Cdk5-CRMP通路在七氟醚抑制新生大鼠前額葉皮層樹突發(fā)育中的作用*

劉延輝，夏淑軒，劉雅芳，柳垂亮，李玉娟△(中山大學(xué)附屬孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院麻醉科，廣東廣州500;佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院麻醉科，廣東佛山58030)

·論著·

Cdk5-CRMP通路在七氟醚抑制新生大鼠前額葉皮層樹突發(fā)育中的作用*

劉延輝1，夏淑軒1，劉雅芳1，柳垂亮2，李玉娟1△
(1中山大學(xué)附屬孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院麻醉科，廣東廣州510120;2佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院麻醉科，廣東佛山528030)

目的:探究七氟醚對(duì)新生大鼠前額葉皮層(prefrontal cortex，PFC)樹突發(fā)育的影響及與細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶5(cyclin dependent kinase 5，Cdk5) -坍塌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(collapsin response mediator protein，CRMP)通路的關(guān)系。方法: 88只出生后7 d的SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組22只:空白對(duì)照組(Air + NS組)，Cdk5抑制劑roscovitine(Ros)對(duì)照組(Air + Ros組)，Sevo + NS組，Sevo + Ros組。前2組吸入空氣，后2組吸入2. 8%七氟醚4 h。Air + Ros組和Sevo + Ros組在麻醉前15 min經(jīng)腹腔注射10 mg/kg的Cdk5抑制劑roscovitine。其余2組則在麻醉前15min經(jīng)腹腔注射150 μL生理鹽水。麻醉結(jié)束后，每組各取5只幼鼠，取出新鮮皮質(zhì)組織，Western blot檢測(cè)P35、P25、Cdk5，CRMP1、2、4的蛋白表達(dá)以及CRMP2 Ser 522的磷酸化水平。剩余幼鼠繼續(xù)飼養(yǎng)，出生后30 d每組各取6只幼鼠，取腦進(jìn)行高爾基染色，制備冰凍切片，鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài)。其余幼鼠在出生后25～27 d進(jìn)行曠場(chǎng)試驗(yàn)，31～32 d進(jìn)行情景依賴性恐懼記憶檢測(cè)。結(jié)果: (1)與Air + NS組比較，Sevo + NS組的P35減少了47. 32%，同時(shí)P25增加了173. 77%(P＜0. 05) ; Sevo + Ros組的P35比Sevo + NS組增加了78. 81%，其P25則減少了60. 22%(P＜0. 05)。Cdk5表達(dá)組間差異尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)與Air + NS組比較，Sevo + NS組的總CRMP1、2 和4表達(dá)分別下降了36. 22%、53. 74%和51. 28% (P＜0. 05)，同時(shí)p-CRMP2 Ser522/CRMP2比值增加了96. 20% (P＜0. 05) ; Sevo + Ros組的總CRMP1和4與Sevo + NS組比較分別增加了56. 95%和88. 91% (P＜0. 05)，而p-CRMP2 Ser522/CRMP2比值下降了43. 58% (P＜0. 05)。(3)與Air + NS組比較，Sevo + NS組的樹突總長(zhǎng)度、第二級(jí)樹突長(zhǎng)度以及60和80 μm直徑圓環(huán)上的交點(diǎn)數(shù)均顯著下降(P＜0. 01)。Sevo + Ros組的樹突總長(zhǎng)度、第二級(jí)樹突長(zhǎng)度以及60和80 μm直徑圓環(huán)上的交點(diǎn)數(shù)均比Sevo + NS組顯著增加(P＜0. 05)。(4)在恐懼記憶實(shí)驗(yàn)中，與Air + NS組比較，Sevo + NS組大鼠的“木僵”時(shí)間比Air + NS組減少約21% (P＜0. 05)。Sevo + Ros組的“木僵”時(shí)間比Sevo + NS組顯著增加(P＜0. 05)。各組幼鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:七氟醚抑制了新生大鼠前額葉皮層神經(jīng)元樹突的正常生長(zhǎng)發(fā)育和幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力，而Cdk5-CRMP通路激活可能是七氟醚引起神經(jīng)發(fā)育毒性的機(jī)制之一。

