內(nèi)蒙古地區(qū)豬腹瀉相關(guān)病毒的檢測(cè)與分析

劉艷成，杜雅楠*，吳衛(wèi)杰，王雪飛，蘆 婷，劉丹丹

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018； 2.興安盟動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，烏蘭浩特 137400)

內(nèi)蒙古地區(qū)豬腹瀉相關(guān)病毒的檢測(cè)與分析

劉艷成1，杜雅楠1*，吳衛(wèi)杰2，王雪飛1，蘆 婷1，劉丹丹1

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018； 2.興安盟動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，烏蘭浩特 137400)

旨在明確引起內(nèi)蒙古地區(qū)豬腹瀉的主要相關(guān)病毒及其流行特點(diǎn)，為該病的防控提供依據(jù)。采用多重RT-PCR方法對(duì)從內(nèi)蒙古8個(gè)盟市采集的394份腹瀉糞樣進(jìn)行豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒(PoRV)三種病毒的檢測(cè)；對(duì)部分 PCR檢測(cè)呈陽性的病料進(jìn)行PEDVM基因的克隆、測(cè)序，并與國內(nèi)外已報(bào)道的48條M基因序列進(jìn)行比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析。檢測(cè)結(jié)果表明：PEDV、PoRV陽性率分別為63.96%、2.03%,未檢測(cè)到TGEV；PEDV和PoRV混合感染率為2.03%；各日齡豬群均可發(fā)病，但以未斷乳仔豬和哺乳母豬感染率較高；遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明：CH/NMG/XLGL分離株與CV777等經(jīng)典毒株親緣關(guān)系較近，位于G2分支上；其余7條分離毒株與2012年以來國內(nèi)多個(gè)省市的流行毒株及泰國、韓國、俄羅斯、越南等鄰國的流行毒株位于G1-1分支上，特別是與美國2013—2014年流行的毒株親緣關(guān)系更為密切，核苷酸序列相似性為99.5%～100%。從2013年至今導(dǎo)致內(nèi)蒙古地區(qū)豬腹瀉的病毒主要是PEDV，其次是PoRV；不同日齡的豬群均可感染，以未斷乳的仔豬感染最為嚴(yán)重；獲得的大部分流行毒株與我國2012年至今的大部分省市的流行毒株親緣性較高，但與我國2007年以前分離的內(nèi)蒙毒株、疫苗株、經(jīng)典毒株相距較遠(yuǎn)，并存在堿基突變的情況。

豬流行性腹瀉病毒；豬傳染性胃腸炎病毒；豬輪狀病毒；RT-PCR；M基因；內(nèi)蒙古

豬腹瀉是豬場(chǎng)常見的一類豬腸道病癥候群，其既可由飼料、環(huán)境和管理等非傳染性因素導(dǎo)致，也可由細(xì)菌、病毒、寄生蟲等傳染性因素引起，其中又以病毒性腹瀉的危害最為嚴(yán)重。病毒性腹瀉的病因十分復(fù)雜，目前研究表明主要是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、豬輪狀病毒(porcine rotavirus，PoRV)三種病毒單一或混合感染所致[1]。

近幾年，國內(nèi)豬病毒性腹瀉的發(fā)病率明顯上升，呈現(xiàn)由南向北擴(kuò)散的趨勢(shì)。流行規(guī)律發(fā)生很大的變化，有報(bào)道稱該病不再呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性，部分豬場(chǎng)夏季也能發(fā)生本病的流行[2]。從2010年10月至今，我國十幾個(gè)省份均有流行性腹瀉的發(fā)生，數(shù)百萬頭仔豬死于該病，病死率高達(dá)80%～100%，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。美國自2013年5月豬流行性腹瀉首次暴發(fā)以來，已迅速蔓延至30多個(gè)州，波及4 000多個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)，累計(jì)死亡仔豬超過800萬頭。近日，豬流行性腹瀉又洗劫日本，截至到2015年1月中旬已造成40多萬頭豬死亡，疫情還在進(jìn)一步蔓延。此外加拿大、墨西哥、哥倫比亞、多米尼加等國也相繼暴發(fā)此病，歐洲多國也開始研究防止PEDV傳入的策略[4]。

