貴州矮馬(Equuscaballus)生長激素受體基因5個單核苷酸位點的多態(tài)性研究

冉雪琴，趙星艷，王嘉福，田松軍，魏小紅

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025； 2.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴陽 550025；3.貴州紫云縣畜牧獸醫(yī)局，紫云 550800)

貴州矮馬(Equuscaballus)生長激素受體基因5個單核苷酸位點的多態(tài)性研究

冉雪琴1*，趙星艷1，王嘉福2，田松軍3，魏小紅3

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025； 2.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴陽 550025；3.貴州紫云縣畜牧獸醫(yī)局，紫云 550800)

旨在探究貴州矮馬生長慢的根本原因，本研究采用PCR和基因克隆技術(shù)測定貴州矮馬生長激素受體基因(GHR)外顯子10的核苷酸序列；以伊犁馬為對照，通過AS-PCR和SSCP方法研究貴州矮馬群體中SNP位點的分布頻率，應(yīng)用群體遺傳學(xué)和生物信息學(xué)方法分析基因型與體尺指標(biāo)間的相關(guān)性。結(jié)果，從貴州矮馬GHR外顯子10中得到10個單倍型，包括10個SNPs位點，其中的5個引起氨基酸改變。與伊犁馬相比，貴州矮馬GHR基因1028位點的A等位基因占優(yōu)勢，對應(yīng)較低的尻高和較粗的管圍；1471位點的E等位基因在貴州矮馬群體中分布較多，與胸圍率較高相關(guān)；1697和1732兩個位點的雜合型存在于最矮的雄性矮馬(6歲)GHR基因中。1028位點引起的V343A位于UbE結(jié)構(gòu)域中，1471、1697和1732位點引起的S491G、Y566C和R578G改變與GHR蛋白的磷酸化有關(guān)。這4個位點可能影響GHR的內(nèi)化作用或通過磷酸化途徑影響細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)效率。研究結(jié)果提示，貴州矮馬GHR基因外顯子10中的多態(tài)性變化可能影響貴州矮馬的生長發(fā)育。

貴州矮馬；生長激素受體基因；外顯子10；SNP

動物個體的生長和糖、脂、蛋白等代謝主要受生長激素(Growth hormone，GH)的控制。GH由腺垂體合成，與生長激素受體(Growth hormone receptor，GHR)結(jié)合發(fā)揮促生長作用。GHR為穿膜一次的糖蛋白，由638個氨基酸組成，包含3個結(jié)構(gòu)域，即位于胞外的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、穿膜結(jié)構(gòu)域及胞內(nèi)的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。1個GH刺激2個GHR分子形成二聚體[1]，通過GHR的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域啟動細(xì)胞內(nèi)的JAK/Stat、PI3K、MSAP等信號途徑，刺激胰島素樣生長因子(Insulin-like growth factors，IGFs)、轉(zhuǎn)錄因子、代謝相關(guān)酶類的合成，實現(xiàn)GH的促生長作用[2]。GHR屬于1型細(xì)胞因子受體家族(Cytokine receptor family type 1)，幾乎在各個組織中表達(dá)，肝和脂肪細(xì)胞中的表達(dá)量較高[3-4]。已知純血馬(Thoroughbred)的GHR基因長244 757 bp(NCBI No.：NW_001867391)，位于21號染色體長臂23 836 204～ 24 080 960 bp區(qū)域，經(jīng)可變剪接產(chǎn)生兩個轉(zhuǎn)錄本X1和X2，轉(zhuǎn)錄本X1長4 048 bp(XM_001498656)，編碼638 aa；轉(zhuǎn)錄本X2(XM_005604292)長3 970 bp，編碼646 aa，兩種轉(zhuǎn)錄本的外顯子2～10完全一樣。外顯子2編碼信號肽；外顯子3～7編碼胞外區(qū)，外顯子8編碼穿膜結(jié)構(gòu)域，外顯子9和10編碼胞內(nèi)區(qū)，外顯子10最長為2 992 bp，編碼323 aa，約占GHR胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的90%[5]。人GHR基因中存在豐富的SNP位點，是出生前后生長和代謝出現(xiàn)明顯個體差異的原因之一，人類基因突變數(shù)據(jù)庫(http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=GHR)記錄了GHR基因中90個突變與人特發(fā)性身材矮小、Laron綜合征、嚴(yán)重的生長障礙等有關(guān)。GHR基因的多態(tài)性與雞的性連鎖矮小[6]、肉牛的生長[7]和奶牛的產(chǎn)奶量等性狀有關(guān)[8]。目前，對馬GHR基因中的SNP知之甚少。貴州矮馬長期生活在貴州山區(qū)環(huán)境中，是中國矮馬中5個分支之一[9]。與普通馬相比[10]，貴州矮馬明顯較矮，但身體各部分的比例協(xié)調(diào)。貴州矮馬的體型特點與人類的特發(fā)性矮小有一定的相似性。

本試驗主要研究貴州矮馬GHR基因外顯子10的單核苷酸多態(tài)性，及其與貴州矮馬的矮小特性之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 樣品