七氟醚;前額葉皮層;細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶5;坍塌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of sevoflurane (Sevo) on the dendritic development in prefrontal cortex (PFC) of neonatal rats and the role of cyclin dependent kinase 5 (Cdk5) - collapsin response mediator protein (CRMP) pathway in it.METHODS: Eighty-eight postnatal day 7 Sprague Dawley (SD) rats were randomly divided into 4 groups (n =22) : Air + NS group，Air + roscovitine (Ros) group，Sevo + NS group and Sevo + Ros group.The rats inAir + NS group and Air + Ros group were exposed to the air for 4 h，while the rats in the other 2 groups were exposed to 2. 8% sevoflurane for 4 h.The rats received intraperitoneal injection of 150 μL normal saline 15 min before exposure in the Air + NS group and Sevo + NS group，while the rats in the Air + Ros group and Sevo + Ros group received intraperitoneal injection of 150 μL roscovitine (in DMSO solution，10 mg/kg) 15 min before exposure.At the end of exposure，the cortices of the rat brain were collected and the protein levels of P35，P25，Cdk5，CRMP1，CRMP2，CRMP4 and p-CRMP2 Ser522 in PFC were detected by Western blot.On the postnatal day 30，the rat brains were sectioned for Golgi-Cox staining and morphological analysis of dendrites in the PFC neurons.Open-field test and contextual fear conditioning test were performed on postnatal days 25～27 and 31～32，respectively.RESULTS: Compared with Air + NS group，the expression of P35 in the Sevo + NS group was significantly decreased，and the expression of P25 was dramatically increased (P＜0. 05)，whereas roscovitine partly reversed the changes above induced by sevoflurane (P＜0. 05).The expression of Cdk5 was not significantly different among all groups.Compared with the Air + NS group，the expression of CRMP1，2，and 4 in the Sevo + NS group were decreased，and the protein level of p-CRMP2 Ser522/CRMP2 was increased (P＜0. 05)，whereas roscovitine partly reversed the changes above induced by sevoflurane (P＜0. 05)，except for the expression of CRMP2.Compared with Air + NS group，the total dendrite length，secondary dendritic length and interactions on 60 and 80 μm shells in the Sevo + NS group were decreased (P＜0. 01)，whereas roscovitine partly reversed the changes above induced by sevoflurane (P＜0. 05).Compared with Air + NS group，the percentage of freezing time in the Sevo + NS group was decreased (P＜0. 01)，whereas roscovitine partly reversed the changes induced by sevoflurane (P＜0. 05).No significant difference among groups in the open-field test was observed.CONCLUSION: Sevoflurane exposure disturbed dendritic development of neurons in PFC，learning and memory ability of neonatal rats，which may be mediated by Cdk5-CRMP pathway.

［KEY WORDS］Sevoflurane; Prefrontal cortex; Cyclin dependent kinase 5; Collapsin response mediator protein

七氟醚(sevoflurane，Sevo)是臨床常用的吸入麻醉藥。近年來有不少回顧性研究指出嬰幼兒時(shí)期接受多次手術(shù)與麻醉與學(xué)齡期學(xué)習(xí)記憶能力下降，注意力障礙和行為異常有關(guān)［1］。而且，3歲前接受過麻醉的兒童，在10歲時(shí)出現(xiàn)語(yǔ)言以及抽象理解思維障礙的風(fēng)險(xiǎn)比未接受過麻醉的兒童更高［2］。動(dòng)物和細(xì)胞研究提示，全麻藥引起認(rèn)知功能障礙的機(jī)制，與其增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，誘導(dǎo)神經(jīng)元和神經(jīng)干細(xì)胞凋亡［3-4］、抑制神經(jīng)細(xì)胞增殖［4］等有關(guān)。近期的研究發(fā)現(xiàn)，全麻藥還可干擾神經(jīng)元的突觸發(fā)育，降低突觸的密度和復(fù)雜性［5-6］。但全麻藥是通過哪些分子機(jī)制來影響突觸發(fā)育的，目前并不明確。

