PCR檢測AE17、△RyhB和△RyhB-comp的 8個毒力基因轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果成功構(gòu)建出了基因缺失株△RyhB和回復株△RyhB-comp，△RyhB黏附細胞能力較AE17均有顯著地降低，約為AE17的62.5%，△RyhB-comp較△RyhB黏附能力顯著上升，為△RyhB的1.4倍。同時，Real-time PCR結(jié)果顯示，△RyhB的bcfA、fyuA、tsh、luxS、fimC、ompA毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平均極顯著下降(P<0.01)，其mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別約為AE17的19%、52%、20%、14%、28%、52%；△RyhB的iss、ibeA毒力基因表達水平分別上調(diào)約1.14倍和1.2倍。表明RyhB的缺失能夠減弱APEC黏附DF-1的能力，并且使毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平有所降低。根據(jù)以上結(jié)果，推測RyhB對APEC的毒力具有極其重要的調(diào)節(jié)作用。

禽致病性大腸桿菌； 非編碼小RNA；Red同源重組；RyhB；毒力基因

禽大腸桿菌病(avian colibacillosis)是由致病性大腸桿菌(pathogenicEscherichiacoli)引起的一種傳染病，該病存在于世界各地的家禽群體中。臨床表現(xiàn)為氣囊炎、心包炎、肝周炎、腦炎、腹膜炎、臍炎、輸卵管炎等癥狀，給養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展帶來了嚴重的危害[1]。

非編碼RNA (small non-coding regulatory RNA，sRNA)，又稱小RNA，是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類基因調(diào)節(jié)子，其長度為40～500個核苷酸，在基因組中被轉(zhuǎn)錄，但是不編碼蛋白質(zhì)[2]。它是致病菌諸多調(diào)控網(wǎng)絡的關(guān)鍵組成部分，致病菌進入宿主體內(nèi)后感受到環(huán)境的改變，通過快速調(diào)整自身的毒力基因表達和生理特征來適應變化的環(huán)境，從而利于致病菌在宿主中的侵染和存活，對細菌致病性的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用[3]。

RyhB是目前己知調(diào)控細菌靶mRNA數(shù)目最多的sRNA，它作為一種有效的調(diào)節(jié)分子，對細胞內(nèi)鐵代謝的調(diào)控和對致病菌致病力的調(diào)節(jié)具有重要作用[4-5]。RyhB最初是在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的。隨著研究的深入，在其他細菌中發(fā)現(xiàn)了許多與大腸桿菌RyhB同源的或者功能類似的小分子RNA。該類小分子RNA對細菌致病力的調(diào)節(jié)主要通過影響細菌鐵代謝、生物膜生成、趨化性和耐酸性的方面來實現(xiàn)的[6-7]。霍亂弧菌和大腸桿菌同源性很高，其Fur和鐵負調(diào)控RyhB[8-9]，當RyhB基因缺失后，小鼠體內(nèi)生物膜的形成和趨化性能力喪失，當加入鐵后其能力又恢復[10-12]。所以RyhB本身不是毒力形成所必須的，而后兩者是毒力決定因子。RyhB可抑制VirB來調(diào)控毒力，VirB是重要的毒力致病基因(ipa、mxi、spa)激活劑。對于寄居在腸道中的弗氏志賀菌，其毒力致病因子的表達是通過RyhB解除對VirB的抑制，從而有利于細菌在腸道的感染[13]。這些都表明RyhB的功能與細菌的毒力有關(guān)，但是RyhB與APEC毒力相關(guān)的靶mRNA，以及對APEC毒力的影響卻還不清楚。

因此，本試驗以sRNA(RyhB)為研究對象，通過Red重組系統(tǒng)構(gòu)建RyhB的缺失株，并構(gòu)建了可回復表達的回復株，以此來研究RyhB缺失對禽致病性大腸桿菌的毒力基因表達以及對細胞黏附能力的影響，為RyhB對禽致病性大腸桿菌毒力調(diào)控機制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與試劑盒

PremixTaq、PrimeSTAR Max Premix(2x)、DNA Marker、DNA膠回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、T4 DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ、Hind Ⅲ)均購自大連寶生物公司；TransStart Top Green qPCR SuperMix、EasyPureTMRNA Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 菌株與質(zhì)粒

