兒童侵襲性纖維瘤中β-catenin的表達(dá)和基因突變分析及與復(fù)發(fā)相關(guān)性實(shí)驗(yàn)研究

姚 杰，孫 軍，寧 波

(安徽省兒童醫(yī)院骨科，安徽合肥 230051)

侵襲性纖維瘤病，被認(rèn)為來源于間充質(zhì)病變的面部、腱膜或肌肉結(jié)締組織。該腫瘤的特征是浸潤性生長，高復(fù)發(fā)率，但無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［1]。侵襲性纖維瘤病是侵襲性生長，但發(fā)病罕見，約為每萬人2～4人的發(fā)病率［2－3]。相較于成人侵襲性纖維瘤病，小兒侵襲性纖維瘤病具有鮮明的特點(diǎn)。小兒侵襲性纖維瘤病的復(fù)發(fā)率達(dá)75%，遠(yuǎn)高于成年人［4－5]。兒童侵襲性纖維瘤病是目前一個(gè)熱點(diǎn)的研究領(lǐng)域。然而，該疾病的病因和發(fā)病機(jī)制仍不清楚。

β-catenin作為Wnt信號(hào)通路的核心蛋白，其表達(dá)量發(fā)生改變會(huì)直接引起一系列下游蛋白表達(dá)的改變，從而引起腫瘤樣病變的發(fā)生［5]。近期研究表明侵襲性纖維瘤病中β-catenin的3號(hào)外顯子確定存在突變。然而，到目前為止，研究兒童3號(hào)外顯子突變的很少。因此，本研究的目的是調(diào)查在兒童侵襲性纖維瘤病β-catenin的表達(dá)和3號(hào)外顯子的突變狀態(tài)。

1 資料和方法

1．1 資料 選取安徽省兒童醫(yī)院在2007年6月至2013年5月間因下肢或臀部接受手術(shù)的侵襲性纖維瘤病患兒32例，男13例，女19例，年齡3～15歲(平均8歲)。32例中，有21例復(fù)發(fā)。所有患者均經(jīng)術(shù)后病理確診，并由高年資的病理醫(yī)生審查了所有切片。沒有患者被診斷為Gardner綜合征和家族遺傳腺瘤性息肉病(familial adenomatouspolyposis，nFAP)。另有15例與β-catenin基因表達(dá)無關(guān)的病變(其中3例肌纖維瘤，8例瘢痕組織，2例淺表纖維瘤病，1例脂肪瘤和1例骨肉瘤)作為對(duì)照。

1．2 免疫組化 所有石蠟標(biāo)本切片，將切片在56℃環(huán)境下干燥，二甲苯脫蠟，水化，并在室溫下用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌3次，每次5 min。3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性10 min。切片經(jīng)20 min微波處理，在10 mmol·L－1檸檬酸鈉(pH 6．0)中進(jìn)行抗原修復(fù)。切片在封閉液中(包含5%脫脂牛奶的PBS)在室溫下培育5 min抑制非特異性抗體的結(jié)合。然后除陰性對(duì)照外，將切片用抗βcatenin抗體(ab2365，Abcam 公司，1∶125 稀釋)在4℃冰箱孵育過夜。用PBS洗滌3次后，將切片過氧化物酶結(jié)合的AffiniPure山羊免疫球蛋白(1∶1200 0稀釋)1 h。為了顯現(xiàn)結(jié)合的抗體，切片與3，3-9-氨基聯(lián)苯胺處理。最后將切片用Mayer氏蘇木素染色。

以半定量的方法分析免疫組織化學(xué)的結(jié)果，每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域統(tǒng)計(jì)每單位面積的腫瘤細(xì)胞的數(shù)量。使用40倍鏡片對(duì)β-catenin陽性的腫瘤細(xì)胞所占百分率進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果基于以下標(biāo)準(zhǔn):(1)陰性:腫瘤細(xì)胞的陽性染色率為10%;(2)弱陽性:10%～50%的腫瘤細(xì)胞染色為陽性;(3)陽性:腫瘤細(xì)胞的陽性染色大于50%。免疫組化染色半定量使用Image Pro Plus軟件進(jìn)行分析

1．3 DNA提取和直接DNA序列分析 對(duì)石蠟包埋的組織進(jìn)行切片(各10μm厚)。使用QIAamp DNA FFPE組織試劑盒(QIAGEN公司，瓦倫西亞，CA，USA)進(jìn)行DNA基因組提取。DNA濃度使用設(shè)定在260 nm的波長分光光度計(jì)測(cè)定。