腦發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過程，神經(jīng)元的遷移，突起的延伸以及突觸的形成，這些過程正確有序地進(jìn)行才能形成正常且有功能的神經(jīng)環(huán)路。坍塌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(collapsin response mediator proteins，CRMPs)家族是調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞突觸發(fā)育的重要分子，通過與細(xì)胞骨架如微管或微絲等相互作用，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的極化、樹突和軸突的生長(zhǎng)、細(xì)胞變形和遷移等。CRMP的磷酸化受周期素依賴性蛋白激酶5(cyclin dependent kinase 5，Cdk5)及糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)調(diào)控。Wang等［7］發(fā)現(xiàn)抑制過度激活的Cdk5通路有助于降低異氟醚暴露導(dǎo)致的新生大鼠神經(jīng)毒性。我們前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)異氟醚顯著增加了新生大鼠海馬CRMP2磷酸化水平，提示異氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)元的凋亡可能與增加CRMP2的磷酸化有關(guān)［8］。七氟醚對(duì)突觸發(fā)育的抑制是否與Cdk5-CRMP蛋白通路激活有關(guān)，目前尚無相關(guān)報(bào)道。

因此，本研究擬建立七氟醚處理新生幼鼠的模型，并采用Cdk5抑制劑預(yù)處理，研究七氟醚對(duì)前額葉皮層神經(jīng)元樹突發(fā)育的形態(tài)學(xué)影響，與樹突發(fā)育相關(guān)的CRMP蛋白家族表達(dá)的變化以及對(duì)大腦認(rèn)知功能的改變，并進(jìn)一步探討Cdk5-CRMP蛋白通路在七氟醚干擾樹突發(fā)育中的作用機(jī)制。

材料和方法

1材料

1.1儀器與試劑麻醉呼吸機(jī)(Ohmeda) ;氣體監(jiān)護(hù)儀(Datex) ; DM 6000熒光顯微鏡、冰凍切片機(jī)(Leica) ;曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)系統(tǒng)(Noldus information technology) ; STARTFEAR動(dòng)物恐懼記憶檢測(cè)系統(tǒng)(Panlab) ; Cdk5抑制劑roscovitine(Ros;購(gòu)自Selleck) ;七氟醚(雅培有限公司) ; p-CRMP2 Ser522多克隆抗體(ECM Biosciences) ; CRMP2多克隆抗體(CST) ; Cdk5抗體、CRMP1多克隆抗體、CRMP4多克隆抗體(Abcam) ;β-actin單克隆抗體(Santa Cruz) ; P35/P25抗體、羊抗兔Ⅱ抗、羊抗小鼠Ⅱ抗(上海碧云天生物技術(shù)公司) ; FD Rapid GolgiStainTMKit(FD NeuroTechnologies，Inc.)。

1.2動(dòng)物與分組88只SPF級(jí)出生后7 d SD大

鼠，雌雄不限，12～16 g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(粵) 2009-011。新生大鼠隨機(jī)分為4組:空白對(duì)照組(Air + NS組)、Cdk5抑制劑roscovitine對(duì)照組(Air + Ros組)、Sevo + NS組和Sevo + Ros組。前2組吸入空氣，后2組吸入2. 8%七氟醚4 h。Air + Ros組和Sevo + Ros組在麻醉前15 min經(jīng)腹腔注射10 mg/kg的Cdk5抑制劑roscovitine。Air + NS組和Sevo + NS組則在麻醉前15 min經(jīng)腹腔注射150 μL生理鹽水。麻醉結(jié)束后4h，每組各取5只幼鼠，取新鮮皮質(zhì)組織，Western blot檢測(cè)P35、P25、Cdk5，CRMP1、2、4蛋白表達(dá)以及CRMP2 Ser 522磷酸化水平。出生后30 d每組各取6只幼鼠，取腦進(jìn)行高爾基染色，制備冰凍切片，鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài)。其余幼鼠在出生后25～27 d進(jìn)行曠場(chǎng)試驗(yàn)，31～32 d進(jìn)行情景依賴性恐懼記憶檢測(cè)。