74匹貴州矮馬血液樣品采自“貴州省紫云縣貴州矮馬原種場”，均為成年健康役用母馬，年齡5～8歲；61匹雌性伊犁馬的血液樣品采自新疆伊犁州“昭蘇伊犁種馬場”，年齡6～8歲，所有馬匹處于成年期，體格健壯，以放牧為主。參照Qiagen公司QIAamp DNA Blood Mini Kit說明書，提取血液基因組DNA，-20 ℃保存。貴州矮馬的體高、體長、胸圍、管圍、頭長、頸長、胸深、背高、尻高、前肢長、前膊長、前系長等12項體尺指標(biāo)參照文獻(xiàn)[11]測定，胸圍率=(胸圍/體高)×100%。

1.2 基因克隆及測序

據(jù)已知馬GHR基因序列設(shè)計特異引物(表1)，以血液基因組DNA為模板，擴(kuò)增GHR基因外顯子10區(qū)。PCR反應(yīng)體系20 μL：2×PCR Mixture(天根生化科技(北京)有限公司)10 μL，10 μmol·L-1引物各0.3 μL，基因組DNA 100 ng，ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，58～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳純化，連接pMD18-T載體(寶生物工程(大連)有限公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行引物合成和DNA序列測定，每個樣品重復(fù)測定5個陽性克隆子的堿基序列。

依據(jù)得到的GHR外顯子10基因序列，設(shè)計7對特異引物(表1)，采用AS-PCR方法檢測GHR外顯子10中的3個SNPs位點，包括1028、1267和1471位點；采用SSCP方法檢測2個相鄰的SNPs位點1697和1732。

表1 基因擴(kuò)增和SNP檢測引物

Table 1 Primers used to detect the polymorphism ofGHRgene in 2 horse populations

引物名稱Primername引物序列(5′?3′)Primersequence片段/bpFragment等位基因Allele外顯子10片段GHRupGHRdownCTAGGAAGGAAAATTAGAAGAGGTGCGTAGCTCATGGGAAATCAAAG1003?1028位點(AS?PCR)GHR1028F1GHR1028R1TTTTACAATGATGACTCTTGGGCGTGGTCTTGGTTTGTTTTCCTC370AGHR1028F2GHR1028R2TTTTACAATGATGACTCTTGGGTCAGCAGTAGTGGTAAGGCTTTC724B1267位點(AS?PCR)GHR1267F1GHR1267R1AGGTTAAAAGGGGAAGCAGATCAGTTGACTCAGTTCCACCAATAAGA156CGHR1267F2GHR1267R2AGGTTAAAAGGGGAAGCAGATTAAGTTGGCTTGGCAGAGTGAGA338D1471位點(AS?PCR)GHR1471F1GHR1471R1AACATCGACTTTTATGCCCAGGTAGAAGTTGGCTTGGCAGAGTGAGA137EGHR1471F2GHR1471R2CATCGACTTTTATGCCCAGGTAAGGAAATCAAAGAAAGGCTACGG485F1697、1732位點(SSCP)GHRssFGHRssRAAGCCAACTTCATCATGGACAACATCTCAGAGCTTGAAGCACGT197G/H

*.以GHR基因起始碼第一個堿基A記為1，計算SNP位點在GHR編碼區(qū)中的位置。陰影字母代表變異的堿基

*.The location of SNP was counted from the first A of first start codon ATG in the coding region ofGHR.The changed nucleotides in the primers were shaded in grey color

1.4 數(shù)據(jù)處理

核苷酸序列采用NCBI的Blastn軟件比對，以MEGA v6.0分析變異位點，用SPSS v21.0軟件以Duncan氏新復(fù)極差測驗法(New multiple range test)經(jīng)多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗。經(jīng)Popgene v1.32軟件計算基因型頻率、等位基因頻率、Hardy-Weinberg平衡檢驗、群體遺傳學(xué)指標(biāo)，以PICv0.6軟件計算多態(tài)信息含量(Polymorphism information content，PIC)。

2 結(jié) 果

2.1GHR基因片段的克隆測序

隨機(jī)選取15匹貴州矮馬血液樣本，提取基因組DNA，在特異引物GHRup / GHRdown引導(dǎo)下，擴(kuò)增出約1 000 bp片段(圖1)，測序得到15條DNA序列，長1 003 bp，有10個單倍型H1～H10(表2)。經(jīng)在線比對，與已知普氏野馬(XM_008524570)、純血馬(NW_001867391)GHR基因序列的相似性最高，為99%，之間有1～2個堿基差異，由此確定擴(kuò)增片段為矮馬GHR基因外顯子10序列。經(jīng)同源比對，1 003 bp序列中第5～1 003 bp為馬的外顯子10區(qū)段，第974～976 bp為終止碼TAG，共編碼323個氨基酸，對應(yīng)完整GHR蛋白C端的316～638 aa。單倍型1編碼的323 aa與普氏野馬(XP_008522792)和純血馬參考基因組注釋的GHR X1(XP_001498706)和X2(XP_005604349)相應(yīng)序列完全一樣。10個單倍型之間相比(表2)，共有10個位點發(fā)生了核苷酸變異，其中5個位點為同義突變，不影響編碼的氨基酸；另外5個位點引起了氨基酸改變，包括1028、1267、1471、1697、1732位點(以GHR基因編碼區(qū)起始碼的A記為1)，引起的氨基酸替換為V343A、L423F、S491G、Y566C、R578G(數(shù)字前的氨基酸為普氏野馬和參考馬的氨基酸，數(shù)字后為變異的氨基酸)。采用AS-PCR方法，檢測1028、1267、1471位點在貴州矮馬及伊犁馬群體中的基因頻率。另外2個突變位點1697和1732位置相近，采用PCR-SSCP方法檢測。