目前，內(nèi)蒙古地區(qū)豬病毒性腹瀉時(shí)有發(fā)生，但尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，特別是近幾年引起豬腹瀉的主要病原，流行狀況以及是否存在混合感染等問題都有待進(jìn)一步的調(diào)查研究。本研究旨在通過對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)豬腹瀉相關(guān)病毒的檢測(cè)，明確引起內(nèi)蒙古地區(qū)豬病毒性腹瀉的主要病原，為該病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒

PEDV、TGEV購自中國普通病毒保藏中心；PoRV由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院張彥明老師饋贈(zèng)。

1.2 病料

腹瀉糞樣采自內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市(CF)、通遼市(TL)、包頭市(BT)、呼倫貝爾市(HLBE)、巴彥淖爾市(BYNE)、鄂爾多斯市(EEDS)、錫林郭勒盟(XLGL)、呼和浩特市(HHHT)等地的腹瀉豬群，共計(jì)394份。

1.3 主要試劑

RNAiso plus、DL2000 DNA Marker、PremixTaq購自寶生物工程(大連)有限公司；TIANScript RT Kit、TIANgel Midi Purification Kit、pGM-T Ligation Kit、TIANprep Mini Plasmid Kit購于TIAN GEN有限公司；Agarose 購自Invitrogen公司；其他試劑均為分析純。

1.4 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank上收錄的PEDV的M基因序列(JX435317)、TGEV的N基因序列(GQ374559)、PoRV的VP6基因序列(JN605419)，利用Primer Premier 5.0、Oligo6.0設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物(表1)，引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.5 病料處理及RNA的提取

取腹瀉病豬的糞便用PBS做10倍稀釋，渦旋器上充分振蕩混勻，反復(fù)凍融3次，4 ℃ 3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min，收集上清液，直接提取RNA或-70 ℃長期保存。

采用Trizol法提取糞便中的總RNA，具體步驟如下：吸取上清液300 μL，加入RNAiso Plus 1 500 μL，充分混勻。冰上靜置7 min。4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min。吸取上清液，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入氯仿300 μL，劇烈振蕩20 s，冰上靜置13 min。4 ℃ 13 000 r·min-1離心15 min。吸取上清液至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，冰上靜置10 min。4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min。小心棄去上清，沿管壁加入75%的乙醇(DEPC水配制)1 000 μL，上下顛倒洗滌離心管，4 ℃ 7 500 r·min-1離心5 min后小心棄去乙醇。低溫干燥沉淀2～5 min，加入30 μL無酶水溶解沉淀，待RNA 沉淀完全溶解后直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄或于-70 ℃保存。

表1 引物序列及擴(kuò)增長度

Table 1 Primer sequences and length of specific fragment

病毒Virus引物序列PrimersequenceG+C含量/%ContentofG+C擴(kuò)增長度/bpLengthofspecificfragmentPEDVP1：5′?CTATTCCCGTTGATGAGGTG?3′P2：5′?GCTGAGTAGTCGCCGTGTT?3′50．057．9610TGEVP3：5′?CCCCATAACCCTCCAAC?3′P4：5′?GCAACCCAGACAACTCC?3′58．858．8238PoRVP5：5′?GGCTTTTAAACGAAGTCTTC?3′P6：5′?GGTCACATCCTCTCACTA?3′40．050．01356

1.6 反轉(zhuǎn)錄及多重RT-PCR體系的構(gòu)建

參照TIANScript RT Kit的使用說明，將1.5中提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；利用設(shè)計(jì)的三對(duì)特異性引物進(jìn)行多重RT-PCR的擴(kuò)增，陽性對(duì)照以PEDV、TGEV、PoRV的混合cDNA為模板，PCR反應(yīng)總體系為25 μL：PremixTaq12.50 μL、cDNA模板6.50 μL、PEDV上下游引物各0.50 μL、TGEV上下游引物各0.80 μL、PoRV上下游引物各1.0 μL、補(bǔ)充ddH2O 1.40 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物8 μL，于10 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.7 臨床糞樣的檢測(cè)