2方法

2.1七氟醚吸入麻醉模型的建立參照我們以前的方法［9］，將需要吸入七氟醚的P7新生大鼠置于自制透明麻醉箱內(nèi)，該麻醉箱與麻醉呼吸機(jī)回路連接，七氟醚以純氧作為載氣，經(jīng)麻醉?yè)]發(fā)罐進(jìn)入麻醉箱，麻醉箱出口處接氣體監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測(cè)麻醉氣體濃度、氧濃度和二氧化碳濃度。調(diào)整揮發(fā)罐刻度和氧氣流量，維持七氟醚濃度處于2. 8%。對(duì)照組動(dòng)物置入另一個(gè)麻醉箱中吸入空氣，吸入時(shí)間均為4 h。麻醉箱置于水浴箱中，溫度維持36～37℃。麻醉過程中大鼠保持自主呼吸，持續(xù)觀察大鼠的呼吸頻率和膚色。2.2 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)參照我們以前的方法［9］，麻醉結(jié)束后4 h，斷頭處死幼鼠，冰上快速分離皮質(zhì)，加入適量裂解液勻漿后提取蛋白，BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度并調(diào)平各組蛋白濃度。各樣本等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入如下Ⅰ抗:β-actin (1∶1 000 ) ; P35/P25 (1∶500) ; Cdk5、p-CRMP2 Ser522、CRMP1、CRMP2、CRMP4(1∶1 000)。4℃孵育過夜，1∶1 000Ⅱ抗室溫孵育2 h，使用ECL發(fā)光液進(jìn)行膠片顯影。膠片掃描后用Image J軟件測(cè)量蛋白條帶的灰度值。其中p-CRMP2 Ser522/CRMP2比值行半定量分析。

2.3高爾基染色根據(jù)FD Rapid GolgiStainTM試劑盒說明書進(jìn)行染色，大致步驟如下:完整腦組織取出后用雙蒸水洗去表面血液，濾紙吸干，放入AB混合液中避光浸泡約20 d，然后轉(zhuǎn)移至C液中繼續(xù)避光浸泡3～4 d。取出腦組織固定到冰凍切片機(jī)中進(jìn)行冠狀位切片，厚度設(shè)定為150 μm。根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜，為得到包含前額葉皮層的切片，切片范圍從對(duì)耳線14. 20 mm至13. 20 mm。切片固定在經(jīng)明膠處理的載玻片上，陰干24 h，然后浸泡于DE混合液中10 min進(jìn)行脫色，經(jīng)過后續(xù)漂洗、脫水、透明化處理后，用樹膠封片，－20℃避光保存，待鏡下觀察。2.4神經(jīng)元樹突形態(tài)學(xué)分析高爾基染色后的皮層第V層神經(jīng)元表現(xiàn)為以下特征: (1)神經(jīng)元胞體為錐形; (2)神經(jīng)元胞體處于第V層; (3)頂端樹突指向皮層表面并與第1層神經(jīng)元發(fā)生廣泛聯(lián)系; (4)底端樹突呈根系樣分布。每個(gè)鼠腦左右兩側(cè)各選擇5個(gè)合適的神經(jīng)元進(jìn)行分析，選擇標(biāo)準(zhǔn)為: (1)神經(jīng)元胞體處于切片的中央; (2)神經(jīng)元的樹突和軸突充分被染色; (3)神經(jīng)元胞體處至少發(fā)出3個(gè)樹突，每個(gè)樹突至少再分支1次。使用Leica DM6000顯微鏡在200倍下對(duì)選定的神經(jīng)元進(jìn)行Z軸掃描，然后使用Imaris軟件進(jìn)行神經(jīng)元重建，神經(jīng)元的胞體和突起都能被軟件追蹤，并繪畫出完整的模擬圖像，根據(jù)得出的模擬圖像測(cè)量以下指標(biāo): (1)各級(jí)樹突分支長(zhǎng)度; (2)樹突總長(zhǎng)度; (3)希恩分析(Sholl Analysis) :以神經(jīng)元胞體為中心繪制同心圓，每個(gè)圓環(huán)之間間距20 μm，統(tǒng)計(jì)同心圓與樹突產(chǎn)生的交點(diǎn)數(shù)量，以此估計(jì)樹突分支情況，空間分布和長(zhǎng)度。每個(gè)腦片隨機(jī)選取6個(gè)神經(jīng)元拍照分析，取其平均值作為該動(dòng)物的值。

