渤海沉積環(huán)境中細(xì)菌汞還原酶基因merA的多樣性分析

何培青，李力，劉季花*，方習(xí)生

(1. 國家海洋局 第一海洋研究所 海洋生態(tài)研究中心，山東 青島 266061;2. 國家海洋局 第一海洋研究所 海洋沉積與環(huán)境地質(zhì)國家海洋局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266061)

渤海沉積環(huán)境中細(xì)菌汞還原酶基因merA的多樣性分析

何培青1，李力2，劉季花2*，方習(xí)生2

(1. 國家海洋局 第一海洋研究所 海洋生態(tài)研究中心，山東 青島 266061;2. 國家海洋局 第一海洋研究所 海洋沉積與環(huán)境地質(zhì)國家海洋局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266061)

細(xì)菌汞還原酶MerA對環(huán)境中的汞具有潛在的還原和解毒作用。本研究對2011-2012年采自渤海灣天津?yàn)I海新區(qū)大沽河排污河口、渤海灣近岸及萊州灣墾利養(yǎng)殖區(qū)的表層沉積物，進(jìn)行了放線菌門、厚壁菌門、α-變形菌綱和β/γ-變形菌綱汞還原酶基因merA克隆文庫的構(gòu)建和序列測定，并對merA基因序列編碼的MerA蛋白序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明：渤海沉積環(huán)境中發(fā)育多樣性豐富的MerA，排污河口和養(yǎng)殖區(qū)中厚壁菌門、α-變形菌綱和α/β/γ-變形菌綱的MerA多樣性均高于渤海灣近岸的。3個(gè)區(qū)域具有不同的MerA組成特征，厚壁菌門中與Bacillussp. MB2021親緣關(guān)系最近的MerA的總豐度在養(yǎng)殖區(qū)最高(24.3%)，與Paenisporosarcinasp. TG20親緣關(guān)系最近的MerA的總豐度在排污河口最高(46.3%)。不同環(huán)境背景、外源merA基因輸入、汞等重金屬污染物的聯(lián)合選擇可能導(dǎo)致了渤海沉積環(huán)境中MerA多樣性和組成的變化。

渤海；排污河口；養(yǎng)殖區(qū)；汞還原酶；多樣性

1 引言

汞是生物毒性最大的重金屬之一，且無任何生理活性。汞的生物毒性主要是由于單甲基汞和Hg2+與半胱氨酸殘基中的硫原子有強(qiáng)的親和力，從而破壞了蛋白的結(jié)構(gòu)和功能[1]。汞污染是全球性的環(huán)境問題[2]，自然界，如土壤浸蝕、火山噴發(fā)、深海熱液噴發(fā)；以及人為因素，如化石燃料、化工生產(chǎn)[3—4]、核武器工廠[5]等均能產(chǎn)生并釋放汞。一些厭氧細(xì)菌還能產(chǎn)生毒性高于汞的甲基汞[6]，甲基汞在水體[7—8]和陸地[9]食物網(wǎng)中的生物蓄積和生物放大，已嚴(yán)重威脅到人類和環(huán)境的健康[10]。由于大氣對汞的傳播和沉降，還導(dǎo)致遠(yuǎn)離污染源的地區(qū)，如北極也暴露于不斷增加的汞和甲基汞中[11—12]。古菌和細(xì)菌，如厚壁菌門、放線菌門和變形菌門等在進(jìn)化中產(chǎn)生了對汞的抗性[13—14]。細(xì)菌的汞抗性系統(tǒng)包括mer操縱子，其中merA基因編碼的汞還原酶MerA為核心酶，依賴NAD(P)H將Hg2+還原為元素汞Hg0[13，15]。一方面，抗汞細(xì)菌產(chǎn)生的氣態(tài)的、毒性小的Hg0可以重新釋放到大氣中，對受汞污染的環(huán)境起到解毒作用；另一方面，由于Hg2+是汞甲基化反應(yīng)的底物，抗汞細(xì)菌還通過減少汞甲基化反應(yīng)的底物供給，減少了甲基汞的產(chǎn)生和危害[13]。受汞污染的土壤、海洋、河流和河口等環(huán)境分布著大量的抗汞細(xì)菌及其merA基因[16—21]，汞污染還導(dǎo)致了merA基因多樣性和拷貝數(shù)的增加[15，17，19，21]。

渤海是我國污染海域之一。近年來，大量生活和工業(yè)等污染物輸入渤海，使河口、港口和養(yǎng)殖區(qū)等近岸部分海域的汞、銅、鉻和鋅等重金屬污染嚴(yán)重[22—23]。其中，汞在沿岸底棲貝類中的蓄積已對當(dāng)?shù)鼐用裆眢w健康造成潛在的危害[24]。細(xì)菌merA基因在汞的還原和解毒中具有重要的作用，而目前有關(guān)渤海merA基因的研究還是個(gè)空白。本研究選取渤海灣天津?yàn)I海新區(qū)大沽河排污河口、渤海灣近岸和萊州灣墾利養(yǎng)殖區(qū)的表層沉積物，PCR擴(kuò)增merA部分基因序列并構(gòu)建克隆文庫，進(jìn)一步進(jìn)行基因序列的測定和分析。研究揭示了人類活動對渤海沉積環(huán)境中merA基因的多樣性、結(jié)構(gòu)組成和地理分布的影響。

