正交試驗(yàn)法優(yōu)化海洋星蟲(chóng)多糖堿提法提取工藝*

劉玉明，錢(qián)甜甜，蔣定文，何 穎，沈先榮，李珂嫻，陳 偉，侯登勇，劉 瓊，王慶蓉，羅 群，江叔奇

（1.中國(guó)人民解放軍海軍醫(yī)學(xué)研究所，上海 200433； 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

正交試驗(yàn)法優(yōu)化海洋星蟲(chóng)多糖堿提法提取工藝*

劉玉明1，錢(qián)甜甜1，蔣定文1，何 穎1，沈先榮1，李珂嫻1，陳 偉1，侯登勇1，劉 瓊1，王慶蓉1，羅 群1，江叔奇2

（1.中國(guó)人民解放軍海軍醫(yī)學(xué)研究所，上海 200433； 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

目的 優(yōu)選海洋星蟲(chóng)多糖的提取工藝。方法 以料液比、NaOH濃度、提取溫度、提取時(shí)間為考察因素，以多糖含量與多糖得率的乘積為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選海洋星蟲(chóng)多糖的提取工藝。結(jié)果 海洋星蟲(chóng)多糖的最佳工藝條件為料液比1∶4，NaOH濃度為1%，溫度60℃，時(shí)間4 h。結(jié)論 該提取工藝簡(jiǎn)便、快捷，可用于海洋星蟲(chóng)多糖的提取。

海洋星蟲(chóng)多糖；提取工藝；正交設(shè)計(jì)

海洋星蟲(chóng) Sipunculusnudus Linnaeu.俗稱沙蟲(chóng)、海蠶沙、海蠶、沙腸子、海腸子、星蟲(chóng)，是星蟲(chóng)動(dòng)物門(mén)方格星蟲(chóng)目方格星蟲(chóng)科方格星蟲(chóng)屬裸體方格星蟲(chóng)的全體，資源豐富，在我國(guó)沿海北至渤海灣南至北部灣以及海南、臺(tái)灣等地均有分布。海洋星蟲(chóng)的保健功能在我國(guó)古代醫(yī)藥專(zhuān)著中多有記載，著名本草學(xué)家李時(shí)珍的《本草綱目》中記載有“海蠶”的藥用功效。中醫(yī)認(rèn)為，海洋星蟲(chóng)性味甘、咸、寒，具清肺補(bǔ)虛、滋陰降火功效，臨床用于骨蒸潮熱、陰虛盜汗、肺虛咳喘、胸悶痰多等疾病，著名本草學(xué)家李荀的《海藥本草》中記載：“海蠶沙味咸，大溫，無(wú)毒。主虛勞冷氣，褚風(fēng)不遂。久服令人光澤，補(bǔ)虛羸，輕身，延年不老?！焙Ｑ笮窍x(chóng)含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)、微量元素等多種活性物質(zhì)［1］，前期藥效學(xué)研究結(jié)果表明，海洋星蟲(chóng)多糖在提高免疫［2］、抗疲勞［3］、促智［4］等方面有顯著作用。為了進(jìn)一步深入研究海洋星蟲(chóng)提取物中多糖的藥理作用，本研究中采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)海洋星蟲(chóng)多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其多糖含量和得率進(jìn)行了測(cè)定，旨在為進(jìn)一步最大限度地利用星蟲(chóng)的有效成分奠定基礎(chǔ)，也為海洋星蟲(chóng)多糖的新藥申報(bào)提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 儀器與試藥

高速組織搗碎儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；HetoLyolab 3000型冷凍干燥機(jī)；循環(huán)水式多用真空泵SHB－ⅢA（上海預(yù)康科教儀器設(shè)備有限公司）；全不銹鋼電動(dòng)多用絞切機(jī)（江蘇省丹徒縣民用設(shè)備廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申勝生物技術(shù)有限公司）；85－2型恒溫磁力攪拌器（上海司樂(lè)儀器廠）；SJ3200型超聲波清洗機(jī)（上海潔凈超聲波設(shè)備廠）；膠體磨型廊坊通用機(jī)械廠；電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）；GL－21M型離心機(jī)（上海市離心機(jī)械研究所）。葡萄糖（AR級(jí)，上海化學(xué)試劑分裝廠，批號(hào)為0690404；蒽酮（批號(hào)為20080618），氫氧化鈉（批號(hào)為F20080921），鹽酸（批號(hào)為T(mén)050704），濃硫酸（均為AR級(jí)，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品；批號(hào)為 20020412）；三氯乙酸（進(jìn)口分裝，批號(hào)為L(zhǎng)J0810B508J）；95%醫(yī)用乙醇（上海勝德化工有限公司，批號(hào)為F20080921）。新鮮海洋星蟲(chóng)購(gòu)自廣西北海，由上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院進(jìn)行藥材鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 海洋星蟲(chóng)多糖的提取