2.5大腦認(rèn)知功能檢測(cè)大腦認(rèn)知功能檢測(cè)方法包括: (1)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn):曠場(chǎng)由四周為透明玻璃，黑色底面的箱子構(gòu)成，將大鼠從箱子的中心放入，任其自由運(yùn)動(dòng)10 min。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 d，在每天同一時(shí)點(diǎn)檢測(cè)。空間攝像裝置記錄大鼠所有的運(yùn)動(dòng)過程。分析軟件通過分析大鼠在箱子中總的平均運(yùn)動(dòng)距離和速度，以及穿越中心區(qū)的平均次數(shù)和在中心區(qū)停留的時(shí)間，評(píng)估大鼠是否有運(yùn)動(dòng)功能障礙以及焦慮抑郁。(2)情景依賴性恐懼記憶檢測(cè):在暗箱內(nèi)放置一個(gè)帶有揚(yáng)聲器的電擊箱，將31日齡的大鼠放入恐懼電擊箱中，適應(yīng)2 min，并對(duì)大鼠進(jìn)行連續(xù)5次的聲音條件刺激(2 000 Hz，90 dB，30 s)與聲音提示的非條件刺激(足底電刺激1 mA，2 s)相結(jié)合的訓(xùn)練，配對(duì)呈現(xiàn)5次以建立恐懼記憶模型。在24 h后將大鼠放回電擊箱8 min，檢測(cè)大鼠的“木僵時(shí)間”，通過計(jì)算木僵時(shí)間占實(shí)驗(yàn)總時(shí)間的百分比評(píng)估其場(chǎng)景恐懼記憶的能力。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad 6統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。Western blot、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、恐懼記憶檢測(cè)的組間比較采用單因素方差分析(oneway ANOVA)。各級(jí)樹突長(zhǎng)度的組間比較采用重復(fù)測(cè)量的多因素方差分析(two-way ANOVA with repea-ted measures)，七氟醚暴露及樹突分支層級(jí)分別視為兩個(gè)獨(dú)立因素。希恩分析的組間比較采用重復(fù)測(cè)量的多因素方差分析，七氟醚暴露及圓環(huán)直徑分別視為兩個(gè)獨(dú)立因素。所有組間兩兩比較均采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1七氟醚對(duì)新生大鼠生理的影響

在麻醉處理過程中，幼鼠呼吸均勻，膚色紅潤(rùn)，無明顯呼吸抑制。麻醉后幼鼠均正常生長(zhǎng)，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均存活，沒有出現(xiàn)意外死亡。

2新生大鼠皮質(zhì)P35、P25和Cdk5表達(dá)的變化

各組Cdk5表達(dá)整體比較差異不顯著。Air + NS組與Air + Ros組比較，P35和P25的蛋白水平差異均不顯著，提示單獨(dú)使用Cdk5抑制劑roscovitine并不會(huì)影響兩者的水平。與Air + NS組比較，Sevo + NS組的P35減少了47. 32% (P＜0. 05)，同時(shí)P25增加了173. 77% (P＜0. 05)，提示七氟醚暴露激活了新生大鼠PFC中的Cdk5通路。Sevo + Ros組的P35比Sevo + NS組增加了78. 81% (P＜0. 05)，其P25比Sevo + NS組減少了60. 22%(P＜0. 05)，提示roscovitine抑制了七氟醚誘導(dǎo)的Cdk5激活，見圖1。

Figure 1.The expression of P35，P25 and Cdk5 in the prefrontal cortex of neonatal rats.Mean±SEM.n =4.*P＜0. 05 vs Air + NS;#P＜0.05 vs Sevo + NS.圖1　新生大鼠前額葉皮層P35、P25和Cdk5表達(dá)的變化

3新生大鼠皮質(zhì)CRMP1、2、4蛋白以及磷酸化CRMP2 Ser522蛋白水平的變化

Air + NS組與Air + Ros組比較，總CRMP1、CRMP2、CRMP4以及p-CRMP2 Ser522/CRMP2差異均不顯著，提示單獨(dú)使用Cdk5抑制劑roscovitine并不會(huì)影響以上蛋白的水平。與Air + NS組比較，Sevo + NS組的總CRMP1、2和4表達(dá)分別下降了36. 22%、53. 74%和51. 28%，同時(shí)p-CRMP2 Ser522/ CRMP2比值增加了96. 20%，提示七氟醚暴露導(dǎo)致新生大鼠PFC中CRMP1、2和4的表達(dá)下調(diào)，并促進(jìn)CRMP2的Ser522位點(diǎn)磷酸化。Sevo + Ros組的總CRMP1、4和Sevo + NS組比較分別增加了56. 95% 和88. 91%，而p-CRMP2 Ser522/CRMP2比值則下降了43. 58%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示roscovitine一定程度逆轉(zhuǎn)了七氟醚暴露導(dǎo)致的部分CRMP蛋白表達(dá)和磷酸化改變，見圖2。