應(yīng)用1.6所建立的多重RT-PCR方法，檢測(cè)來自內(nèi)蒙古8個(gè)盟市的394份腹瀉糞樣中的PEDV、TGEV、PoRV，了解三種病毒在內(nèi)蒙古地區(qū)的流行狀況。

1.8 目的基因克隆及測(cè)序

根據(jù)PCR檢測(cè)結(jié)果，對(duì)部分PCR檢測(cè)為陽性的產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，具體操作參見TIANgel Midi Purification Kit。將已純化的目的基因與pGM-T載體16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至100 μL的TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min后，迅速置于42 ℃水浴90 s，立即冰浴3 min。緩慢加入890 μL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 150 r·min-1振蕩培養(yǎng)45 min。3 000 r·min-1離心5 min，棄去部分上清，吸取剩余的150 μL菌液滴加到LB固體培養(yǎng)基上(含有20 μL 50 ng·mL-1的Amp+、16 μL 50 ng·mL-1的IPTG、40 μL 20 mg·mL-1的X-Gal)，玻璃棒涂布均勻，充分吸收后，37 ℃培養(yǎng)過夜。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，挑取白色菌落接種于5 mL的LB液體培養(yǎng)基(含5 μL的Amp+)，37 ℃ 180 r·min-1振蕩培養(yǎng)過夜。應(yīng)用TIANprep Mini Plasmid Kit提取質(zhì)粒。對(duì)所提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR及酶切鑒定，將檢測(cè)為陽性的質(zhì)粒送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.9 序列同源性及遺傳進(jìn)化分析

根據(jù)樣品采集地點(diǎn)將所獲得8條PEDVM基因序列分別命名CH/NMG/CF(赤峰)、CH/NMG/TL(通遼)、CH/NMG/BT(包頭)、CH/NMG/HHHT(呼和浩特)、CH/NMG/HLBE(呼倫貝爾)、CH/NMG/WY(巴彥淖爾)、CH/NMG/EEDS(鄂爾多斯)、CH/NMG/XLGL (錫林郭勒)。應(yīng)用DNAMAN、DNAStar對(duì)本試驗(yàn)所獲得的8條PEDVM基因進(jìn)行核苷酸及氨基酸同源性比對(duì)，并與GenBank上已登錄的48條PEDVM基因(表2)進(jìn)行核苷酸序列及其推導(dǎo)氨基酸序列的比對(duì)分析，利用MEGA 6.06的鄰接法(neighbor-joining method，NJ)，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，其中，自舉檢驗(yàn)次數(shù)設(shè)為1 000。分析內(nèi)蒙古地區(qū)PEDV流行毒株與參考毒株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

