不同毒力結(jié)核分枝桿菌對(duì)THP-1細(xì)胞凋亡及細(xì)胞因子表達(dá)的影響

張 妍，宋紀(jì)偉，曾范利，時(shí) 坤，李健明，劉 楊，劉 菲，孫凡婷，杜 銳，4*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.吉林市人民醫(yī)院，吉林 132001；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；4.教育部動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林省梅花鹿生產(chǎn)與產(chǎn)品應(yīng)用研究室，長(zhǎng)春 130118)

不同毒力結(jié)核分枝桿菌對(duì)THP-1細(xì)胞凋亡及細(xì)胞因子表達(dá)的影響

張 妍1，宋紀(jì)偉2，曾范利3，時(shí) 坤3，李健明3，劉 楊1，劉 菲1，孫凡婷1，杜 銳3，4*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.吉林市人民醫(yī)院，吉林 132001；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；4.教育部動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林省梅花鹿生產(chǎn)與產(chǎn)品應(yīng)用研究室，長(zhǎng)春 130118)

為探討不同毒力結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染巨噬細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡情況與其分泌的幾種主要細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄與表達(dá)之間的關(guān)系，建立THP-1體外巨噬細(xì)胞模型，用不同毒力MTB(強(qiáng)毒株H37Rv、弱毒株BCG)感染細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞在六個(gè)時(shí)間點(diǎn)的凋亡情況，應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α、IL-10、IL-6的轉(zhuǎn)錄水平，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清液中三種細(xì)胞因子的分泌量。結(jié)果顯示：BCG組和H37Rv組的早期凋亡率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的轉(zhuǎn)錄水平與分泌水平相符，弱毒菌株巨噬細(xì)胞凋亡情況隨時(shí)間延長(zhǎng)成上升趨勢(shì)，其分泌的細(xì)胞因子TNF-α表現(xiàn)為相同趨勢(shì)，IL-6表現(xiàn)為相反趨勢(shì)。強(qiáng)毒株巨噬細(xì)胞凋亡情況低于弱毒株，細(xì)胞因子分泌情況復(fù)雜，一般表現(xiàn)為一種先增強(qiáng)后抑制的情況。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞因子與凋亡情況關(guān)系的研究為結(jié)核分枝桿菌對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡機(jī)制提供新思路。

不同毒力結(jié)核分枝桿菌；THP-1細(xì)胞；凋亡；細(xì)胞因子

結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是一種慢性消耗性人畜共患傳染病。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染后通常表現(xiàn)為慢性癥狀，并且感染后的潛伏期較長(zhǎng)，潛伏期的動(dòng)物具有傳染性[1]。病畜尤其是具有開(kāi)放性結(jié)核的病畜是人類(lèi)結(jié)核病的主要傳染源[2]。由于結(jié)核分枝桿菌是典型的胞內(nèi)寄生菌，主要在宿主巨噬細(xì)胞等免疫系統(tǒng)內(nèi)存活和繁殖，并已證實(shí)巨噬細(xì)胞在結(jié)核分枝桿菌免疫逃逸情況中占有重要作用[3]。在小鼠模型中也證實(shí)，除了巨噬細(xì)胞外，位于肺實(shí)質(zhì)內(nèi)的一些不成熟的單核細(xì)胞可以在其分化為巨噬細(xì)胞前進(jìn)入感染部位并被感染[4]。不同毒力的結(jié)核分枝桿菌引起巨噬細(xì)胞凋亡水平不同，其逃逸機(jī)制與多種因素相關(guān)，其中細(xì)胞因子對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡有重要的調(diào)控作用。TNF-α一般認(rèn)為可由巨噬細(xì)胞內(nèi)源性分泌，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[5]。有報(bào)道稱(chēng)，結(jié)核分枝桿菌可以強(qiáng)化細(xì)胞內(nèi)的一種生存蛋白(EIS)，通過(guò)JNK依賴(lài)性產(chǎn)生RIO從而抑制TNF-α的產(chǎn)生，防止巨噬細(xì)胞活化、炎癥和自體吞噬等反應(yīng)[6-8]。IL-10被認(rèn)為是細(xì)胞因子合成的抑制因子，能夠抑制多種促炎性細(xì)胞因子的分泌[9]。人醫(yī)認(rèn)為IL-10的水平與結(jié)核分枝桿菌的存活成正相關(guān)[10]。在動(dòng)物中也有IL-10能夠誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌再活化的報(bào)道[11]。IL-6在新近的報(bào)道中證明可以抑制由結(jié)核分枝桿菌感染引起的巨噬細(xì)胞自噬。IL-6的分泌增加有利于結(jié)核分枝桿菌抑制機(jī)體先天性免疫應(yīng)答[12]。本研究通過(guò)對(duì)不同毒力結(jié)核分枝桿菌感染細(xì)胞后細(xì)胞凋亡情況和其分泌的三種主要細(xì)胞因子的分析，對(duì)結(jié)核分枝桿菌引起的細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行深層探討。