4新生大鼠前額葉皮層第V層錐體神經(jīng)元樹突形態(tài)發(fā)育的變化

高爾基染色后對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行鏡下觀察和軟件重建，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，分析指標(biāo)包括樹突總長(zhǎng)度，各級(jí)樹突長(zhǎng)度，以及希恩分析。

Air + NS組與Air + Ros組比較，樹突總長(zhǎng)度差異不顯著。與Air + NS組比較，Sevo + NS組的樹突總長(zhǎng)度下降了22. 80%(P＜0. 01)。Sevo + Ros組的樹突總長(zhǎng)度比Sevo + NS組增加了30. 02% (P＜0. 01)，提示七氟醚導(dǎo)致發(fā)育中的皮層神經(jīng)元樹突生長(zhǎng)受阻，而roscovitine部分逆轉(zhuǎn)了七氟醚的作用。

比較第二級(jí)樹突長(zhǎng)度，Air + NS組與Air + Ros組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Air + NS組比較，Sevo + NS組的第二級(jí)樹突長(zhǎng)度減少了30. 87%。Sevo + Ros組的第二級(jí)樹突長(zhǎng)度比Sevo + NS組增加了30. 23%。其余各級(jí)樹突長(zhǎng)度的組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示七氟醚毒性主要是影響皮層神經(jīng)元第二級(jí)樹突的發(fā)育。

分別比較60和80 μm直徑圓環(huán)上的交點(diǎn)數(shù)，Air + NS組與Air + Ros組相比較差異不顯著。與Air + NS組比較，Sevo + NS組在60和80 μm直徑圓環(huán)上的交點(diǎn)數(shù)分別減少了22. 47%和44. 44%。Sevo + Ros組在60和80 μm直徑圓環(huán)上的交點(diǎn)數(shù)比Sevo + NS組分別增加了33. 33%和55%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其余各直徑圓環(huán)上的交點(diǎn)數(shù)的組間比較差異不顯著。提示七氟醚還通過影響樹突發(fā)出分支和分支的空間延伸而影響神經(jīng)元發(fā)育，見圖3。

5新生大鼠大腦認(rèn)知功能的改變

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各組的運(yùn)動(dòng)總距離和平均速度整體比較差異不顯著，提示七氟醚和Cdk5抑制劑均沒有導(dǎo)致大鼠的運(yùn)動(dòng)能力障礙和情感抑郁或焦慮。

Figure 2.The protein levels of CRMP1，2，4 and p-CRMP2 Ser522 in the prefrontal cortex of neonatal rats.Mean±SEM.n = 5.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01vs Air + NS;#P＜0. 05 vs Sevo + NS.圖2　Roscovitine對(duì)新生大鼠前額葉皮層總CRMP1、2、4蛋白以及p-CRMP2 Ser522磷酸化蛋白水平的影響

情景依賴性恐懼記憶檢測(cè)發(fā)現(xiàn)24 h后“木僵”時(shí)間整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Sevo + NS組大鼠的“木僵”時(shí)間比Air + NS組減少約21% (P＜0. 01)，提示七氟醚損害了與海馬相關(guān)的恐懼記憶的維持(長(zhǎng)時(shí)記憶) ;而Sevo + Ros組與Sevo + NS組比較“木僵”時(shí)間增加了82% (P＜0. 05)，提示抑制Cdk5通路可以減輕七氟醚引起的認(rèn)知功能障礙，見圖4。

討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)七氟醚激活了新生大鼠皮質(zhì)Cdk5通路，提高了CRMP2 Ser522位點(diǎn)的磷酸化水平，降低了CRMP1、CRMP2與CRMP4總蛋白表達(dá)，抑制了幼鼠前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元樹突的生長(zhǎng)和分支，并損害了幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力。Cdk5抑制劑逆轉(zhuǎn)了七氟醚誘導(dǎo)的上述部分蛋白變化、樹突發(fā)育障礙和認(rèn)知功能損害，提示Cdk5-CRMP通路在七氟醚抑制新生大鼠樹突發(fā)育中起著重要作用。

Figure 3.Developmental morphology analysis of layer V pyramidal neurons in the prefrontal cortex of neonatal rats.A～D: the images captured under microscope (×200) ; E～H: the simulated images of pyramidal neurons reconstructed by Imaris; I～K: the quantitative analysis of total dendrite length，dendritic length at each level and Sholl analysis.Mean±SEM.n =6.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs Air + NS;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs Sevo + NS.圖3　Roscovitine對(duì)新生大鼠前額葉皮層第V層錐體神經(jīng)元形態(tài)發(fā)育的影響