選取的同源重組出發(fā)菌株為經(jīng)過分離鑒定的大腸桿菌AE17(從患有敗血癥的禽源分離，經(jīng)傳代培養(yǎng)，血清凝集試驗以及一系列生化試驗后，鑒定為O2血清型的大腸桿菌)。Red同源重組所用到的質(zhì)粒：pKD46(同源重組的協(xié)助質(zhì)粒，可在阿拉伯糖的誘導下表達3個λ噬菌體重組酶——Gam、Beta和Exo，具有溫度敏感性，在溫度高于37 ℃時會丟失)；pKD3(氯霉素抗性基因PCR擴增模板，并且氯霉素抗性基因兩端攜帶可被FLP重組酶識別的FRT位點)；pCP20(溫度敏感型，42 ℃可表達FLP重組酶，用于消除FRT位點間的氯霉素抗性基因)。以上質(zhì)粒均為中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所禽病研究室惠贈。pSTV28用于構(gòu)建回復質(zhì)粒，購自大連寶生物公司。

1.3 禽致病性大腸桿菌缺失株△RyhB和回復株△RyhB-comp的構(gòu)建

1.3.1 PCR引物的設計 根據(jù)GenBank中已發(fā)布的APEC O1型基因序列設計引物，對AE17、RyhB-IN、RyhB-OUT進行鑒定。根據(jù)測序結(jié)果設計用于red同源重組的引物RyhB-UP、RyhB-Down、PKD3-Cm-lap-RyhB，其中RyhB-lap-cm-UP和RyhB-lap-cm-Down下劃線的序列與質(zhì)粒pKD3-F、pKD3-R上的氯霉素抗性基因的序列互補，而PKD3-Cm-lap-RyhB下劃線序列與RyhB-UP-R、RyhB-Down-F的基因序列互補。用于構(gòu)建回復株的AE17-RyhB下劃線分別為保護性堿基和酶切位點(EcoRⅠ、Hind Ⅲ)。引物序列見表1。

表1 用于基因敲除和回復的引物序列

Table 1 Primers used in the gene deletion and complemented

引物名稱Primer引物序列(5′?3′)Sequence(5′?3′)大小/bpSizeAE17?FGAGCGATCTTGGCTATACC1023AE17?RGTGAAGCTATCTAACAACGGRyhB?IN?FACCCGGCTGGCTAAGTAATAC157RyhB?IN?RCTTTCAAATGCGAGTCAAATGRyhB?OUT?FCATAATCGCCCATCTCTGG1999RyhB?OUT?RCTTCCTTGTTGTTCTCCCGRyhB?UP?FGACAATCTCTCCCAGCTTG568RyhB?lap?cm?UP?RCCAGCCTACAGACCTTTCGTTCTCAATTTPKD3?Cm?lap?RyhB?FACGAAAGGTCTGTAGGCTGGAGCTGCTT1033PKD3?Cm?lap?RyhB?RTTTCAACATCCATATGAATATCCTCCTTAGTTCRyhB?lap?cm?Down?FTATTCATATGGATGTTGAAAGGGACATTT547RyhB?Down?RGGCACTATCTTACTTCACCCGpKD46?FGATACCGTCCGTTCTTTCCTT888pKD46?RTGATGATACCGCTGCCTTACTpCP20?FTTAGTGGTTGTAAAAACACCTGACC409pCP20?RGTTAGCGTTGAAGAATTTAGCCCAE17?RyhB?FGCCGAATTCTACTCGAAGTGGCTGTCCG676AE17?RyhB?RGCCAAGCTTGGCACCTGTAGCGTGTTGTAM13?FCAGGAAACAGCTATGAC676M13?RGTTTTCCCAGTCACGAC