表2 國內(nèi)外PEDVM基因的參考序列

Table 2 Reference sequence of PEDVMgene at home and abroad

毒株Strain地點(diǎn)Area登錄號(hào)Accessionnumber毒株Strain地點(diǎn)Area登錄號(hào)AccessionnumberCH/IMB內(nèi)蒙古EU033962CH/S江蘇JN547228CH/IMT內(nèi)蒙古EU033965CH/TJ?2012?01天津KC176073CH/HLJH黑龍江EU033964CH/HuBWHYQ武漢KF840551HLJ?2012黑龍江JX512906LZW?CPGEN北京KJ777678HB?2012?3河北JX43531LZC甘肅EF1859927HBMC河北JX163295CH/YNKM?8昆明KF761675CH/TY/12河南JX501327KUIDL?PED?2014?002越南KJ588063CH/ZMDZY河南KC196276VN/VAP1113越南KJ960179CH/SDZD?1山東KF84054908RB01泰國FJ196182SD?M山東JX56076108CB02泰國FJ196167AHFD/2012安徽KJ001721K14JB01韓國KJ623926AHLA/2013安徽KJ001738MF3809/2008韓國KF779470LZW＿FGE北京KJ777677Chinju99韓國DQ845249JS?HZ2012江蘇KC21014783P?5日本AB618618JS1江蘇JQ390543JMe2日本D89752XG1廣西JN089745Br1/87法國Z24733XG2廣西JN089746CV777瑞士AF353511CH/GDGZ廣東KF384500USA/Colorado美國KF272920CHYJ130330廣東KJ020932MEX/104/2013美國KJ645708FUJ2?2011福建JQ390542MN美國KF468752FJ?ZP福建KJ646592OH15962美國KJ584361CH/SHH/06上海EU033966NPL?PEDv美國KJ778615SHQP/YM上海KJ196348Mx＿EdoMexC1EM＿2014莫斯科KM044328ZJ?2011?1浙江JX435319Mx＿EdoMexC1GM＿2014莫斯科KM044329

2 結(jié) 果

2.1 多重RT-PCR體系構(gòu)建

電泳檢測(cè)顯示泳道1分別于1 356、610、238 bp處出現(xiàn)明顯條帶，與目的條帶大小一致；泳道2于1 356、610 bp 處出現(xiàn)目的條帶；泳道3、4、5分別為610、1 356、238 bp處出現(xiàn)目的條帶；泳道6為陰性對(duì)照；泳道7、8、9為臨床PEDV感染的糞樣，于610 bp處出現(xiàn)條帶。電泳檢測(cè)結(jié)果表明，所構(gòu)建的多重RT-PCR方法，均于正確位置出現(xiàn)目的條帶，且各條帶清晰，無其他非特異性條帶，可用于臨床糞樣的鑒別診斷。

2.2 臨床病料檢測(cè)

各地的腹瀉糞樣檢測(cè)結(jié)果見表3。394份病料中，PEDV陽性病料252份，陽性率為63.96%；PoRV陽性病料8份，陽性率為2.03%；TGEV均為陰性；存在PEDV和PoRV的混合感染，混合感染病料8份，混合感染率為2.03%。

2.3 流行病學(xué)調(diào)查

由圖2可知，內(nèi)蒙古8個(gè)盟市的腹瀉病料均可檢出PEDV，其中又以赤峰市腹瀉病料中PEDV陽性檢出率最高，為75.81%；其次是包頭市和呼和浩特市，均為66.67%；最低的為呼倫貝爾市，但其陽性檢出率也達(dá)到了45.00%，在造成豬腹瀉的各因素中，仍占有重要比重。從圖3中可以看出，來自不同豬群的病料，其陽性檢出率存在明顯差異；仔豬、母豬、保育-育肥豬三種不同生長階段豬群的陽性率分別為72.58%、53.97%和44.94%；8個(gè)盟市中又以赤峰市仔豬、母豬的PEDV陽性率最高，分別為84.10%和75.00%，保育-育肥階段則以包頭市的PEDV陽性檢出率最高，為72.22%。

表3 采集地及臨床病料的檢測(cè)結(jié)果

Table 3 Collecting areas and results of the tested samples

采集地點(diǎn)Areas樣品數(shù)NumberofsamplePEDV陽性數(shù)NumberofPEDVpositivePoRV陽性數(shù)NumberofPoRVpositiveTGEV陽性數(shù)NumberofTGEVpositive赤峰CF624700通遼TL241400包頭BT573800呼倫貝爾HLBE20900巴彥淖爾BYNE543300鄂爾多斯EEDS482900呼和浩特HHHT966480錫林郭勒XLGL331800總計(jì)Total39425280陽性率/%Positiverate63．962．030