1 材料與方法

1.1 材料

THP-1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；強(qiáng)毒結(jié)核分枝桿菌H37Rv由吉林大學(xué)孫長(zhǎng)江老師贈(zèng)予；弱毒結(jié)核分枝桿菌BCG由本實(shí)驗(yàn)室保存；EDTA(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；β-巰基乙醇(Amresco公司)；1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)；二甲基亞砜(Sigma公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；佛波酯phorbol 12-myristste13-acetate，PMA(Sigma公司)；FITC Annexin V-PI調(diào)亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司)；細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫試劑盒(RD分裝)；DEPC(Amresco公司)； TRIzol(大連寶生物公司)；SYBR?Premix EX TaqTMⅡ(大連寶生物公司)；Primescript?RT reagent Kit With gDNA Erase(大連寶生物公司)；其他常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)

THP-1人單核細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，正常情況下為亮圓形，采用含10%血清、1%雙抗的1640細(xì)胞培養(yǎng)液于含50 mL·L-1CO2的37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。換液時(shí)需要1 000 r·min-1離心5 min，計(jì)數(shù)調(diào)整其濃度為5×105·mL-1，用100 ng·mL-1的PMA誘導(dǎo)24 h使懸浮細(xì)胞貼壁，于12孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)室羅氏培養(yǎng)基上保存的結(jié)核分枝桿菌成簇生長(zhǎng)為乳黃色塊狀物，卡介苗表面成菜花樣，結(jié)核分枝桿菌表面光滑，將其刮下接種于7H9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3～5 d，可見(jiàn)液體渾濁，內(nèi)有白色顆粒，有菌膜掛壁。將菌液進(jìn)行倍比稀釋涂板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，離心用PBS稀釋使其終濃度為5×106·mL-1，備用。

1.4 結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞模型建立

結(jié)核分枝桿菌感染12孔板中生長(zhǎng)12 h以上貼壁良好的THP-1細(xì)胞，于CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h(此時(shí)使用的營(yíng)養(yǎng)液不含血清不含雙抗)。吸出營(yíng)養(yǎng)液重新加入含血清不含雙抗的營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1、2、4、12、24、48 h。

1.5 THP-1細(xì)胞凋亡檢測(cè)

用不含EDTA的胰酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，用含血清不含雙抗的1640終止消化，用1 mL冷PBS懸浮細(xì)胞，洗滌細(xì)胞兩次并計(jì)數(shù)使其終細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)，加入100 μL Buffer，3 μL FITC，3 μL PI染料，避光25 °C孵育15 min，最后加入200 μL Buffer。在1 h內(nèi)進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)

提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。熒光定量PCR，反應(yīng)體系：SYBR?Premix ExTaqII 12.5 μL，上游引物 1 μL，下游引物1 μL(表1)，模板 2 μL，ddH2O 8.5 μL，反應(yīng)條件： 95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，不同退火溫度(60～64 ℃)30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；采集熒光信號(hào)得出擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈曲線。

表1 熒光定量PCR引物及退火溫度

Table 1 Quantitative PCR primers and annealing temperature

引物名稱(chēng)Primername序列(5′?3′)Sequence最適退火溫度/℃AnnealingtemperatureIL?6?FIL?6?RGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTCAGCAGGCTGGCATTTG62IL?10?FIL?10?RGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGAAAGGCTTGGCAACCCAGGTA64TNF?α?FTNF?α?RTGCTTGTTCCTCAGCCTCTTCAGAGGGCTGATTAGAGAGAGGT60β?actin?Fβ?actin?RGGACTTCGAGCAGGAGATGGTGAAGGTGGTCTCGTGGATG62

1.7 細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)

收集細(xì)胞上清液及給定標(biāo)準(zhǔn)品按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)得OD值。

2 結(jié) 果

2.1 不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)FITC/PI雙染試劑盒結(jié)果FITC陽(yáng)性，PI陰性表示細(xì)胞早期凋亡；FITC和PI均陽(yáng)性表示細(xì)胞晚期凋亡或有損傷的死細(xì)胞。BCG組和H37Rv組的早期凋亡率均高于對(duì)照組，并且其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中BCG組的早期凋亡率隨時(shí)間的延長(zhǎng)在逐步增加，H37Rv組的早期凋亡率在4 h時(shí)較低，在12 h后趨于穩(wěn)定(圖1)。值得注意的是通過(guò)分析其晚期凋亡和死細(xì)胞結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在感染24 h后，強(qiáng)毒標(biāo)準(zhǔn)菌H37Rv組的凋亡率大幅下降，甚至低于對(duì)照組(圖2)。