表2 貴州矮馬GHR基因外顯子10的核苷酸變異位點

Table 2 Nucleotide changes in exon 10 ofGHRgene in Guizhou pony

單倍型Haplotype核苷酸變異位點?Changedsitesofnucleotide1028106511041146126714711536159616971732H1TATTCACCAAH2．．．C．．．．．．H3．．．C．．．．GGH4．．．C．．．．．．H5．G．C．G．．．．H6．．CC．．．．．．H7．．．．T．．．．．H8．．．C．．．．．．H9．．．C．．GT．．H10C．．C．．．．．．a(chǎn)a??V343AE355EN368ND382DL423FS491GS512SN532NY566CR578G

*.核苷酸變異位置以GHR基因CDS起始碼第一個堿基A記為第1位核苷酸；**.以起始碼編碼的Met開始標(biāo)識變異氨基酸的位置

*.Denoted the first nucleotide starting from the first A in the coding region ofGHRgene；**.Showed the first amino acid was Met coded by the start codon

M.DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000； 1～7.貴州矮馬GHR基因外顯子10M.DL2000 DNA marker；1-7.PCR products of GHR gene圖1 貴州矮馬GHR基因外顯子10區(qū)域擴(kuò)增Fig.1 Amplification of GHR exon 10 of Guizhou pony by PCR

2.2GHR基因1028位點的多態(tài)性檢測

不要慫！我對自己說。高度的緊張令我的感官敏銳又麻木。我保持著高速而均勻的行駛。到了！我快速伸出手去，緊握住黑暗中另一只手。冰冷而光滑，像乳膠制的假手。但我知道這是一只真手，來自一具男尸。我強(qiáng)迫自己緊握住它，拖著尸體飛快騎行。不知騎了多久，我的直覺告訴我，該是出手的時候了。于是我用盡全身的力氣，將這只手甩了出去。我似乎將尸體甩過墻，甩到了巷子的另一邊。體育課上扔鉛球，我的成績一向很差。不知道為何，這時迸發(fā)出這么大的力氣。我好像還握著這只手掄了幾個圈才脫手。但由于緊張，我已經(jīng)忘了我到底有沒有握著它掄幾圈。

以135匹貴州矮馬和伊犁馬的血液基因組DNA為模板，分別以GHR1028F1/R1和GHR1028F2/R2兩對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到370和724 bp兩種條帶，將只有一條370 bp條帶定義為AA基因型，只有一條724 bp帶定義為BB基因型，出現(xiàn)370和724 bp兩條帶定義為AB基因型(圖2)。

隨機(jī)選擇部分純合的AA和BB基因型擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測序(圖2)，證實A等位基因(370 bp)1028位為堿基C，編碼GHR蛋白第343位丙氨酸(Ala 343)；B等位基因(724 bp)相應(yīng)位置為T堿基，編碼纈氨酸(Val 343)。

M.DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000； 1、3、7.AA基因型； 2、4、6.AB基因型； 5.BB基因型； 8.陰性對照。A等位基因為C1028，B等位基因為T1028M.DL2000 DNA marker；1，3，7.AA genotype；2，4，6.AB genotype；5.BB genotype；8.Negative control.The nucleotide of allele A was C1028 and allele B was T1028 at site 1028 of GHR gene圖2 GHR編碼區(qū)1028位點的多態(tài)性檢測(左)及序列比較(右)Fig.2 Detection and sequencing of GHR polymorphism at site 1028

按貴州矮馬和伊犁馬GHR基因編碼區(qū)1028位點的基因型和等位基因頻率進(jìn)行分析(表3)，AB基因型在貴州矮馬和伊犁馬中為優(yōu)勢基因型，分別占0.757、0.672，兩個馬群的Fis值均為負(fù)值，群體的雜合子較為豐富。貴州矮馬A等位基因占優(yōu)勢，為0.568，伊犁馬以B等位基因為主，為0.598，經(jīng)卡方雙側(cè)檢驗，χ2=5.785，P=0.016，差異顯著(P<0.05)。兩個馬群GHR基因1028位點的PIC值均為0.25～0.5，屬于中度多態(tài)信息位點；與伊犁馬相比，貴州矮馬的觀察雜合度(Observed heterozygosity，Ho)、期望雜合度(Expected heterozygosity，He)、有效等位基因數(shù)(Effective number of alleles，Ne)、Shannon信息指數(shù)(Shannon's information index，I)、多態(tài)信息含量(Polymorphism information content，PIC)均較高，表明貴州矮馬GHR基因1028位點的遺傳多樣性更為豐富。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗，兩個馬群GHR基因1028位點不符合Hardy-Weinberg平衡。