1.3.2 禽致病性大腸桿菌缺失株△RyhB的構(gòu)建

1.3.2.1RyhB同源重組片段構(gòu)建：利用Red 同源重組的方法對AE17中的RyhB進行敲除構(gòu)建。首先，用RyhB-UP-F、RyhB-lap-cm-UP-R和RyhB-lap-cm-Down-F、RyhB-Down-R以及PKD3-Cm-lap-RyhB-F、PKD3-Cm-lap-RyhB-R三對引物擴增出RyhB上游、下游同源臂及氯霉素抗性片段，進行膠回收。然后，運用Overlap的方法，將RyhB上下游同源臂及氯霉素抗性片段等摩爾混合，以此混合模板為DNA模板，用RyhB的上游引物(RyhB-UP-F)及下游引物(RyhB-Down-R)擴增，擴增出來的RyhB上游同源臂-cm-下游同源臂即為用于Red同源重組片段。

1.3.2.2 感受態(tài)細胞的制備和電轉(zhuǎn)化：將電轉(zhuǎn)化有pKD46的AE17菌株接種于2 mL LB液體培養(yǎng)基(氨芐青霉素質(zhì)量濃度為100 mg·mL-1)，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜作為種子液，次日按1∶100比例接種至100 mL LB培養(yǎng)基， 28 ℃振蕩培養(yǎng)至 OD600 nm為0.2～0.3，加入L-阿拉伯糖至終濃度為20～30 mmol·L-1，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600 nm為0.5～0.6，使 pKD46充分表達Exo、Bet和Gam三個重組酶。50 mL離心管分裝，冰浴20 min，4 ℃ 6 000 r·min-1離心5 min，棄培養(yǎng)基；然后用預冷的雙蒸水重懸，4 ℃ 6 000 r·min-1離心5 min，重復洗滌2次；最后用預冷的10%甘油離心洗滌1次，最后用1/100體積的甘油重懸，濃縮成1 mL的感受態(tài)細胞，每管分裝100 μL，存放在-70 ℃冰箱待用。

取制備好的100 μL感受態(tài)細胞與1 μg擴增出的RyhB上游同源臂-cm-下游同源臂PCR產(chǎn)物混勻，將混合物加入冰上預冷的0.2 cm Bio-Rad電擊杯中進行電轉(zhuǎn)化，電擊條件為電壓 2.5 kV，電阻200 Ω，脈沖25 μF，電擊。電擊后迅速加入900 μL 預熱的SOC培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)1 h，常溫6 000 r·min-1離心5 min，取200 μL SOC重懸后涂于氯霉素平板 (氯霉素34 μg·mL-1)。37 ℃培養(yǎng)24 h后，篩選陽性菌落，用RyhB-IN-F/RyhB-IN-R、RyhB-OUT-F/ RyhB-OUT-R兩對引物進行陽性氯霉素重組子的鑒定，以確定AE17是否敲除了RyhB基因。

1.3.2.3 氯霉素抗性基因的消除：鑒定正確的陽性重組子按上述方法制成感受態(tài)細胞，將pCP20質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化導入該感受態(tài)細胞中，涂布于含氨芐和氯霉素雙抗性 LB 平板上，28 ℃過夜培養(yǎng)，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。然后將獲得的陽性轉(zhuǎn)化子接種于無抗性的LB培養(yǎng)基中，42 ℃培養(yǎng)過夜，熱誘導 FLP 重組酶表達，通過重組刪除 FRT位點間的序列，只保留一個 FRT位點，用RyhB-IN-F/RyhB-IN-R、RyhB-OUT-F/ RyhB-OUT-R進行PCR驗證。

1.3.3 禽致病性大腸桿菌回復株△RyhB-comp的構(gòu)建

1.3.3.1RyhB基因擴增：根據(jù)已發(fā)布的APEC O1型基因序列設計AE17-RyhB-F/AE17-RyhB-R引物，用PCR擴增出RyhB完整片段，膠回收目的片段待用。

1.3.3.2 RyhB-pSTV28回復質(zhì)粒的構(gòu)建：將1.3.3.1所得RyhB目的片段和pSTV28載體分別用EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，然后用T4連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，氯霉素抗性平板篩選陽性克隆。

1.3.3.3 回復質(zhì)粒的鑒定：挑單克隆接種含CM抗性的LB培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)，采用菌液PCR的方法，以檢測引物m13-F/m13-R擴增，電泳鑒定，以確定獲得回復質(zhì)粒pSTV28-RyhB。