Figure 4.Detection of cognitive impairment in neonatal rats.The results were compared by two-way ANOVA with Bonferroni post hoc test.Mean±SEM.n =11.＊＊P＜0. 01 vs Air + NS;#P＜0. 05 vs Sevo + NS.圖4　Roscovitine對(duì)新生大鼠大腦認(rèn)知功能發(fā)育的影響

前額葉皮質(zhì)作為大腦重要的組成部分，在抽象思維、適應(yīng)行為、策略決定、行為選擇等大腦高級(jí)功能方面起著重要作用［10-11］。因此，本研究選擇前額葉皮質(zhì)作為研究的對(duì)象。突觸形成是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它使各個(gè)孤立神經(jīng)元得以聯(lián)結(jié)成相互溝通的網(wǎng)絡(luò)。神經(jīng)元樹突的生長(zhǎng)、延展、空間分布，乃至樹突棘的數(shù)量和分布密度，均與突觸形成的數(shù)量與質(zhì)量密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與空氣對(duì)照組比較，新生大鼠接受七氟醚暴露后，樹突的總長(zhǎng)度、第二級(jí)樹突分支長(zhǎng)度以及希恩分析中60和80 μm直徑圓環(huán)交點(diǎn)數(shù)均出現(xiàn)顯著下降，說明樹突以及次級(jí)分支的生長(zhǎng)、延展受阻，提示七氟醚暴露干擾新生大鼠前額葉皮層神經(jīng)元樹突的正常生長(zhǎng)發(fā)育，影響突觸形成，進(jìn)而阻礙成熟神經(jīng)回路的形成。此外，本實(shí)驗(yàn)在新生大鼠七氟醚暴露后30 d，進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大鼠的木僵時(shí)間下降，提示七氟醚損害幼鼠記憶能力。由于神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的正確形成是大腦具備高級(jí)功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此七氟醚對(duì)樹突生長(zhǎng)發(fā)育的干擾可能是其導(dǎo)致認(rèn)知功能損害的重要原因之一。Briner等［12］研究發(fā)現(xiàn)出生后5 d和10 d的Wistar大鼠經(jīng)丙泊酚麻醉后，前葉皮質(zhì)第V層椎體神經(jīng)元的樹突棘密度顯著下降，與我們的結(jié)果一致。

CRMP蛋白家族，包括CRMP1～5共5個(gè)成員，在發(fā)育階段的神經(jīng)組織中豐富表達(dá)。CRMP1沿著細(xì)胞內(nèi)微管進(jìn)行分布，參與突起生長(zhǎng)、細(xì)胞變形和遷移過程［13］。CRMP4則與微絲結(jié)合促進(jìn)微絲的聚集，有促進(jìn)突起形成和生長(zhǎng)的作用［14］。CRMP2主要通過與微管蛋白二聚體結(jié)合，參與神經(jīng)元極化和軸突生長(zhǎng)過程［15］。磷酸化的CRMP2導(dǎo)致與微管蛋白二聚體的結(jié)合能力下降［16］，抑制軸突生長(zhǎng)，而且也參與了樹突發(fā)育的調(diào)節(jié)。CRMP2 Ser522位點(diǎn)磷酸化可通過Cdk5激活調(diào)節(jié)，而Cdk5的活性受到細(xì)胞周期素樣蛋白P25的調(diào)控。在正常情況下，P35在神經(jīng)細(xì)胞中特異性表達(dá)，而在某些傷害性刺激的作用下，P35 被calpain剪切，P25是calpain剪切殘留下來的羧基端部分，P25可與Cdk5結(jié)合并激活Cdk5。本研究發(fā)現(xiàn)七氟醚雖然沒有影響新生大鼠皮質(zhì)Cdk5蛋白的表達(dá)量，但顯著減少了P35的表達(dá)，增加了P25的表達(dá)，提示七氟醚激活了Cdk5的活性。這一點(diǎn)也可以從七氟醚增加了Cdk5下游CRMP2 Ser522蛋白磷酸化得到證實(shí)。此外，七氟醚減少了CRMP1、2、4總蛋白的表達(dá)，提示七氟醚從基因水平調(diào)節(jié)了CRMP蛋白表達(dá)。Cdk5抑制劑roscovitine預(yù)處理不僅通過減輕七氟醚導(dǎo)致的P25表達(dá)增加和CRMP2 Ser522蛋白磷酸化，有效地抑制了Cdk5過度激活，也逆轉(zhuǎn)了七氟醚對(duì)CRMP1、4總蛋白的抑制，而且逆轉(zhuǎn)了七氟醚對(duì)樹突發(fā)育的抑制以及對(duì)大腦認(rèn)知功能的損害，提示Cdk5-CRMP通路激活是七氟醚引起新生大鼠皮質(zhì)樹突發(fā)育障礙和認(rèn)知功能損害的機(jī)制之一。