表3GHR基因1028位點等位基因頻率及HWE檢驗

Table 3 Frequencies of allele inGHRgene at site 1028 and Hardy-Weinberg equilibrium(HWE) detection

項目Item貴州矮馬Guizhoupony伊犁馬Ilehorse樣品數(shù)(n)7461基因型頻率Frequenciesofgenotype AA0．189(14)0．066(4) AB0．757(56)0．672(41) BB0．054(4)0．262(16)等位基因頻率Frequenciesofallele A0．5680．402 B0．4320．598Hardy?Weinberg平衡Hardy?Weinbergequilibrium χ221．1829．300 P0．0000．002群體遺傳學(xué)指標(biāo)Indexesforpopulations Ho0．7570．672 He0．4910．481 Ne1．9641．926 I0．6840．674 PIC0．3700．365 Fis-0．542-0．398

按貴州矮馬和伊犁馬的GHR基因1028位點3種基因型AA、BB和AB，分析不同基因型個體的體尺指標(biāo)差異(表4)，貴州矮馬的管圍、尻高兩項指標(biāo)有顯著差異，AB基因型的管圍明顯高于BB基因型(P<0.05)，AB基因型的尻高明顯高于AA型(P<0.05)，其他指標(biāo)之間差異不明顯(P>0.05)。AB型伊犁馬的尻高明顯高于AA型(P<0.05)。

表4 據(jù)GHR基因1028位點基因型對馬體尺指標(biāo)的影響

Table 4 Influence of genotypes ofGHRat site 1028 on body sizes in horse

體尺/cmBodysize貴州矮馬Guizhoupony伊犁馬IlihorseAAABBBAAABBB體高Bodyheight112．00±1．41115．54±4．51111．25±3．86145．01±3．01147．01±2．56143．76±4．13體長Bodylength107．50±3．54113．10±5．52109．75±4．99149．38±5．61152．15±3．16148．91±4．51胸圍Chestgirth124．50±4．95131．52±7．47126．50±1．00166．88±5．75169．14±2．35167．65±4．21管圍Cannoncircumference14．50±0．71ab15．25±0．89a13．88±0．25b17．61±1．2318．22±0．4517．85±0．15頭長Headlength38．00±1．4138．56±2．1736．50±1．7351．72±1．2152．06±0．9349．21±1．32頸長Necklength44．25±1．0647．14±5．4444．50±1．2965．33±2．3566．53±2．3263．96±3．21胸深Chestdepth44．25±1．7745．68±3．1142．38±2．1467．32±1．9669．83±1．6266．09±3．11背高Backheight109．25±1．77111．85±4．25106．38±2．63139．21±2．33141．93±3．21138．61±3．56尻高Rumpheight109．25±2．48a115．510±4．06b112．750±3．40ab149．19±1．90a155．13±1．12b153．29±3．21ab前肢長Forelimblength57．89±0．5057．78±2．9756．14±2．5079．34±4．2378．50±0．7180．00±3．56前膊長Forearmlength22．69±0．7324．14±1．2622．50±0．9335．62±3．2637．21±1．2134．56±2．94前系長Forelinelength7．75±0．357．735±0．547．38±0．489．05±0．918．36±1．557．97±1．63胸圍率/%Chestgirthratio111．16±3．5113．830±1．65113．75±1．26115．30±1．32115．43±0．91116．53±1．35

同行不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。表6和表8同

The differences were significant in the same row with different lowercases at 0.05 level.It was the same as Table 6 and Table 8

2.3GHR基因1267位點的多態(tài)性檢測

采用引物GHR1267F1/R1和GHR1267F2/R2，檢測貴州矮馬和伊犁馬血液基因組中GHR基因1267位點的多態(tài)性變化，經(jīng)AS-PCR得到156和338 bp兩種條帶。將156 bp條帶定義為CC基因型，338 bp定義為DD基因型，156和338 bp條帶同時出現(xiàn)為CD基因型(圖3)。隨機(jī)回收CC和DD基因型擴(kuò)增片段克隆測序，證實C等位基因(156 bp)中1267位點為堿基C，編碼亮氨酸(Leu423)，D等位基因(338 bp)1267位點為堿基T，編碼苯丙氨酸(Phe423)。

據(jù)貴州矮馬、伊犁馬GHR基因編碼區(qū)1267位點基因型和等位基因頻率進(jìn)行分析(表5)，雜合的CD基因型在貴州矮馬和伊犁馬中為優(yōu)勢基因型，分別為0.851、0.705，兩個馬群的Fis值均為負(fù)值，雜合子較豐富。貴州矮馬D等位基因略占優(yōu)勢(0.534)，伊犁馬以C等位基因為主，為0.549，經(jīng)卡方檢驗(χ2=1.281，P=0.258)，二者之間的差異不顯著(P>0.05)。貴州矮馬的Ho較高，He、Ne、I和PIC值接近；兩個馬群體均不符合Hardy-Weinberg平衡，表明貴州矮馬GHR基因1267位點的遺傳多樣性與伊犁馬相近。