圖1 結(jié)核分枝桿菌感染THP-1細(xì)胞6個(gè)時(shí)間點(diǎn)早期凋亡情況Fig.1 Early apoptosis of Mycobacterium tuberculosis infection in THP-1 cells at six time points

圖2 THP-1細(xì)胞未感染組和H37Rv感染組5個(gè)時(shí)間點(diǎn)流式結(jié)果Fig.2 Streaming chart of THP-1 cells of uninfected group and H37Rv infection group at five time points

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平

對(duì)熒光定量PCR 結(jié)果用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。通過(guò)引入管家基因，消除由于收集細(xì)胞、反轉(zhuǎn)錄及加樣過(guò)程中產(chǎn)生的操作誤差。用0 h 表示未經(jīng)感染的對(duì)照組細(xì)胞，其表達(dá)量為1。與對(duì)照組相比各時(shí)間點(diǎn)差異均顯著(P<0.05)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

對(duì)于TNF-α轉(zhuǎn)錄水平，H37Rv組整體低于BCG組，在12 h達(dá)到最大值。BCG組的轉(zhuǎn)錄水平在4、12、24 h時(shí)高出對(duì)照組十倍以上(圖3)。

對(duì)于IL-6轉(zhuǎn)錄水平，H37Rv組整體高于BCG組，在12 h達(dá)到最大值并高出對(duì)照組18.2倍。BCG組在4 h達(dá)到最大值，在1、12、24、48 h其轉(zhuǎn)錄水平低于對(duì)照組(圖3)。

對(duì)于IL-10，相比對(duì)照組，其轉(zhuǎn)錄水平變化不大，H37Rv組在各時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄水平均高于對(duì)照組，而B(niǎo)CG組只有在2、4 h時(shí)其轉(zhuǎn)錄水平高于對(duì)照組(圖3)。

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞因子表達(dá)結(jié)果

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和OD值應(yīng)用ELISAcalc軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，代入測(cè)定的結(jié)果得出TNF-α、IL-10、IL-6在不同時(shí)間點(diǎn)上清液中分泌的細(xì)胞因子濃度。

對(duì)于TNF-α，其H37Rv組和BCG組的分泌量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。BCG組呈上升趨勢(shì)，H37Rv組在12 h分泌量最低。

對(duì)于IL-6，其H37Rv組和BCG組的分泌量均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。H37Rv組在12 h達(dá)到最大值116.2 ng·L-1，BCG組在2 h后分泌量開(kāi)始下降，但總體變化不大。

對(duì)于IL-10其H37Rv組和BCG組的分泌量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。BCG組在4 h達(dá)到最大值116.5 ng·L-1，H37Rv組呈波動(dòng)變化，兩者差異不顯著(圖3)。

3 討 論

在結(jié)核分枝桿菌與巨噬細(xì)胞的相互作用過(guò)程中，巨噬細(xì)胞在行使免疫細(xì)胞功能殺滅結(jié)核分枝桿菌的同時(shí)，結(jié)核分枝桿菌也同時(shí)在逃逸巨噬細(xì)胞的免疫，這就造成了結(jié)核的慢性癥狀，使其具有潛伏性和傳染性，給診斷和治療帶來(lái)了巨大困難[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，不同毒力的結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞后，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡水平不同[15]。M.K.Balcewicz-Sablinska等分別用結(jié)核分枝桿菌強(qiáng)毒標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv株和結(jié)核分枝桿菌減毒株H37Ra株感染肺泡巨噬細(xì)胞，結(jié)果顯示，對(duì)比與對(duì)照組巨噬細(xì)胞的凋亡率均有顯著增高，相比于弱毒組H37Rv組的凋亡情況明顯受到抑制[16]。本研究采用FITC/PI雙染試劑盒可以準(zhǔn)確定量出不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)生早期凋亡和晚期凋亡壞死的細(xì)胞。BCG組和H37Rv組的早期凋亡率均高于對(duì)照組，并且其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。通過(guò)掌握不同毒力的結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞的動(dòng)態(tài)凋亡情況，分析巨噬細(xì)胞分泌的三種主要細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的作用。

圖3 結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞6個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞因子變化情況Fig.3 Cytokine changes at six time points of Mycobacterium tuberculosis infection in macrophages