M.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.PEDV+TGEV+PoRV陽性對(duì)照；2.PEDV、PoRV混合感染的糞樣；3.PEDV陽性對(duì)照；4.PoRV陽性對(duì)照；5.TGEV陽性對(duì)照；6.陰性對(duì)照；7～9.臨床糞樣M.DL2000 DNA marker；1.The positive control of PoRV，PEDV and TGEV；2.Mix infection of PEDV and PoRV；3.The positive control of PEDV；4.The positive control of PoRV；5.The positive control of TGEV；6.Negative control；7-9.Clinical fecal samples圖1 多重RT-PCR方法構(gòu)建及臨床樣品的檢測(cè)Fig.1 The building of multiple RT-PCR and the application in clinical samples

圖2 內(nèi)蒙古8個(gè)盟市PEDV檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The testing result of PEDV collected from eight cities of Inner Mongolia

圖3 內(nèi)蒙古8個(gè)盟市不同豬群PEDV陽性率Fig.3 The positive rate of PEDV in different populations of eight cities in Inner Mongolia

2.4 質(zhì)粒PCR及酶切鑒定

將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增及酶切鑒定，結(jié)果如圖4所示：質(zhì)粒PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)于610 bp處出現(xiàn)明顯條帶；質(zhì)粒酶切后，電泳檢測(cè)于610和3 015 bp處獲得兩條亮帶，與預(yù)期結(jié)果一致，表明重組質(zhì)粒含有所需目的片段。

2.5 PEDVM基因同源性及遺傳進(jìn)化分析

序列同源性比對(duì)結(jié)果表明：所獲得的8條PEDVM基因核苷酸相似性為97.2%～100.0%，氨基酸相似性為98%～100%。與GenBank上已登錄的48條國內(nèi)外PEDVM基因構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(圖5)。進(jìn)化樹可分為G1、G2兩大分支，其中G1又可分為G1-1、G1-2兩小分支。本試驗(yàn)所獲得的8條M基因中有7條與國內(nèi)近三年分離的黑龍江、河北、河南、山東、北京、安徽、江蘇、廣東、福建、上海、天津、武漢、昆明等地的分離株(HLJ-2012、HB/2012-3、HBMC2012、CH/TY/12、CH/ZMDZY/11、CH/SDZD-1/12、LZW-FGE/2014、AHFD/2012、AHLA/2013、LZW-CPGEN/2014、JS-HZ2012、JS1、FJ-ZP、SHQP/YM、CH/HuBWHYQ、CH/TJ-2012-1、CH/YNKM-8)，2008年泰國分離的參考毒株(08RB01、08RB02)、韓國分離毒株(K14JB01、MF3809/2008)、美國2013—2014年分離毒株(USA/Colorado、MN、MEX/104/2013、OH15962、NPL-PEDv)、俄羅斯2014年分離的兩株參考株(Mx_EdoMexC1EM、Mx_EdoMexC1GM)同位于G1-1上。而CH/NMG/XLGL 分離株則與國內(nèi)2007年以前內(nèi)蒙古分離株(CH/IMB/06、CH/IMT/06)、山東SD-M株、黑龍江CH/HLJH株、上海CH/SHH /06株、CH/S滬毒株、LZC西部毒株，韓國的Chinju99株、日本83P-5、JMe2株、法國的Br1/87株、瑞士的CV777等經(jīng)典毒株同位于G2上。

M1.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；M2.DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～5(左).質(zhì)粒PCR結(jié)果；1～5(右).質(zhì)粒酶切結(jié)果M1.DL2000 DNA marker；M2.DL5000 DNA marker；1-5 (left).The result of recombinant plasmid PCR；1-5 (right).The result of recombinant plasmid identification of enzyme digestion圖4 重組質(zhì)粒PCR(左)及酶切鑒定(右)結(jié)果Fig.4 The results of recombinant plasmid PCR(left) and identification of enzyme digestion (right)

●.Inner Mongolia strains；▲.Inner Mongolia strains of 2006;◆.Classic strains圖5 PEDV M基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of M genes from different PEDV strains