分別稱取海洋星蟲(chóng)原料50 g，浸泡過(guò)夜，清洗，先用大型剪切機(jī)切碎（重復(fù)2次），分別按照設(shè)定好的料液比、NaoH濃度、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行提取，以9 000 r／min的速率離心30 min，棄去沉淀，得上清液。將各上清液調(diào)pH至7.0，攪拌下加三氯乙酸至pH＝4，以9 000 r／min的速率離心30 min，得上清液。上清液加入95%醫(yī)用乙醇，使乙醇終濃度為75%，4℃靜置12 h，9 000 r／min的速率離心30 min，取沉淀，用75%醫(yī)用乙醇洗滌沉淀3次，干燥，得海洋星蟲(chóng)多糖。

2.2 多糖含量測(cè)定方法的建立［5］

溶液制備：精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品50 mg，置500 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。分別取擬訂工藝制備的海洋星蟲(chóng)多糖20 mg，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：分別精密吸取對(duì)照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，置10 mL具塞試管中，加水至2.0 mL，精密加入硫酸－蒽酮溶液6 mL，搖勻，置水浴中加熱15 min，取出，放入冰浴中冷卻15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外－可見(jiàn)分光光度法，在625 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、質(zhì)量，濃度為橫坐標(biāo)。得標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為 Y＝50.576 X＋0.0281，R2＝0.9967（n＝6）。結(jié)果表明，用0.1%硫酸－蒽酮溶液顯色后，葡萄糖質(zhì)量濃度在0.02～1.2 g／L范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

測(cè)定法：精密稱取所制備的多糖提取物各3份，每份20 mg，分別置100 mL容量瓶中，加水使溶解，搖勻，精密量取0.4 mL溶液，置10 mL具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下方法，同法操作，依法測(cè)定吸光度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算供試品溶液中多糖含量。2.3 海洋星蟲(chóng)固體得率測(cè)定

取各提取工藝條件下所制備的海洋星蟲(chóng)多糖提取物，置烘箱中105℃烘5 h，移至干燥器中，冷卻30 min，精密稱定質(zhì)量，再在105℃干燥1 h，冷卻，稱重，至恒重，計(jì)算總固體得率。

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：稱取星蟲(chóng)原料50 g，共9份，編號(hào)，泡水過(guò)夜，洗凈，切碎，組織勻漿。以干浸膏得率和多糖含量為考察指標(biāo)，考察料液比（因素A）、NaOH濃度（因素B）、提取溫度（因素C）、提取時(shí)間（因素D）對(duì)提取工藝的影響，并對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，從而確定堿提法最佳提取工藝。采用 L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1，最終得9份海洋星蟲(chóng)多糖。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

結(jié)果：分別對(duì)正交試驗(yàn)所得的9份樣品，按照2.2及2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測(cè)定和得率計(jì)算，并以含量與得率的乘積為評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果見(jiàn)表2。

統(tǒng)計(jì)分析：以多糖含量與得率的乘積為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果分析，其直觀分析表見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。根據(jù)正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果，影響星蟲(chóng)多糖產(chǎn)率因素的大小順序是B＞A＞D＞C，即NaOH濃度＞料液比＞時(shí)間＞溫度。直觀分析，提取星蟲(chóng)粗多糖的最佳工藝條件為A2B3C3D3，即料液比1：4、NaOH濃度1%、溫度60℃、時(shí)間4 h。

2.5 星蟲(chóng)多糖中試生產(chǎn)驗(yàn)證試驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述工藝，分3次對(duì)星蟲(chóng)多糖進(jìn)行批量提取，并對(duì)提取物進(jìn)行多糖含量和得率計(jì)算。