據(jù)貴州矮馬和伊犁馬的GHR基因1267位點的基因型，分析不同基因型個體的體尺指標(biāo)差異(表6)，未發(fā)現(xiàn)GHR基因的1027位點基因型對馬的體尺指標(biāo)有顯著的影響(P>0.05)。

M.DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1、4.CC基因型； 2、3、5.CD基因型；6.DD基因型；7.陰性對照。C等位基因為C1267，D等位基因為T1267M.DL2000 DNA marker；1，4.CC genotype；2，3，5.CD genotype；6.DD genotype；7.Negative control.The nucleotide of allele C was C1267 and allele D was T1267 at site 1267 in GHR gene圖3 GHR編碼區(qū)1267位點的多態(tài)性檢測和序列比較Fig.3 Detection and sequencing of GHR polymorphism at site 1267

表5GHR基因1267位點等位基因頻率和HWE檢驗

Table 5 Frequencies of allele inGHRgene at site 1267 and Hardy-Weinberg equilibrium detection

項目Item貴州矮馬Guizhoupony伊犁馬Ilehorse樣品數(shù)(n)7461基因型頻率Frequenciesofgenotype CC0．041(3)0．197(12) CD0．851(63)0．705(43) DD0．108(8)0．098(6)等位基因頻率Frequenciesofallele C0．4660．549 D0．5340．451Hardy?Weinberg平衡Hardy?Weinbergequilibrium χ236．65210．527 P0．0000．001群體遺傳指標(biāo)Indexesforpopulations Ho0．8510．705 He0．4980．495 Ne1．9911．981 I0．6910．688 PIC0．3740．373 Fis-0．711-0．424

2.4GHR基因1471位點的多態(tài)性分析

以貴州矮馬、伊犁馬的血液基因組DNA為模板，分別以引物GHR1471F1/R1和GHR1471 F2/R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到137和485 bp兩種條帶。對所有樣品進(jìn)行AS-PCR分析，得到3種帶型，只有一條137 bp條帶定義為EE基因型，只有485 bp一條帶定義為FF基因型，出現(xiàn)137和485 bp兩個條帶為EF基因型(圖4)。經(jīng)克隆測序證實，E等位基因(137 bp)1471位為堿基G，編碼GHR第491位甘氨酸(Gly 491)；F等位基因(485 bp)為堿基A，編碼絲氨酸(Ser 491)。

表6GHR基因1267位點基因型對馬體尺指標(biāo)的影響

Table 6 Influence of genotypes ofGHRat site 1267 on body sizes in horse

體尺/cmBodysize貴州矮馬Guizhoupony伊犁馬IlihorseCCCDDDCCCDDD體高Bodyheight114．87±6．30115．19±4．53115．08±5．10145．71±3．72146．16±1．21147．81±5．12體長Bodylength113．57±5．66112．71±5．74113．17±3．55151．20±3．92150．68±2．30153．57±4．31胸圍Chestgirth130．65±6．96131．18±7．65129．50±4．37168．65±2．51169．53±2．96171．81±3．81管圍Cannoncircumference15．20±1．0815．21±0．9114．83±0．7517．16±0．7618．35±0．8718．76±0．95頭長Headlength38．35±3．2238．51±2．1938．17±1．1751．51±0．8750．76±0．7751．13±0．98頸長Necklength45．97±3．8746．94±5．5446．67±1．6365．88±1．5766．71±15466．32±2．77胸深Chestdepth45．11±2．9645．57±3．2144．67±1．8468．75±2．7669．31±2．1570．56±2．11背高Backheight112．10±3．96111．55±4．32110．42±4．67141．87±3．05140．25±2．76142．43±3．22尻高Rumpheight115．95±6．12115．13±4．00115．08±5．87151．67±3．88150．73±2．76152．32±4．77前肢長Forelimblength57．31±3．5857．81±2．9156．72±2．9979．66±5．1080．83±4．26278．39±4．15前膊長Forearmlength24．17±1．6324．06±1．2723．85±1．3236．81±3．1535．97±2．3434．37±3．91前系長Forelinelength6．98±0．977．73±0．517．750±0．768．50±0．368．90±0．758．10±1．11胸圍率/%Chestgirthratio113．08±1．97113．88±5．30112．53±1．88115．63±1．78116．30±2．15116．70±1．21

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000； 1、2、4.EF基因型； 3、6.FF基因型；5.EE基因型。E等位基因為C1471，F(xiàn)等位基因為A1471M.DL2000 DNA marker；1，2，4.EF genotype；3，6.FF genotype；5.EE genotype.The nucleotide of allele E was G1471 and allele F was A1471 at site 1471 of GHR gene圖4 GHR編碼區(qū)1471位點的多態(tài)性檢測和序列比較Fig.4 Detection and sequencing of GHR polymorphism at site 1471