2.6 PEDVM基因突變情況

運(yùn)用DNAStar與經(jīng)典毒株CV777 核苷酸序列比對(duì)可知，內(nèi)蒙古地區(qū)流行毒株的M基因核苷酸序列發(fā)生了11處堿基突變，其中CH/NMG/HHHT株于第594位缺失堿基T；氨基酸比對(duì)結(jié)果表明：有2個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了變化，分別是13位(E→Q)，42位(V→A)；CH/NMG/HHHT分離株于198位到202位缺失了5個(gè)氨基酸(YVRSK)。與2006年于內(nèi)蒙古分離的CH/IMB/06地方株相比，流行毒株存在6處突變位點(diǎn)，氨基酸比對(duì)僅于42位發(fā)生改變，由V變成了A；與CH/IMT/06地方株比對(duì)表明：流行毒株存在11處核苷酸突變，4處氨基酸位點(diǎn)變化，分別是5位(F→G)、13位(E→Q)、42位(V→A)、167位(D→N)。

3 討 論

PEDV、TGEV、PoRV是目前造成豬病毒性腹瀉的主要病原，且三者在臨床癥狀、病理變化以及流行病學(xué)上均無明顯差異[5]。傳統(tǒng)的病毒檢測(cè)方法雖然能對(duì)三者進(jìn)行鑒別診斷，但因其對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備、人員技術(shù)等條件要求較高，而且檢測(cè)周期長、靈敏度低等缺點(diǎn)在臨床實(shí)踐中并不常用[6]。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，PCR技術(shù)以其高特異、高靈敏、快速、簡(jiǎn)單等特點(diǎn)成為目前鑒別診斷上述三種病毒的最敏感、最特異的方法。多重 PCR 方法不僅保持了常規(guī) PCR 快速、靈敏、特異的特點(diǎn)，更具有一步可檢測(cè)多個(gè)病原靶標(biāo)基因的優(yōu)勢(shì)，適于大規(guī)模樣品的檢測(cè)，在動(dòng)物疫病流行病學(xué)調(diào)查與預(yù)防中，具有不可替代的作用[7]。多重PCR并非單項(xiàng)PCR的簡(jiǎn)單混合[8]。其中引物設(shè)計(jì)是此方法能否成功的前提，除考慮每對(duì)引物的特異性及擴(kuò)增效率之外，還必須盡量減少不同引物對(duì)之間形成二聚體的可能性。另外應(yīng)在確定三種病毒單項(xiàng)PCR最佳反應(yīng)條件基礎(chǔ)上，優(yōu)化多重PCR中的引物濃度、退火溫度及其他PCR反應(yīng)條件，同時(shí)還要保證該方法的特異性和靈敏度[9-10]。本試驗(yàn)針對(duì)PEDV、TGEV及PoRV的保守序列，擴(kuò)增出3條片段，長度分別為610、238和1 356 bp，目的片段之間長度差異明顯，便于臨床上的鑒別診斷。同時(shí)只需取活體動(dòng)物的糞樣即可達(dá)到很好的檢測(cè)效果，從而更有利于病毒性腹瀉的早期鑒別診斷，有較好的應(yīng)用前景。

應(yīng)用上述試驗(yàn)所建立的檢測(cè)方法，對(duì)2013年10月至今于內(nèi)蒙古部分盟市采集的394份腹瀉糞便進(jìn)行PEDV、TGEV、PoRV 3種病毒的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)各盟市的腹瀉豬群均存在PEDV感染的情況，部分地區(qū)還存在PEDV和PoRV混合感染的現(xiàn)象。其中PEDV和 PoRV的陽性率分別為63.96%和2.03%，TGEV均為陰性，表明PEDV為引起內(nèi)蒙古地區(qū)豬腹瀉的主要致病因子，其次是PoRV。這一檢測(cè)結(jié)果與國內(nèi)大部分省市的調(diào)查結(jié)果一致[10-15]，由此共同驗(yàn)證了PEDV是目前導(dǎo)致豬病毒性腹瀉的主要病原。