1.3.3.4 回復株的構(gòu)建：將回復質(zhì)粒pSTV28-RyhB電擊導入△RyhB，經(jīng)CM抗性篩選獲得回復株△RyhB-comp，用RyhB-OUT-F/RyhB-OUT-R和m13-F/m13-R兩對引物進行鑒定。

1.4 qRT-PCR檢測缺失株和回復株毒力基因轉(zhuǎn)錄水平的變化

1.4.1 引物的設計與合成 根據(jù)GenBank中已發(fā)布的內(nèi)參基因dnaE，同時選取禽致病性大腸桿菌毒力基因bcfA、fyuA、tsh、iss、luxS、fimC、ompA、ibeA，用 Primer(Version 5.0)軟件分析并設計特異性引物。引物序列見表2。

1.4.2 細菌總RNA的提取和cDNA的合成 挑取禽致病性大腸桿菌AE17、△RyhB和△RyhB-comp的單菌落，于液體培養(yǎng)基37 ℃過夜培養(yǎng)；第2天轉(zhuǎn)接于相應的LB培養(yǎng)基或氯霉素抗性LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期，取適量的菌液，4 ℃、12 000 g離心2 min，收集菌液，徹底去除所有培養(yǎng)基上清，用含有溶菌酶的100 μL TE緩沖液(1 mg lysozyme溶于100 μL TE中)徹底重懸菌體。參照EasyPureTMRNA Kit說明書提取三組細菌的總RNA。核酸蛋白濃度測定儀檢測RNA濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。釆用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser消除提取產(chǎn)物中的基因組DNA并對RNA進行反轉(zhuǎn)錄?；蚪MDNA去除反應體系20 μL：5×gDNA Eraser Buffer 4.0 μL，gDNA Eraser2.0 μL，Total RNA 1.0 μg，RNase-free ddH2O補至20 μL。42 ℃水浴2 min后迅速置于冰上；反轉(zhuǎn)錄反應體系40 μL：PrimerScript RT Enzyme MIX 2.0 μL，RTprimer MIX 2.0 μL，5×PrimerScript Buffer2 8.0 μL，RNase-free ddH2O 8.0 μL，上一步除去DNA的總RNA 20.0 μL。37 ℃水浴 15 min后，85 ℃水浴5 s。將合成的cDNA保存于-20 ℃。1.4.3 qRT- PCR反應 采用TransStart Top Green qPCR SuperMix熒光定量試劑盒，用實時熒光定量PCR對APEC毒力基因的表達進行相對定量的檢測。將各樣品的cDNA 10倍系列稀釋，反應體系20 μL：Forward Primer(10 μmol·L-1)0.4 μL，Reverse Primer(10 μmol·L-1)0.4 μL，2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10.0 μL，Passive Reference Dye(50×)0.4 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 7.8 μL。擴增條件：50 ℃2 min，95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s；60 ℃熒光信號采集1 min，循環(huán)次數(shù)40次，測試樣品重復三管；熔解曲線分析并鑒定引物特異性：95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。數(shù)據(jù)采用2-△△CT法計算毒力基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。

1.5 AE17、△RyhB、△RyhB-comp對DF-1細胞的黏附試驗

1.5.1 細菌的培養(yǎng)和處理 將菌株AE17、△RyhB和△RyhB-comp接種于相應的LB培養(yǎng)基或氯霉素抗性LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，離心收集菌體并用無菌PBS洗滌3～4次，最后用無抗生素DMEM營養(yǎng)液重懸細菌待用。

表2 用于熒光定量的引物序列

Table 2 Primers used in the Real time PCR

目標基因Gene引物名稱Primer引物序列(5′—3′)Sequence(5′—3′)大小/bpSizednaEdnaE?FdnaE?RGATTGAGCGTTATGTCGGAGGCGCCCCGCAGCCGTGAT80luxSluxS?FluxS?RACGCCATTACCGTTAAGATGAGTGATGCCAGAAAGAGGGA81Tshtsh?Ftsh?RGCACGAACTGGGAAGTATGGAGGCATAGAAACCACCACCCC118ibeAibeA?FibeA?RTTGTTTTGGCGGAATGATGCATTGATTTTGCCGTTTCTTCT118Ississ?Fiss?RCCGACAGCAGTAACACCAAAGGTTCTGCACCGCCAACAAATT105ompAompa?Fompa?RTCCAGAGCAGCCTGACCTTCGCTGAGCCTGGGTGTTTCCT152Fimcfimc?Ffimc?RGCCGATGGTGTAAAGGATGGAACTTTCCCGATCCTGTGGC127fyuAfyuA?FfyuA?RTTGGCGACCAGGGTAAGAGCAGACCCGCAGTAGGCACGAT145bcfAbcfA?FbcfA?RTGACGCTGCCTGTTCTGTTTGCAGTCTTCCAGTTTGATGGTG136