對貴州矮馬和伊犁馬GHR基因編碼區(qū)1471位點的基因型和基因頻率進(jìn)行統(tǒng)計(表7)，EF基因型在貴州矮馬及伊犁馬中為優(yōu)勢基因型，分別為0.784、0.918，貴州矮馬中未發(fā)現(xiàn)FF型，伊犁馬中未檢測到EE基因型。兩個馬群的Fis值均為負(fù)值，雜合子豐富，而且伊犁馬群表現(xiàn)為高度雜合。

貴州矮馬中E等位基因占優(yōu)勢(0.608)，伊犁馬以F等位基因較多(0.541)。經(jīng)卡方雙側(cè)檢驗，χ2=4.522，P=0.033，貴州矮馬與伊犁馬等位基因頻率間的差異顯著(P<0.05)。與伊犁馬相比，貴州矮馬的Ho、He、Ne、I、PIC值較小，表明貴州矮馬GHR基因1471位點的遺傳多樣性較低。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗，兩個馬群GHR基因的1471位點變化不符合Hardy-Weinberg平衡。

以貴州矮馬和伊犁馬的GHR基因1471位點的基因型為依據(jù)，對各基因型的體尺指標(biāo)進(jìn)行多重比較(表8)，EE基因型的胸圍率顯著高于EF型(P<0.05)，其他指標(biāo)差異不顯著(P>0.05)。

表7GHR基因1471位點等位基因頻率及HWE檢驗

Table 7 Frequencies of allele inGHRgene at site 1471 and Hardy-Weinberg equilibrium detection

項目Item貴州矮馬Guizhoupony伊犁馬Ilehorse樣品數(shù)(n)7461基因型頻率Frequenciesofgenotype EE0．216(16)0．000(0) EF0．784(58)0．918(56) FF0．000(0)0．082(5)等位基因頻率Frequenciesofallele E0．6080．459 F0．3920．541Hardy?Weinberg平衡Hardy?Weinbergequilibrium χ230．13043．077 P0．0000．000群體遺傳學(xué)指標(biāo)Indexesforpopulations Ho0．7840．918 He0．4770．497 Ne1．9111．98 I0．6700．690 PIC0．3630．373 Fis-0．644-0．849

表8GHR基因1471位點基因型對馬體尺指標(biāo)的影響

Table 8 Influence of genotypes ofGHRat site 1471 on body sizes in horse

體尺/cmBodysize貴州矮馬Guizhoupony伊犁馬IlihorseEEEFEFFF體高Bodyheight114．50±5．66115．20±4．56146．69±4．32147．13±3．55體長Bodylength113．50±12．02112．73±5．36151．31±5．65152．39±3．56胸圍Chestgirth137．00±8．49130．76±7．30170．77±4．76167．94±4．86管圍Cannoncircumference15．00±2．8315．17±0．8218．31±1．6317．91±1．55頭長Headlength37．25±1．0638．52±2．1251．66±2．0352．38±1．96頸長Necklength47．25±3．8946．89±5．3266．82±1．9667．13±2．03胸深Chestdepth46．50±0．7145．43±3．1469．53±1．6768．54±1．09背高Backheight112．00±5．66111．40±4．34140．65±3．78142．53±3．77尻高Rumpheight114．25±6．01115．15±4．17152．87±3．51150．66±4．86前肢長Forelimblength55．61±4．7157．77±2．8679．250±6．71881．327±4．082前膊長Forearmlength23．74±2．7324．04±1．2336．78±1．9735．45±1．11前系長Forelinelength7．71±0．357．72±0．548．54±0．679．23±0．46胸圍率/%Chestgirthratio115．65±1．50a113．51±1．60b116．73±0．97a114．86±0．63b

2.5 群體遺傳學(xué)分析

對貴州矮馬和伊犁馬兩個群體3個SNPs位點的變異進(jìn)行中性檢驗(Ewens-Watterson test for neutrality)[12]，結(jié)果顯示，3個位點的F值均在L95和U95之間(表9)，說明這3個位點的核苷酸變異為中性突變。

計算兩個群體間的Nei遺傳距離為0.034，相似性(Nei's genetic identity)為0.967。據(jù)Fst值進(jìn)行基因流分析(表10)，位點1267的Fst值最小，為0.007，表明99.3%的差異存在于群體內(nèi)部，群體之間的差異最小，Nm值最大，為36.063，表明兩個群體在1267位點交流的頻率最高。位點1028的Fst值最大，Nm值最小，表明兩個馬群在1028位點有基因交流。

表9 兩個馬群的中性檢驗

Table 9 Neutral detection between 2 horse populations

site1028site1267site1471貴州矮馬Guizhoupony N148148148 Obs．F0．5090．5020．523 L950．5020．5050．503 U950．9870．9870．987伊犁馬Ilihorse N122122122 Obs．F0．5190．5050．503 L950．5020．5030．502 U950．9840．9840．984

表10 兩個馬群的基因流分析

Table 10 Gene flow analysis in 2 horse populations

位點LocusNFisFitFstNm?site1028270-0．471-0．4300．0288．822site1267270-0．567-0．5570．00736．063site1471270-0．749-0．7100．02210．946