分別稱取海洋星蟲(chóng)原料3份，浸泡過(guò)夜，清洗，先用大型剪切機(jī)切碎（重復(fù)2次），加入4倍量水在膠體磨勻漿，加入1% NaOH，60℃提取4 h，以9 000 r／min的速率離心30 min，棄去沉淀，得上清液。將各上清液調(diào)pH至7.0，攪拌下加三氯乙酸至pH＝4，以9 000 r／min的速率離心30 min，得上清液。上清液加入95%醫(yī)用乙醇使乙醇終濃度為75%，4℃靜置12 h，以9 000 r／min的速率離心30 min，取沉淀，用75%醫(yī)用乙醇洗滌沉淀3次，干燥，得海洋星蟲(chóng)多糖。對(duì)粗多糖進(jìn)行含量測(cè)定和得率計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表4?？梢?jiàn)，優(yōu)選工藝提取簡(jiǎn)單、可行、重復(fù)性好，符合實(shí)際生產(chǎn)要求。

3 討論

海洋星蟲(chóng)主要棲息于沿海潮間帶灘涂區(qū)以及淺海泥沙質(zhì)或沙質(zhì)海底，以低潮處最多，呈穴居，在我國(guó)具有廣泛的自然資源，并具有廣泛的應(yīng)用保健價(jià)值，在民間素有“動(dòng)物人參”“海洋里的冬蟲(chóng)夏草”的美譽(yù)。因此，如何有效地對(duì)海洋星蟲(chóng)多糖進(jìn)行提取和制備，對(duì)于海洋星蟲(chóng)的深入開(kāi)發(fā)具有重要意義。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析表

動(dòng)物多糖有多種提取方法，如熱水浸提法、堿浸提法以及酶解提取法，本研究中通過(guò)正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化出海洋星蟲(chóng)多糖堿提法的最佳提取工藝。堿溶液的濃度和提取溫度對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)和提取效率具有重要的影響，在提取過(guò)程中應(yīng)盡量控制NaOH濃度和提取溫度，以免破壞其結(jié)構(gòu)。

［1］劉玉明，錢(qián)甜甜，何 穎，等.方格星蟲(chóng)多糖不同提取工藝的比較研究［J］.時(shí)診國(guó)藥國(guó)藥，2011，22（6）：1 454－1 455.

［2］李珂嫻，沈先榮，何 穎，等.方格星蟲(chóng)多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響［J］.中國(guó)海洋藥物，2012，31（1）：46－49.

［3］劉玉明，錢(qián)甜甜，莫琳芳，等.方格星蟲(chóng)多糖對(duì)運(yùn)動(dòng)小鼠抗疲勞實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)海洋藥物，2012，31（3）：42－44.

［4］何 穎，沈先榮，蔣定文，等.方格星蟲(chóng)多糖對(duì)記憶障礙小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響［J］.中國(guó)海洋藥物，2012，31（1）：38－42.

［5］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：130.

Optimization of Alkali Extraction Method of Sipunculusnudus Polysaccharide by Orthogonal Experiment

Liu Yuming1，Qian Tiantian1，Jiang Dingwen1，He Ying1，Shen Xianrong1，Li Kexian1，Chen Wei1，Hou Dengyong1，Liu Qiong1，Wang Qingrong1，Luo Qun1，Jiang Shuqi2

ObjectiveTo optimize the extraction technology of polysaccharide from Sipunculusnudus Linnaeu.MethodsThe extraction technology of the sipunculusnudus polysaccharide was optimized by the orthogonal design with the solid－liquid ratio，sodium hydroxide concentration，extraction temperature and extraction time as the investigation factors and the product of the polysaccharide content and the polysaccharide yield as the evaluation index.ResultsThe optimal extraction technology of the sipunculusnudus polysaccharide was as follows：the solid－liquid ratio was 1∶4，the concentration of sodium hydroxide was 1%，the extraction temperature was 60℃ and the extraction time was 4 h.ConclusionThis extraction technology is simple and rapid，which can be applicable for the extraction of the sipunculusnudus polysaccharide.

Sipunculusnudus polysaccharide；extraction technology；orthogonal design

表4 批量生產(chǎn)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

TQ461；R284.1；R282.77

A

1006－4931（2015）02－0021－02

劉玉明，博士研究生，副研究員，主要從事藥物核輻射防護(hù)及中藥現(xiàn)代化研究工作，（電話）021－81883886；沈先榮，博士研究生，研究員，主要從事海洋藥物在核輻射損傷和核事故應(yīng)急中的防護(hù)研究工作，本文通訊作者，（電話）021－81883871。

2014－07－28）

*國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)新藥創(chuàng)制項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：2008ZXJ09004－027。

（1.Naval Medical Research Institute，Shanghai，China 200433；2.Zhejiang Chinese Medicine University，Hangzhou，Zhejiang，China 310053）