1.5.2 DF-1細胞的培養(yǎng)和處理 將液氮中凍存的DF-1細胞取出在37 ℃水浴中溶解1～2 min，使其復溫；迅速加入含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM營養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接于細胞培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的條件下在細胞培養(yǎng)箱中進行復蘇傳代。當細胞狀態(tài)良好并穩(wěn)定時，接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入200 μL約含105個細胞懸液培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察，當細胞長滿孔底時，吸去培養(yǎng)基并用無菌PBS洗滌3～4次備用。

1.5.3 細胞黏附試驗 將處理好的三組細菌以感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=200分別加入到DF-1細胞中，對照組加入等體積的無抗生素DMEM，每個菌株重復3孔。400 r·min-1低速離心5 min，使細菌沉降到孔底與細胞充分結(jié)合。37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，無菌PBS洗5次，然后每孔加入200 μL 0.1% Triton X-100，室溫下作用10 min，用于裂解細胞，取細胞液倍比稀釋，用掛板計數(shù)法37 ℃培養(yǎng)過夜后進行細胞計數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 禽致病性大腸桿菌缺失株△RyhB的鑒定

將含氯霉素抗性基因的△RyhB-cat PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)入含質(zhì)粒pKD46的AE17中，通過氯霉素抗性LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆，挑取陽性菌接種LB液體培養(yǎng)基，運用PCR檢測的方法鑒定缺失株△RyhB-cat是否構(gòu)建成功。第一次重組后，以RyhB-IN-F/RyhB-IN-R為引物， AE17未擴增出目的片段；而以 RyhB-OUT-F/RyhB-OUT-R為引物，AE17擴增出2 875 bp大小的目的片段。將質(zhì)粒pCP20導入一次重組菌，于28 ℃培養(yǎng)并篩選陽性克隆，將鑒定正確的陽性克隆接種于LB液體培養(yǎng)基，42 ℃過夜培養(yǎng)，消除質(zhì)粒pCP20。運用PCR檢測的方法鑒定缺失株△RyhB是否構(gòu)建成功，結(jié)果如圖1，其中以RyhB-IN-F/RyhB-IN-R為引物，第二次重組后，AE17未擴增出目的片段；而以 RyhB-OUT-F/RyhB-OUT-R為引物，第二次重組后，AE17擴增出1 842 bp大小的目的片段。

M.10 000 bp DNA相對分子質(zhì)量標準；1.RyhB-IN-F/RyhB-IN-R PCR產(chǎn)物(157 bp)；2.RyhB-OUT-F/RyhB-OUT-R PCR產(chǎn)物(1 999 bp)；3.RyhB-IN-F/RyhB-IN-R，第二次重組產(chǎn)物；4.RyhB-OUT-F/RyhB-OUT-R，第二次重組PCR產(chǎn)物(1 842 bp)M.10 000 bp DNA marker；1.RyhB-IN-F/RyhB-IN-R PCR amplification(157 bp)；2.RyhB-OUT-F/ RyhB-OUT-R PCR amplification (1 999 bp)；3.RyhB-IN-F/RyhB-IN-R，the PCR amplification of second crossing over；4.RyhB-OUT-F/RyhB-OUT-R，the PCR amplification of second crossing over (1 842 bp) 圖1 二次重組菌AE17△RyhB的PCR鑒定Fig.1 Identification of AE17△RyhB mutant by PCR