通過(guò)對(duì)熒光定量和ELISA結(jié)果分析得出BCG組TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平與其逐步升高的分泌量關(guān)系相符，IL-6轉(zhuǎn)錄水平在12 h后被抑制與其4 h后逐步下降的分泌量關(guān)系相符，IL-10的分泌量有波動(dòng)并不與其轉(zhuǎn)錄水平相符，分析可能還受其他因素影響。在48 h內(nèi)，BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡情況與TNF-α分泌量呈正相關(guān)，與IL-6的分泌量呈負(fù)相關(guān)。H37Rv組TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平低于BCG組并在4、12 h時(shí)高于對(duì)照組，在24 h后被抑制。其分泌量在2 h時(shí)遠(yuǎn)高于BCG組，后逐步降低，分析在感染初期結(jié)核分枝桿菌強(qiáng)毒株比弱毒株更能刺激TNF-α分泌，但于感染后24 h被抑制。IL-6在12 h前的轉(zhuǎn)錄水平與其逐步升高的分泌量關(guān)系相符，24 h后轉(zhuǎn)錄水平和分泌量均下降。對(duì)比與對(duì)照組分析，可能是IL-6的分泌主要集中在前24 h，后期分泌量自然下降。IL-10的轉(zhuǎn)錄情況較復(fù)雜，其分泌量在4 h最高而后下降并與BCG組呈相反的趨勢(shì)。在12 h后強(qiáng)毒株H37Rv誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞早期凋亡情況已經(jīng)趨于穩(wěn)定，而晚期凋亡和壞死的細(xì)胞在減少，這與12～24 h時(shí)間段內(nèi)細(xì)胞因子的變化情況相符。分析此時(shí)間段是結(jié)核分枝桿菌發(fā)揮逃逸作用的關(guān)鍵時(shí)期。本研究通過(guò)對(duì)不同毒力結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞后凋亡情況監(jiān)控和其三種主要細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平和分泌水平的分析，將對(duì)不同毒力結(jié)核分枝桿菌引起及抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制有更深層的理解。

4 結(jié) 論

BCG和H37Rv感染THP-1細(xì)胞的早期凋亡率均高于對(duì)照組，并且H37Rv組有抑制趨勢(shì)。這與細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的轉(zhuǎn)錄水平和分泌水平有一定相關(guān)性。通過(guò)對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究將有助于闡明結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制，為結(jié)核病的防治提供新的思路。

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(編輯 白永平)

Effect of Different VirulenceMycobacteriumtuberculosison Cytokine Expression and Apoptosis of THP-1 Cells

ZHANG Yan1，SONG Ji-wei2，ZENG Fan-li3，SHI Kun3，LI Jian-ming3，LIU Yang1， LIU Fei1，SUN Fan-ting1，DU Rui3，4*

(1CollegeofAnimalScience&Technology，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China； 2.JilinPeople′sHospital，Jilin132001，China；3.CollegeofChineseMedicineMaterials，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China；4.KeyLaboratoryofAnimalProduction，ProductQualityandSecurityofMinistryofEducationofthePeople′sRepublicofChina，LaboratoryofProductionandProductApplicationofSikaDeerofJinlinProvince，Changchun130118，China)

In order to investigate the relationship between apoptosis and transcription and expression of several major cytokines duringMycobacteriumtuberculosis(MTB)infection，THP-1 derived macrophage was selected to establishinvitromodel.Infected cells with different virulence MTB (H37Rv，BCG)，flow cytometry was used to detect macrophage apoptosis at six time points，quantitative PCR was used to detect transcription level of cytokines TNF-α，IL-10，IL-6，ELISA was used to detect the secretion of cell supernatants of three cytokines.The results showed：the early apoptotic rate of BCG and H37Rv group were both higher than control group and the difference was statistically significant (P<0.05).Transcription levels of cytokines，TNF-α，IL-6 were consistent with the level of secretion.There was an increase with time on apoptosis of low virulent strain，and there is a same trend on secretion of TNF-α，an opposite tendency on secretion of IL-6.Apoptosis of virulent strains was less than attenuated vaccine strain.Secretion of virulent strains was complex，like increase first and then suppression.The relationship between cytokines and apoptosis of cells at different time points may provide new ideas for study of macrophage apoptosis mechanisms.

Mycobacteriumtuberculosis；THP-1 cells；apoptosis；cytokine

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.015

2014-12-23

國(guó)家自然科學(xué)基金(31372436)；吉林省科技廳科技成果轉(zhuǎn)化促進(jìn)計(jì)劃(20140309018YY)；吉林省科技廳科技成果轉(zhuǎn)化促進(jìn)計(jì)劃(20140412009XH)；吉林省科技廳科技創(chuàng)新人才培育計(jì)劃(20130521023JH)

張 妍(1989-)，女，遼寧大連人，碩士生，主要從事經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病研究，E-mail：811285453@qq.com

*通信作者：杜 銳，教授，博導(dǎo)，主要從事經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病研究，E-mail：durui71@126.com，Tel：0431-84510946

S852.618

A

0366-6964(2015)09-1600-06