肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A基因P279L變異對(duì)eNOS的影響*

張 濤 慕玉東曹永勝

西安市中心醫(yī)院心內(nèi)科(西安710003)

肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A基因P279L變異對(duì)eNOS的影響*

張 濤 慕玉東△曹永勝

西安市中心醫(yī)院心內(nèi)科(西安710003)

目的：探討肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A基因P279L變異對(duì)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的影響。方法：選自西北地區(qū)385名漢族人，采用酚氯法提取全基因組DNA，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清中eNOS。結(jié)果：在MEF2A-P279L的PP、PL、LL的3種基因型中，eNOS水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意，LL型eNOS水平明顯低于LP型和PP型，PL型100.35±12.61pg/ml與PP型103.28±13.35 pg/ml差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但eNOS水平成上升趨勢(shì)。結(jié)論：MEF2A-P279L變異影響eNOS水平，L等位基因可能具有致動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

血管內(nèi)皮的損傷及功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)。一氧化氮(NO)是內(nèi)皮細(xì)胞分泌的,具有抑制平滑肌細(xì)胞的增生、抑制血小板的聚集、調(diào)節(jié)血管張力等作用[1]。合成NO的關(guān)鍵酶是一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOS)，分三種亞型：內(nèi)皮型一氧化氮合酶(Endothelial NOS,eNOS)、神經(jīng)型一氧化氮合酶和免疫型一氧化氮合酶。其中eNOS分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與血管功能調(diào)節(jié)[2]。肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2(Myocyte enhancer factor 2A，MEF2A)編碼的蛋白在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、激活遺傳程序、控制細(xì)胞的分化、增殖、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生存和凋亡等方面發(fā)揮重要作用[3]。MEF2A基因突變后破壞了血管內(nèi)皮的完整性，促進(jìn)脂質(zhì)物質(zhì)在血管內(nèi)皮的沉積和炎性因子的聚集，啟動(dòng)了動(dòng)脈粥樣硬化。目前國內(nèi)對(duì)MEF2A-P279L基因突變與eNOS水平的影響研究較少，為了明確MEF2A-P279L基因多態(tài)性對(duì)eNOS水平的影響，本研究采用ELISA方法檢測(cè)MEF2A基因在內(nèi)皮細(xì)胞與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病相關(guān)的細(xì)胞功能，進(jìn)一步探索冠心病發(fā)病的機(jī)制，為冠心病的治療提供新的靶點(diǎn)。

對(duì)象和方法

1 研究對(duì)象 收集2011年1月至2012年12月我院心內(nèi)科住院患者，共385例，經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影分為冠心病組239例，男性152例，女性87例，年齡55.6±10.3歲；對(duì)照組146例，男性83例，女性63例，年齡52.6±11.2歲；均為漢族人。

2 方 法

2.1 收集樣本:入院次日采取空腹20ml靜脈血，離心后將血細(xì)胞及上清液分裝試管，低溫冰箱保存。

2.2 DNA的提取:采用酚氯法提取DNA，即采用苯酚與氯仿提取，然后應(yīng)用異丙醇沉淀的方法提取。

2.3 PCR擴(kuò)增:引物由陜西博森生物公司合成，引物：上游5’ CACTTTATTGAATGATATTTTTCCCC 3’，下游5’ AGGCATCATGCCCTTGCTTTA 3；PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，94℃變性1min，62℃退火30s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。

2.4 ELISA試劑盒檢測(cè)eNOS:采用雙抗體的ELISA方法，按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)。

結(jié) 果

MEF2A-P279L不同基因型組的eNOS水平進(jìn)行比較:LL型eNOS水平明顯低于LP型和PP型，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,結(jié)果見表1～3。

表1 LL基因與LP基因eNOS水平的關(guān)系

SNP基因型eNOStP值MEF2A-P279LLL83.27±14.52-11.388<0.001LP100.35±12.61

表2 LL基因與PP基因eNOS水平的關(guān)系

SNP基因型eNOStP值MEF2A-P279LLL83.27±14.52-4.070<0.001PP103.28±13.35

表3 LP基因與PP基因eNOS水平的關(guān)系

SNP基因型eNOStP值MEF2A-P279LLP100.35±12.61-0.6720.502PP103.28±13.35

討 論

冠心病是由于冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮發(fā)生粥樣硬化導(dǎo)致心肌缺血、缺氧而引起的心血管疾病，血管內(nèi)皮的損傷及功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)[4]。內(nèi)皮細(xì)胞通過NO調(diào)節(jié)血管的張力及血管重塑。NO是在一氧化氮合成酶催化下由L-精氨酸和氧分子生成的。eNOS生理作用：①下調(diào)黏附蛋白的基因表達(dá)，如抑制血管細(xì)胞黏附因子1、細(xì)胞表面黏附分子P選擇素和細(xì)胞間黏附分子1的表達(dá)；②阻止單核細(xì)胞趨化蛋白1的表達(dá)，防止白細(xì)胞黏附，阻止其向內(nèi)皮下遷移；③通過對(duì)脂類自由基的作用，阻止低密度脂蛋白的氧化，抑制血小板黏附聚集，阻止其向內(nèi)皮下層遷移和聚集[5，6]。所以，NO是抗動(dòng)脈粥樣硬化及血栓形成，是防治動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵[7,8]。

本研究結(jié)果顯示：MEF2A-P279L不同基因型的eNOS血漿水平存在顯著性差異，LL基因型的eNOS血漿水平顯著低于LP和PP基因型，L等位基因可能具有致動(dòng)脈粥樣硬化的作用。我們的研究提示MEF2A-P279L基因突變后降低了eNOS血漿水平，使NO表達(dá)下降，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的粥樣硬化，因此我們推測(cè)MEF2A-P279L基因突變影響eNOS水平，通過調(diào)節(jié)NO的分泌調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、調(diào)節(jié)血小板的聚集、單核內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、血管內(nèi)皮舒張等多個(gè)途徑參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，有助于從基因水平闡明冠心病的發(fā)生機(jī)制，對(duì)冠心病進(jìn)行早期預(yù)防、早期診斷，為冠心病的防治提供新的理論依據(jù)。

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(收稿：2014-12-10)

Association of MEF2A-P279L single nucleotide polymorphism

The Central Hospital of Xi’an (Xi’an 710003) Zhang Tao Mu Yudong Cao Yongsheng

(SNP) with plasma eNOS

Objectives：To investigate the relationship between the distribution of Myocyte enhancer factor 2A (MEF2A) gene P279L polymorphism and plasma level of eNOS in Han nationality in Chinese North -Western area. Methods：Three hundred and eighty five Han ethnic subjects .DNA was extracted by phenol and chloroform extraction.The serum of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) was measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Results：The level of eNOS showed significant difference in the sequence of PP, PL and LL genotypes(P<0.05),the levels of LL were significantly lower than those in the LP and PP, no significant difference between PL genotype(100.35±12.61pg/ml)and PP genotype(103.28±13.35 pg/ml)(P>0.05),but The level of eNOS between PL and PP showed an upward trend. Conclusion:MEF2A-P279L genetic variation results in a protective change in level of eNOS, L allele may have induced atherosclerosis.

@ MEF2A-P279L Gene expression Nitric-oxide synthase

*西安市科技計(jì)劃基金項(xiàng)目(2011HM1115)

@肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A基因 基因表達(dá) 一氧化氮合酶

R543.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.04.016

△陜西省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科