2.2 禽致病性大腸桿菌回復株△RyhB-comp的鑒定

將構(gòu)建的回復質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，將鑒定正確的回復質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入相應的缺失株，挑取陽性轉(zhuǎn)化菌株即為回復菌株。PCR檢測方法鑒定回復株△RyhB-comp構(gòu)建成功，如圖2。

2.3RyhB調(diào)控毒力基因的表達量變化

內(nèi)參基因和毒力基因的熔解曲線分析結(jié)果均具有良好的特異性，標準曲線的擴增效率均為95% 以上，可以運用2-△△CT法對毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平進行分析。

M.10 000 bp DNA相對分子質(zhì)量標準；1.RyhB-OUT-F/ RyhB-OUT-R PCR產(chǎn)物(1 842 bp)；2.m13-F/m13-R PCR產(chǎn)物(676 bp) M.10 000 bp DNA marker；1.RyhB-OUT-F/RyhB-OUT-R PCR amplification(1 842 bp)；2.m13-F/m13-R PCR amplification (676 bp)圖2 回復株△RyhB-comp的PCR鑒定Fig.2 Identification of △RyhB-comp by PCR

對AE17、△RyhB和△RyhB-comp毒力基因的mRNA轉(zhuǎn)錄分析顯示，△RyhB的bcfA、fyuA、tsh、luxS、fimC、ompA毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平均極顯著下降(P<0.01)，其mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別約為AE17的19%、52%、20%、14%、28%、52%；△RyhB的iss、ibeA毒力基因表達水平上調(diào)，分別約為AE17的1.14倍和1.2倍?！鱎yhB-comp的bcfA、fyuA、tsh、luxS毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平相比缺失株，其回復力和缺失株無明顯差異(P>0.05)；△RyhB-comp的iss、ibeA毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平相比缺失株，其回復力極顯著下降(P<0.01)，分別為62%、64%；△RyhB-comp的fimC和ompA毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平相比缺失株，其回復力極顯著上升(P<0.01)，分別為69%、48%(圖3)。

2.4 DF-1細胞黏附試驗

對DF-1細胞的黏附試驗結(jié)果顯示，AE17菌株對DF-1的黏附能力為24×105CFU·孔-1；△RyhB相比野生株，其黏附能力極顯著減弱(P<0.01)，為13×105CFU·孔-1；△RyhB-comp相比缺失株，其黏附能力顯著恢復(P<0.05)，為20×105CFU·孔-1(圖4)。

3 討 論

本試驗基于λRed重組系統(tǒng)，由PCR反應介導的抗性基因片段與目的基因發(fā)生同源重組，用抗性基因替換染色體中的目的基因，該方法不需要構(gòu)建打靶質(zhì)粒，縮短了試驗的周期。因其方法具有試驗周期短、重組效率高、操作方便以及可以在任何位置進行點突變、缺失、插入等優(yōu)點，所以逐漸成為探索基因功能的有效手段[14]。sRNA的長度一般為50～200 bp，一步敲除法往往很難成功，本試驗中RyhB是177 bp大小的片段，使用一步法敲除重組效率低，未能成功，但使用二步敲除法，通過構(gòu)建上下游同源臂與抗性基因片段連接，同源重組效率增強，成功構(gòu)建了RyhB的敲除株，為研究sRNA功能提供了有力的工具。

圖3 AE17、△RyhB和△RyhB-comp各毒力基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平Fig.3 The virulence genes mRNA levels of AE17，△RyhB和△RyhB-comp strains

圖4 AE17、△RyhB和△RyhB-comp對DF-1細胞的黏附試驗Fig.4 DF-1 cells adherence assays of AE17、△RyhB和△RyhB-comp strains

毒力因子是指通過吸附在宿主細胞上，進而破壞宿主細胞代謝或阻撓宿主免疫反應來直接影響宿主，從而促進細菌本身生存、生長和傳播的因子。本試驗中選取的毒力因子包括密度感應系統(tǒng)、鐵攝取調(diào)控系統(tǒng)、外膜蛋白、侵襲素、黏附素以及菌毛亞單位等，這些毒力因子都是APEC通過在宿主內(nèi)黏附、侵襲、抗吞噬以及宿主細胞毒性來完成其致病過程所必需的。而研究表明，病原菌 sRNA在調(diào)控細菌代謝尤其是毒力基因的表達上具有十分重要的作用[15]。因此通過構(gòu)建缺失株△RyhB和回復株△RyhB-comp，開展RyhB在APEC中的毒力相關(guān)基因的表達和細胞的黏附能力等方面的研究，其目的在于揭示RyhB對APEC毒力的影響，為防控疾病和開發(fā)sRNA核酸藥物提供新的靶點。