*Nm= Gene flow estimated fromFst= 0.25 (1-Fst)/Fst

2.6 SSCP-PCR檢測GHR基因外顯子10中1697和1732位點的多態(tài)性

分別以貴州矮馬和伊犁馬的血液基因組DNA為模板，用引物GHRssF/GHRssR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，只得到1條帶(圖5)，經(jīng)克隆測序，確為預(yù)期的197 bp條帶，位于GHR基因編碼區(qū)1 574～1 770 bp區(qū)段。

以12%聚丙烯酰胺凝膠對197 bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP檢測，共得到兩種帶型，一種為2條帶，另一種有3條帶，分別定義為GG和GH基因型(圖5)。135份血液樣品中，僅有一匹貴州矮馬(124號)為GH型，其他樣品均為GG型。

將124號貴州矮馬擴(kuò)增得到的3條SSCP條帶分別回收，作為模板進(jìn)行二次擴(kuò)增，克隆測序得到兩種序列，在GHR基因編碼區(qū)1697位和1732位點各有一個A/G變異(圖6)，并導(dǎo)致566位酪氨酸變成半胱氨酸，第578位精氨酸變成甘氨酸。

M.DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000； 1～6.PCR產(chǎn)物；7～11.GG基因型；12.GH基因型M.DL2000 DNA marker；1-6.PCR products；7-11.GG genotype；12.GH genotype圖5 GHR基因外顯子10片段的PCR擴(kuò)增及SSCP檢測Fig.5 Amplification and detection of partial exon 10 in GHR gene by PCR and SSCP methods

圖6 GHR基因1697和1732位點的序列比較Fig.6 Nucleotide changes in GHR gene at sites 1697 and 1732

3 討 論

對15匹貴州矮馬GHR基因外顯子10區(qū)域進(jìn)行測序，共檢測到10個核苷酸變異，其中5個SNPs位點引起了氨基酸改變，為編碼區(qū)第1028、1267、1471、1697、1732位點，導(dǎo)致氨基酸改變：V343A、L423F、S491G、Y566C、R578G。

對1267位點的C/T變異進(jìn)行群體檢測，貴州矮馬中C、D等位基因的頻率與伊犁馬間的差異不顯著，多重比較未找到有明顯差異的體尺指標(biāo)；1267位點的Nm值是3個位點中最大的(表10)，即矮馬與伊犁馬在該位點可能有較為頻繁的基因交流，使得1267位點在兩個群體間的差異最小。在人群和其他動物中未發(fā)現(xiàn)相同的點突變。

1471位點為A/G變異，貴州矮馬中未發(fā)現(xiàn)FF型，伊犁馬未檢測到EE基因型。貴州矮馬E等位基因占優(yōu)勢，伊犁馬以F等位基因為主，之間差異顯著。E等位基因編碼G491，F(xiàn)等位基因編碼S491。經(jīng)比較，EE基因型個體的胸圍率明顯高于EF基因型個體(P< 0.05)(表8)，提示E等位基因可能有促進(jìn)馬胸圍率的作用。從人類SNP數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，同源位點存在C/T變異(dbSNP，rs6176)，C/T變異處于密碼子的第3位(AGC/AGT)，均編碼Ser491，為同義突變。該位點與亞洲人群的下頜高度沒有直接的聯(lián)系[17]。與人的S491S變異不同，本研究從兩個馬群中檢測到的A/G變異導(dǎo)致了氨基酸改變，由Ser變?yōu)镚ly。突變后的甘氨酸較絲氨酸少了羥基的影響。從一名特發(fā)性矮小患者GHR基因中檢測到496位點發(fā)生Ala/Thr突變[18-19]，在496位點的N端即為保守的Y487，是JAK2磷酸化GHR的作用位點[5]，矮馬GHR的S491G位點距Y487和496位點分別相隔3和5個氨基酸，非常近。S491G改變是否會影響到貴州矮馬GHR蛋白Y487位點的磷酸化，還有待積累更多的試驗數(shù)據(jù)。