β-catenin外顯子3通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)用下面的引物擴(kuò)增:Forward，5－ATGGAACCAGACAGAAAAGC －3;Reverse，5－GCTACTTGTTCTTGAGTGAAG－3。PCR反應(yīng)在Eppendorf溫度循環(huán)器按照以下循環(huán)條件進(jìn)行:35個(gè)循環(huán)的94℃30 s，56℃45 s，72℃60 s，接著72℃最后延伸10 min。所得201堿基對(duì)使用QIAquick PCR純化試劑盒純化。測(cè)序反應(yīng)在ABI(3730)遺傳分析儀進(jìn)行，并進(jìn)行直接測(cè)序。僅包含水的反應(yīng)物用作陰性對(duì)照。使用美國國家生物技術(shù)信息中心BLAST比對(duì)工具的結(jié)果進(jìn)行分析。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)使用標(biāo)準(zhǔn)差分析。使用統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS16．0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組定量數(shù)據(jù)之間的比較采用t檢驗(yàn)。兩組定性數(shù)據(jù)的比較采用Fisher精確確切概率法。P＜0．05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 β-catenin在小兒侵襲性纖維瘤病的表達(dá) 在32例侵襲性纖維瘤病樣本中觀察到30例中β-catenin在細(xì)胞核中染色陽性，其余2例則在胞質(zhì)中染色。在對(duì)照組中，有2例表現(xiàn)出弱陽性β-catenin染色，余數(shù)為陰性。在侵襲性纖維瘤病β-catenin的表達(dá)較對(duì)照組顯著增強(qiáng)(P＜0．001)。通過IOD計(jì)算β-catenin表達(dá)的半定量分析證實(shí)侵襲性纖維瘤病組的β-catenin表達(dá)強(qiáng)于對(duì)照組，見圖1。

2．2 侵襲性纖維瘤病β-catenin的3號(hào)外顯子3基因突變檢測(cè)結(jié)果 32例侵襲性纖維瘤病中β-catenin基因的3號(hào)外顯子突變存在于25例(78%)中，其中21例復(fù)發(fā)病例中有19例(90%)出現(xiàn)，11例初發(fā)病例中有6例出現(xiàn)(55%)。在復(fù)發(fā)病例中3號(hào)外顯子的突變明顯高于初發(fā)病例(P=0．032)。對(duì)兩個(gè)不同突變位點(diǎn)進(jìn)行分析鑒定，即2個(gè)不同的密碼子(41和45號(hào)密碼子)。41號(hào)密碼子中的突變是從ACC到GCC(圖2)，從而導(dǎo)致丙氨酸置換為蘇氨酸(Thr)(T41A)，并在25例(20%)樣品中檢測(cè)到5例。45號(hào)密碼子中的突變從TCT至TTT(圖2)，從而導(dǎo)致苯丙氨酸被取代為絲氨酸(絲氨酸)(S45F)，并在25例(80%)樣品發(fā)現(xiàn)20例。在所有的復(fù)發(fā)病例中發(fā)現(xiàn)的突變均位于45位密碼子(S45F)，而初發(fā)病例中僅有1例 S45F的突變(P=0．002)。所有初發(fā)病例的突變位點(diǎn)位于41號(hào)密碼子(T41A)。對(duì)照組中沒有檢測(cè)出基因突變。

3 討論

β-catenin是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的核心蛋白，Wnt信號(hào)通路的激活主要通過激活β-catenin來完成的［5－6]。同時(shí)，Wnt信號(hào)通路的 β-catenin 在細(xì)胞黏附中的作用已被很好闡述［6–8]。β-catenin 的失調(diào)可通過多種途徑導(dǎo)致異常基因表達(dá)和信號(hào)的改變。突變?cè)讦?catenin表達(dá)的失調(diào)方面發(fā)揮重要作用，并可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)穩(wěn)定化，使其在細(xì)胞質(zhì)中積累并被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核中，這種改變多導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力的增加，最終會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生或腫瘤侵襲性增加［10]。重要的是，β-catenin已被證實(shí)可以與E－鈣黏蛋白的結(jié)合，在細(xì)胞黏附中發(fā)揮重要作用［8－9，11]。鈣黏蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞黏附可以抑制癌細(xì)胞的侵襲性。因此，β-catenin表達(dá)的增強(qiáng)可能導(dǎo)致腫瘤侵襲性的增強(qiáng)［11－12]。侵襲性纖維瘤的發(fā)病及高復(fù)發(fā)率的分子生物學(xué)原因仍然不清楚，但β-catenin在成年侵襲性纖維瘤病的核表達(dá)在許多以前的研究［13－14]已經(jīng)描述和發(fā)生率超過90%。然而，很少有研究檢測(cè)探討兒童β-catenin的表達(dá)及基因突變與該腫瘤的發(fā)生和復(fù)發(fā)的關(guān)系