Real-time PCR結(jié)果顯示，△RyhB的毒力基因bcfA、fyuA、tsh、luxS、fimC、ompA表達水平均下調(diào)，推測RyhB可能通過調(diào)控外膜蛋白、黏附素相關(guān)因子、與攝鐵相關(guān)因子、菌毛及其它未發(fā)現(xiàn)的病原相關(guān)基因的表達來影響細菌的毒力；DF-1細胞黏附試驗結(jié)果表明△RyhB的黏附能力顯著低于AE17，而△RyhB-comp的黏附能力相比較△RyhB有所回復。黏附素是存在于細菌表面的一些特殊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，它通過與宿主細胞表面受體結(jié)合，避免被宿主清除體外，是病原菌重要的毒力因子之一。它與致病性密切相關(guān)。研究表明ompA和bcfA、fimC基因編碼相關(guān)黏附因子，對細菌黏附宿主細胞的能力有一定的影響[16]，推測ompA、bcfA、fimC基因轉(zhuǎn)錄水平的下降可能會導致APEC的黏附能力下降，與試驗結(jié)果相一致。

綜合試驗結(jié)果，RyhB的缺失對APEC毒力的降低是顯著的，提示低致病性、無抗性的RyhB缺失株是否可以作為新型疫苗，來防控APEC的感染還有待進一步的研究和探討。同時，RyhB對細菌毒力的調(diào)控往往不是單方面的，它可能是多種毒力基因、調(diào)控系統(tǒng)同時作用；MicA在基因組中的位置與群體感應信號分子AL-2合成酶luxS毗鄰，它是生物膜形成過程中十分重要的sRNA分子，其多種靶基因如phoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)和外膜蛋白ompA等均與生物膜的形成有關(guān)[17]。揭示了RyhB對APEC致病性調(diào)控的過程中，可能涉及了多個毒力基因，多個調(diào)控系統(tǒng)的共同作用，其與phoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)是否存在著必然的關(guān)系，共同調(diào)控APEC的致病性以及RyhB在致病菌調(diào)控網(wǎng)絡中以何種機制觸動其發(fā)揮作用，將是我們以后需要研究解決的問題。

4 結(jié) 論

成功構(gòu)建禽致病性大腸桿菌的RyhB缺失株和回復表達株，RyhB的缺失能顯著地降低禽致病性大腸桿菌毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平和對DF-1細胞的黏附能力，為探明RyhB對禽致病性大腸桿菌毒力調(diào)控機制的研究提供理論依據(jù)。

[1] SCHOULER C，SCHAEFFER B，BRéE A，et al.Diagnostic strategy for identifying avian pathogenicEscherichiacolibased on four patterns of virulence genes[J].JClinMicrobiol，2012，50(5):1673-1678.

[2] WASSARMAN K M，ZHANG A，STORZ G.Small RNAs inEscherichiacoli[J].TrendsMicrobiol，1999，7(1)：37-45.

[3] WATERS L S，STORZ G.Regulatory RNAs in bacteria[J].Cell，2009，136(4)：615-628.

[4] MASSé E,VANDERPOOL C K，GOTTESMAN S.Effect of RyhB small RNA on global iron use inEscherichiacoli[J].JBacteriol，2005，187(20):6962-6971.

[5] VECEREK B，MOLL I，BLSI U.Control of Fur synthesis by the non-coding RNA RyhB and iron-responsive decoding[J].EMBOJ，2007，26(4):965-975.

[6] MASSé E，GOTTESMAN S.A small RNA regulates the expression of genes involved in iron metabolism inEscherichiacoli[J].ProcNatlAcadSciUSA，2002，99(7) ：4620-4625.

[7] WASSARMAN K M，REPOILA F，ROSENOW C，et al.Identification of novel small RNAs using comparative genomics and microarrays[ J ].GenesDev，2001，15(13):1637-1651.