采用SSCP方法檢測1697、1732兩個變異位點在貴州矮馬和伊犁馬群體中的頻率。只有一匹貴州矮馬(124號)為GH基因型，其余樣品均為GG型；經(jīng)測序證實124號矮馬GHR基因編碼區(qū)1697位和1732位點均為雜合型，導(dǎo)致Y566C、R578G替換。124號貴州矮馬的體高為106 cm，雄性，6歲，已繁殖了十余個后代，是供試樣本中最矮的個體。Y566C是GHR蛋白中5個保守的磷酸化位點之一[5]。人成熟GHR胞內(nèi)區(qū)有5個酪氨酸是JAK2磷酸化作用位點，包括469、516、548、577和609[5]，這5個酪氨酸從哺乳類到魚類都很保守[20]，其中548位點對應(yīng)于貴州矮馬GHR的Y566C位點。GH誘導(dǎo)GHR形成二聚體，JAK2結(jié)合于GHR上使GHR的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，做為胞內(nèi)下游信號分子的結(jié)合位點。已知人GHR的454～620區(qū)域是GHR與SHC-MAPK(Src-homology and collagen homology-mitogen-activated protein kinase)信號結(jié)合的區(qū)域，MAPK通道被激活，可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，促進(jìn)代謝相關(guān)酶類的合成，影響機(jī)體的代謝和生長[2，21-23]。124號貴州矮馬(單倍型H3，表2)GHR基因1697位點突變?yōu)镚，編碼Cys566，且為雜合子，可能引起GHR的磷酸化不足，減弱下游的信號傳導(dǎo)，但對124號矮馬的繁殖功能似乎影響不大；此外，1732位點導(dǎo)致578位點從精氨酸變成甘氨酸，從帶正電荷的堿性氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷姆菢O性氨基酸，有可能會對GHR蛋白的空間結(jié)構(gòu)及功能產(chǎn)生影響。已有研究證明，人GHR成熟蛋白中的P561T多態(tài)性影響亞洲人的下頜骨生長，而且與體高相關(guān)[21]，人P561T位點對應(yīng)于GHR蛋白前體的P579位，與本研究檢測到的矮馬R578G緊鄰。此外，安格斯牛GHR基因啟動子區(qū)的SNP位點直接影響血清中的IGF-1含量，通過腺垂體-生長激素-胰島素樣生長因子1軸削弱了骨的生長，導(dǎo)致矮小[22]。貴州矮馬1697和1732兩個位點的多態(tài)性變化是否影響矮馬長骨的生長有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

從貴州矮馬基因組GHR外顯子10區(qū)域發(fā)現(xiàn)5個SNPs位點引起了氨基酸變化，其中貴州矮馬1028位點以A等位基因占優(yōu)勢，與較粗的管圍、較低的尻高相關(guān)，1471位點以E等位基因為主，對應(yīng)較高的胸圍率；1697和1732位點以雜合型存在于矮馬中，是否影響體高有待進(jìn)一步研究。本試驗的研究結(jié)果提示，GHR基因外顯子10的多態(tài)性變化可能影響貴州矮馬個體的生長。

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(編輯 郭云雁)

Polymorphism of Five SNPs in Exon 10 of Growth Hormone Receptor Gene in Guizhou Pony(Equuscaballus)

RAN Xue-qin1*，ZHAO Xing-yan1，WANG Jia-fu2，TIAN Song-jun3，WEI Xiao-hong3

(1.FacultyofAnimalScience，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China；2.InstituteofAgro-Bioengineering，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China；3.BureauofAnimalHusbandryandVeterinaryofZiyunofGuizhou,Ziyun550800，China)

To explore the reason for the slow growth of Guizhou pony，sequences of exon 10 inGHRgene were cloned from the genome of Guizhou pony by polymerase chain reaction(PCR) and gene cloning methods.Distribution of 5 single nucleotide polymorphism(SNP) sites was determined by allele-specific PCR(AS-PCR) and single-strand conformation polymorphism(SSCP) methods.Taking Ili horse as control，the relationship between the genotypes ofGHRand body sizes of Guizhou pony and Ili horse was calculated based on population genetics and bioinformatics algorithms.The results showed that a total of 10 haplotypes of exon 10 ofGHRgene were sequenced from Guizhou pony，in which contained 10 SNP sites.Among them，5 sites，1028，1267，1471，1697 and 1732，changed the amino acid residues of GHR.Frequencies of 3 sites，1028，1267 and 1471，were tested by AS-PCR method.Compared with Ili horse，allele A at site 1028 was dominant and related with the lower rump height and higher cannon circumference in Guizhou pony.The percentage of allele E at 1471 site in Guizhou pony was higher than that in Ili horse and related to higher chest girth ratio of pony.Heterozygous genotypes of 1697 and 1732 sites were detected from the shortest male pony with 106 cm in height，6 years old.The V343A change resulted from 1028 site located in the ubiquitin-dependent endocytosis(UbE) motif and might affect the GHR internalization and degradation.Changes at S491G，Y566C and R578G sites resulted from SNP sites of 1471，1697 and 1732，might directly or indirectly impact the phosphorylation of GHR and influence the activation of signal transduction pathways.It suggested that the polymorphisms in exon 10 ofGHRgene might have an effect on the growth and development of Guizhou pony.

Guizhou pony；growth hormone receptor gene；exon 10；SNP

2014-12-19

貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目(黔科合NY字[2012]3009號；黔科合NY字[2009]3068號)；貴州省農(nóng)業(yè)動植物育種專項(黔農(nóng)育專字2009-021號)；貴州省科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊建設(shè)專項(黔科合人才團(tuán)隊2009-4006)

冉雪琴(1967-)，女，重慶人，博士，主要從事動物生理學(xué)與分子生物學(xué)研究

*通信作者：冉雪琴，教授，Tel：0851-8298070，F(xiàn)ax：0851-88298070，E-mail：as.xqran@gzu.edu.cn

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.009

S821；S813.3

A

0366-6964(2015)11-1974-13