Cdk5功能復(fù)雜，在神經(jīng)細(xì)胞的分化、遷移和凋亡方面起著重要作用［17-19］。在Sema3A誘發(fā)的生長(zhǎng)錐塌陷經(jīng)典途徑中，Sema3A與其受體結(jié)合激活Rac1，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)下游信號(hào)通路Cdk5，Cdk5繼而磷酸化CRMP2 Ser522位點(diǎn)［20］。磷酸化的CRMP2降低了與微管蛋白異二聚體的結(jié)合能力，最終導(dǎo)致微管的解聚，軸突回縮［16］。Wang等［7］研究發(fā)現(xiàn)新生大鼠預(yù)先給予Cdk5抑制劑，能顯著減少異氟醚暴露引起的海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡，提示Cdk5的過度激活與吸入麻醉藥的神經(jīng)毒性有關(guān)，這與本研究的結(jié)果一致。CRMP磷酸化除了受Cdk5調(diào)節(jié)，還與GSK-3β通路關(guān)系密切，GSK-3β激活使CRMP2 Thr518、Thr509和Thr514位點(diǎn)磷酸化［20］。Cdk5與GSK-3β通路之間相互影響，一方面，但GSK-3β磷酸化作用依賴于Cdk5對(duì)CRMP2 Ser522位點(diǎn)的磷酸化［21］;另一方面GSK-3β能與P25結(jié)合并增強(qiáng)其活性，因此推測(cè)P25激活Cdk5可能是通過增強(qiáng)GSK-3β活性介導(dǎo)的［22］。Cdk5除了調(diào)節(jié)下游的CRMP磷酸化狀態(tài)，還能磷酸化多種微管調(diào)節(jié)蛋白［23］，如雙腎上腺皮質(zhì)激素的絲氨酸297位點(diǎn)以及核遷移蛋白，參與調(diào)節(jié)微管的聚合和神經(jīng)元的細(xì)胞核遷移［24］。因此，Cdk5-CRMP通路可能并不是七氟醚引起前額葉皮層神經(jīng)發(fā)育毒性的唯一機(jī)制，Cdk5是否還會(huì)作用于其它下游靶點(diǎn)，以及與GSK-3β通路的關(guān)系，都有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)存在一定的局限性，首先神經(jīng)元形態(tài)學(xué)分析中只觀察了樹突的形態(tài)，沒有進(jìn)一步檢測(cè)神經(jīng)元的樹突棘密度;其次，沒有檢測(cè)CRMP的其它上游通路如GSK-3β、RoA的作用;這些都將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究中完善。

綜上所述，本研究通過給出生后7 d新生大鼠吸入2. 8%七氟醚4 h，并聯(lián)合使用Cdk5抑制劑，發(fā)現(xiàn)七氟醚通過激活Cdk5-CRMP通路干擾了新生大鼠前額葉皮層神經(jīng)元樹突的正常發(fā)育和幼鼠認(rèn)知功能。

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(責(zé)任編輯:林白霜，余小慧)

Role of Cdk5-CRMP pathway in sevoflurane-induced dendritic developmental disorder of neurons in prefrontal cortex of neonatal rats

LIU Yan-hui1，XIA Shu-xuan1，LIU Ya-fang1，LIU Chui-liang2，LI Yu-juan1
(1Department of Anesthesiology，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China;2Department of Anesthesiology，Chancheng Central Hospital，F(xiàn)oshan 528030，China.E-mail: yujuan_04@aliyun.com)

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.10.001

1000-4718(2015)10-1729-08

2015-07-03

2015-09-11

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.S2013010016207) ;廣東省科技社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(No.2014A020212147) ;廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金(No.A2013207)

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