[8] MEY A R，CRAIG S A，PAYNE S M.Characterization ofVibriocholeraeRyhB：the RyhB regulon and role of ryhB in biofilm formation[J].InfectImmun，2005，73(9):5706-5719.

[9] DAVIS B M，QUINONES M，PRATT J，et al.Characterization of the small untranslated RNA RyhB and its regulon inVibriocholerae[J].JBacteriol，2005,187(12):4005-4014.

[10] OGLESBY A G，MURPHY E R，IYER V R，et al.Fur regulates acid resistace in Shigella flexneri via RyhB and ydeP[J].MolMicrobiol，2005，58(5)：1354-1367.

[11] WILDERMAN P J，SOWA N A，F(xiàn)ITZGERALD D J，et al.Identification of tandem duplicate regulatory small RNAs in Pseudomonas aeruginosa involved in iron homeostasis[J].ProcNatlAcadSciUSA，2004,101(26)：9792- 9797.

[13] MURPHY E R，PAYNE S M.RyhB，an iron-responsive small RNA molecule，regulates Shigella dysenteriae virulence[J].InfectImmun，2007，75(7)：3470-3477.

[14] MUYRERS J P，ZHANG Y,STEWART A F.Techniques：Recombinogenic engineering-new options for cloning and manipulating DNA[J].TrendsBiochemSci，2001，26(5):325-331.

[15] GRIPENLAND J，NETTERLING S，LOH E，et al.RNAs：regulations of bacterial virulence[J].NatRevMicrobiol，2010，8(12):857-866.

[16] JONES C H，PINKNER J S，NICHOLES A V，et al.FimC is a periplasmic PapD-like chaperone that directs assembly of type 1 pili in bacteria[J].ProcNatlAcadSciUSA，1993，90(18):8397-8401.

[17] KINT G，DE C D，MARCHAL K，et al.The small regulatory RNA molecule MicA is involved inSalmonellaentericaserovar Typhimurium biofilm formation[J].BMCMicrobiol，2010，10:276.

(編輯 白永平)

Analysis of the Regulation of Small Non-coding RNA (RyhB) on Avian PathogenicEscherichiacoliVirulence-related Genes

YIN Lei，QI Ke-zong*，TU Jian，ZHOU Xiu-hong，LIU Hong-mei，WANG Man，ZHANG Yan-na

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036，China)

Taking small RNA(RyhB)as the object of study，the experiment explored the regulation ofRyhBon avian pathogenicEscherichiacoli(APEC) virulence-related genes.The Red homologous recombination method was used to construct theRyhBgene deletion strain (△RyhB) and the complemented strain (△RyhB-comp) by transforming the fusion plasmid pSTV28-RyhB into △RyhB.Viable bacteria counting method was used to evaluate the effects of AE17，△RyhB and △RyhB-comp on the capability of APEC to adhere and invade DF-1 cell.Their effects on the mRNA levels of the eight virulence genes were analyzed by Real-time PCR.The results showed that APEC strains △RyhB and △RyhB-comp were constructed successfully.The adherence of △RyhB was decreased by 62.5% compared to AE17，and that of △RyhB-comp was increased about 1.4 folds compared to △RyhB.Real-time PCR revealed that the transcription ofbcfA,fyuA，tsh，luxS，fimC，ompAgenes of △RyhB were decreased by 19%，52%，20%，14%，28% and 52%，respectively；while theissandibeAgenes were increased about 1.14 folds and 1.2 folds respectively.It showed that the deletion of RyhB can reduce the adhesive power of APEC to DF-1 cells and decrease the transcription of virulence genes.Our study demonstrates thatRyhBplays a very important role in regulating the virulence of APEC.

avian pathogenicEscherichiacoli；small non-coding RNA；Red recombination；RyhB；the virulence genes

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.017

2014-11-24

國家自然科學基金項目(31372402)

尹 磊(1989-)，男，安徽巢湖人，碩士，主要從事動物病理學研究，E-mail：ylshouhu1989@163.com

*通信作者：祁克宗，教授，E-mail：qkz@ahau.edu.cn

S852.612

A

0366-6964(2015)08-1409-08