一項(xiàng)研究報(bào)道表明，90%的兒童侵襲性纖維瘤病表現(xiàn)出β-catenin的核表達(dá)，類似于本研究的結(jié)果［15]。相比之下，Thway 等［16]有另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)只有42%(21/50)的小兒侵襲性纖維瘤病病例有β-catenin的核表達(dá)。這些結(jié)果的不同可能是因?yàn)槟[瘤的發(fā)病位置不同而造成的。在本研究中，侵襲性纖維瘤全部發(fā)生在臀部或下肢。小兒侵襲性纖維瘤病β-catenin的高表達(dá)可能是因?yàn)閮和啾瘸赡耆擞休^高的復(fù)發(fā)率。本研究的結(jié)果表明患者所有樣本的β-catenin的基因突變率為78%。這些發(fā)現(xiàn)也證實(shí)了以前在成人患者的研究的結(jié)果。侵襲性纖維瘤病的高突變率表明β-catenin突變可能是在這種腫瘤中普遍存在的。

在本研究中，侵襲性纖維瘤病β-catenin有強(qiáng)陽性的核表達(dá)。先前的研究已經(jīng)表明，β-catenin的細(xì)胞核表達(dá)具有診斷和預(yù)后價(jià)值［13，17－18]。重要的是，它往往很難從幾個(gè)相關(guān)的疾病，包括瘢痕組織，淺表纖維瘤病和反應(yīng)性成纖維細(xì)胞增殖區(qū)分侵襲性纖維瘤病。然而，我們的研究結(jié)果表明，小兒侵襲性纖維瘤病β-catenin突變發(fā)生在大多數(shù)病例中。因此，在β-catenin的3號(hào)外顯子突變可以用于侵襲性纖維瘤病的基因?qū)W診斷。

雖然β-catenin的3號(hào)外顯子突變先前已在侵襲性纖維瘤?。?9]中有所描述，本研究是少數(shù)特異性檢測(cè)兒童侵襲性纖維瘤3號(hào)外顯子的點(diǎn)突變的研究。事實(shí)上，在這項(xiàng)研究中觀察到的3號(hào)外顯子突變頻率(78%總體，90%為復(fù)發(fā)病例)明顯高于以前的研究中觀察到的成人病例［19－20]。在這些兒童患者只有2個(gè)外顯子點(diǎn)檢測(cè)到突變分別是3-S45F和T41A。S45F突變只發(fā)生在復(fù)發(fā)病例，因此對(duì)T41A突變和S45F突變進(jìn)行分析，S45F突變?cè)趶?fù)發(fā)病例中更有意義(P=0．002)。一項(xiàng)研究在42例侵襲性纖維瘤中發(fā)現(xiàn)有27例中的CTNNB1的3號(hào)外顯子突變(64%)，3個(gè)突變被鑒定:T41A(63%)，S45F(30%)和S45P(7%)［15]。這項(xiàng)研究并沒有討論突變和復(fù)發(fā)病例之間的關(guān)系。在我們的研究中，觀察到T41A和S45F突變，而沒有檢測(cè)到S45P。我們推測(cè)該差異可能是由種族差異或年齡等因素所引起。

根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，侵襲性纖維瘤病的病程顯然是不確定的。雖然有些腫瘤手術(shù)后不復(fù)發(fā)，但多數(shù)腫瘤還是表現(xiàn)出了完全切除后局部復(fù)發(fā)趨勢(shì)。這種顯著差異表明分析分子改變可用于預(yù)測(cè)該腫瘤預(yù)后的可能性。作為本研究的結(jié)果，我們認(rèn)為3號(hào)外顯子S45F突變可以作為一個(gè)不良預(yù)后因素。本研究中這種突變?cè)趦嚎撇±霈F(xiàn)較成人病例以前的研究更頻繁。因此，侵襲性纖維瘤病的患兒復(fù)發(fā)率較成年人高可能是兒童S45F突變的頻率較高。

結(jié)合早期的研究，我們的研究結(jié)果表明，βcatenin的異位表達(dá)在侵襲性纖維瘤病中起重要作用。此外，從本研究的結(jié)果還表明，對(duì)β-catenin的3號(hào)外顯子的突變狀態(tài)分析可用于預(yù)測(cè)小兒患者復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，但仍需進(jìn)一步的研究和隨訪S45F突變，β-catenin的表達(dá)，腫瘤復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。

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