臨床調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，各日齡豬群均有PEDV感染的情況發(fā)生，但主要集中在未斷奶仔豬及哺乳期母豬，其中以7日齡以內(nèi)的仔豬發(fā)病最為嚴(yán)重，死亡率高達(dá)100%。有報(bào)道稱在母豬的乳汁中也能檢測(cè)出該病毒[3]，這可能是造成哺乳期仔豬發(fā)病率和死亡率較高的一方面誘因。但有資料顯示在歐洲一些豬場(chǎng)，斷奶豬和成年豬經(jīng)常發(fā)生嚴(yán)重的腹瀉，而哺乳仔豬尤其是無母源抗體的哺乳仔豬不發(fā)生或僅發(fā)生輕微腹瀉，發(fā)病率很低，對(duì)于這種現(xiàn)象至今仍沒有很好的解釋。

本研究所獲得的8條PEDV M基因中，除CH/NMG/XLGL外，全部位于G1-1分支上，其核苷酸、氨基酸相似性分別為99.7%～100%和99%～100%，保持高度一致，說明導(dǎo)致這幾個(gè)地區(qū)豬流行性腹瀉的毒株基本一致。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，CH/NMG/XLGL分離株與內(nèi)蒙古其他地區(qū)分離株差異較大，不在同一分支上；而與CV777等經(jīng)典毒株親緣關(guān)系較近，在同一個(gè)分支上。后期調(diào)查發(fā)現(xiàn)發(fā)病豬場(chǎng)長期進(jìn)行PEDV滅活苗和弱毒苗(CV777株)的免疫預(yù)防工作，推測(cè)該分離株多為使用弱毒疫苗后的正常排毒，亦或是疫苗株發(fā)生毒力返強(qiáng)，進(jìn)而引起豬發(fā)生腹瀉。其余7條PEDV的流行毒株則與2012年至今國內(nèi)多個(gè)省市的分離株、2008年泰國的兩條參考毒株、韓國的K14JB01、MF3809/2008參考株、美國的5條參考毒株、俄羅斯2014年分離的參考株親緣關(guān)系較近，同位于G1-1上，特別是與美國2013年暴發(fā)的流行毒株親緣關(guān)系最為密切，兩者的核苷酸及其氨基酸序列相似性均為99.5%～100%，基于二者的發(fā)病時(shí)間、基因同源性高度相似，筆者猜測(cè)兩者之間或許存在某些關(guān)聯(lián)。S.Lee等[16]報(bào)道稱已于韓國分離出類似美國此次流行的病原。C.N.Lin 等[17]在臺(tái)灣也發(fā)現(xiàn)了類似美國毒株的病例。L.Y.Wang等[4]通過S基因序列分析發(fā)現(xiàn)美國新型毒株OH851可能來自中國CH/HBQX/10株的變異。都在一定程度上佐證了筆者的猜測(cè)，但如需進(jìn)一步驗(yàn)證，還需測(cè)出內(nèi)蒙古流行毒株的全基因序列，進(jìn)而進(jìn)行全基因序列的同源性比較。與2006年于內(nèi)蒙古分離的兩株流行毒株同源性分析表明，其核苷酸相似性為97.2%～98.7%，差異性較大，不在同一分支上；與2007年以前國內(nèi)部分省市的流行毒株(SD-M、CH/HLJH、CH/SHH/06、CH/S、LZC)、韓國Chinju99、日本83P-5和JMe2、法國Br1/87、瑞士的CV777等經(jīng)典毒株相距較遠(yuǎn)，表明內(nèi)蒙古大部分地區(qū)近三年的流行毒株與2006年流行株以及疫苗株相比，已經(jīng)發(fā)生一定程度的變異，這一發(fā)現(xiàn)與J.F.Chen等[18]的結(jié)論一致。PEDV的M基因雖然高度保守，但隨其所處環(huán)境條件的改變，病毒可能會(huì)發(fā)生變異。S.J.Park等[19]通過ORF3基因與M基因?qū)n國流行毒株進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)自2003年以來韓國PEDV流行毒株與我國的流行毒株越來越相近。Y.Gao等對(duì)2011—2012年來自北京、河北、浙江等地的腹瀉樣品進(jìn)行M基因及S基因遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)所分離毒株與韓國流行毒株親緣關(guān)系較近，推測(cè)為一種新型毒株的流行[20]。以上結(jié)果在一定程度上反映出，我國PEDV已經(jīng)發(fā)生很大程度的變異，這可能是造成我國現(xiàn)用疫苗免疫效果較差的又一因素。

4 結(jié) 論

此次調(diào)查明確了當(dāng)前導(dǎo)致內(nèi)蒙古豬腹瀉病的主要病原是PEDV，各地均有不同程度的感染；各日齡豬群均可感染，但以未斷乳仔豬和哺乳母豬更為嚴(yán)重；此次調(diào)查發(fā)現(xiàn)的流行毒株與2012年以來國內(nèi)、外大部分流行毒株親緣關(guān)系較近，但與2007年以前分離的內(nèi)蒙古流行毒株、疫苗株、經(jīng)典毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，存在基因突變的現(xiàn)象。

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(編輯 白永平)

Detection and Analysis of Porcine Diarrhea Associated Virus in Inner Mongolia

LIU Yan-cheng1，DU Ya-nan1*，WU Wei-jie2，WANG Xue-fei1，LU Ting1，LIU Dan-dan1

(1.KeyLaboratoryofClinicalDiagnosisandTreatmentTechnologyinAnimalDiseaseofMinistryofAgriculture，CollegeofVeterinaryMedicine，InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Hohhot010018，China； 2.XinganLeagueAnimalDiseaseControlCenter,Ulanhot137400,China)

The research aimed to understand the main pathogens of pigs diarrhea virus found in Inner Mongolia in order to provide theoretical basis for pig diarrhea control and prevention.Through the Multiple RT-PCR method，the porcine epidemic diarrhea virus (PEDV)，transmissible gastroenteritis virus (TGEV)，and porcine rotavirus (PoRV) from 394 tissue samples collected from the pig farms in 8 cities of Inner Mongolia were tested.Mgene of the PEDV positive materials were cloned and analyzed along with the sequence alignment and phylogenetic trees of 48Mgene sequences from other domestic and international.The tested results indicated that the positive rates of PEDV and PoRV were 63.96% and 2.03%，respectively，yet the TGEV tested negative，The Mixed infection rate of PEDV and PoRV was 2.03%.Phylogenetic analysis indicated that CH/NMG/ XLGL strain stayed close relative with classic strains such as CV777，located at G2.The rest of the strains stayed close relatives with the domestic many provinces before 2012，and Thailand，South Korea，Russia，Vietnam and other neighboring countries were same branch，G1-1.United States，in particular，the nucleotide sequence homology was 99.5%-100%.From 2013 until now，the main pathogeny for pig diarrhea in Inner Mongolia was PEDV，followed by PoRV.The infection degree was different in varying cities，and pigs of all ages can be infected，especially the suckle pigs and the sow.Most of the prevalent strains exhibited higher affinity with the strains isolated from the most provinces and cities domestic since 2012，but the stains were far apart from Inner Mongolia strains isolated before 2007，vaccine strains and classic strains，and some sites appeared base mutations.

porcine epidemic diarrhea virus；transmissible gastroenteritis virus；porcine rotavirus；RT-PCR；Mgene；Inner Mongolia

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.018

2014-11-27

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金(980202)；內(nèi)蒙古自治區(qū)2014年博士研究生科研創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目(B20141012908Z)

劉艷成(1988-)，男，蒙古族，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士生，主要從事畜禽傳染病的研究，E-mail：liuyancheng513@163.com

*通信作者：杜雅楠，副教授，E-mail：yanandu@126.com

S858.285.3

A

0366-6964(2015)09-1620-09