2 材料與方法

2.1 樣品的采集

2011年10月在渤海灣近岸(BH，站位BH2、BH7、BH12和BH11)，2012年9月在渤海灣天津?yàn)I海新區(qū)大沽河排污河口(DG，站位DG11、DG10、DG9和DG7)和萊州灣墾利養(yǎng)殖區(qū)(K，站位K1、K3、K5和K9)各采集4個(gè)站位的表層沉積物樣品(37.576 8°～38.935 9°N，117.811°～118.978 7°E；見圖1)。樣品采集后置于無菌塑料袋中，冰盒低溫運(yùn)輸，實(shí)驗(yàn)室-80℃保存。研究區(qū)表層沉積物中鉛、鎘、鎳、鉻、鋅、汞和銅的含量由國家海洋局第一海洋研究所海洋地質(zhì)綜合實(shí)驗(yàn)室測定完成。

2.2merA基因擴(kuò)增和基因文庫的構(gòu)建

各取0.5 g表層沉積物樣品，采用FastDNA R○土壤DNA 提取試劑盒(MPbio公司，美國)提取基因組。采用放線菌門、厚壁菌門、α-變形菌綱和β/γ-變形菌綱merA基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表1)。PCR反應(yīng)采用TransStartTMTaq DNA聚合酶(全式金，北京)，PCR反應(yīng)體系包括：1 μL DNA，1 μL引物(0.2 μmol/L 終濃度)，5 μL 緩沖液，4 μL dNTP，1 μL DNA 聚合酶(2.5 U)，反應(yīng)體系為50 μL。反應(yīng)條件：94℃，5min；94℃，10 s，退火10 s，72°C延伸0.5 min或1 min(α-變形菌綱)，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。退火溫度和擴(kuò)增片段長度如表1所示。合并2個(gè)PCR產(chǎn)物，采用1%的瓊脂糖電泳后，切下與目的基因分子量大小相近的條帶，采用瓊脂糖回收試劑盒(天根，北京)進(jìn)行純化，pBS-T載體連接后，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞(天根，北京)構(gòu)建克隆文庫，經(jīng)M13通用引物驗(yàn)證陽性克隆后，委托上海桑尼公司完成序列測定。

圖1 研究區(qū)地理位置及站位分布Fig.1 Geographical location of study area and sampling sites渤海灣近岸BH：BH2，BH7，BH12，BH11；天津?yàn)I海新區(qū)大沽河排污河口DG：DG11，DG10，DG9，DG7；墾利養(yǎng)殖區(qū)K：K1，K3，K5，K9nearshore of Bohai Bay BH: BH2, BH7, BH12, BH11; Wastewater discharge of Dagu River in Tianjin Bin hai New Area DG: DG11, DG10, DG9, DG7; Kenli aquaculture facility K: K1, K3, K5, K9

門/綱引物退火溫度/℃擴(kuò)增片斷/bp參考文獻(xiàn)放線菌門ActinomyceteAct-Fw5′-CSGAVTTCGTSTACGTCGC-3′Act-Rv5′-GCCATGAGGTASGGG-3′50400[17]厚壁菌門FirmicutesFir-Fw5′-GTTTATGTWGCWGCYTATGAAGG-3′Fir-Rv18325＇-CCTTCWGCCATYGTTARATAWGG-352455[17]β/γ-變形菌綱β/γ?Proteobacteria#91(A7s-n．F)5′-CGATCCGCAAGTGGCIACBGT-3′#54(A5-n．R)5′-ACCATCGTCAGRTARGGRAAVA-3′55288[25]α-變形菌綱α?ProteobacteriaAl-F1085′-TCCAAGRCGATGATCCGRGC-3′Al-R9065′-TAGGCNGCCATRTAGACGAACTGRTC-3′51812本研究

2.3merA基因序列的生物信息學(xué)分析

將獲得的基因序列去除載體和引物序列，并翻譯成蛋白序列MerA后，采用BLAST工具在GenBank 數(shù)據(jù)庫中 (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)與近緣蛋白序列進(jìn)行比對。采用DOTUR軟件[26]，在不小于97%相似性水平上分析MerA的操作分類單元(OTUs)，并計(jì)算香農(nóng)-韋弗多樣性指數(shù)(H′)。MerA文庫覆蓋率計(jì)算公式為：C=[1-(n/N)]×100%，其中n為單個(gè)OTU數(shù)目，N為總的OTUs數(shù)量。采用DNA Star軟件中的Clustal W和BioEdit對MerA蛋白序列與GenBank中近緣蛋白序列進(jìn)行多重比對，采用MEGA4.0軟件中的相鄰連接法 (Neighbor-Joining) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值(bootstraps)設(shè)為1 000。

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用R軟件[27]vegan程序中的Hellinger 距離和Ward連接方法對各個(gè)門/綱的MerA OTUs及其相對豐度進(jìn)行Q聚類分析，并采用融合水平值和Mantel相關(guān)評價(jià)最優(yōu)聚類數(shù)。

2.5 基因序列

將獲得的序列提交到NCBI，基因序列號為KP2

34395-KP234517，KP731588-KP731608，KP715265-KP715269。

3 結(jié)果與分析

3.1 重金屬分布

結(jié)果如表2所示，鉛、鎳、鋅、鎘和銅平均含量在排污河口(DG)最高；鉻的平均含量在渤海近岸(BH)最高；汞的平均含量在養(yǎng)殖區(qū)(K)最高，其次為排污河口，渤海灣近岸最低。在總體上，排污河口的重金屬污染最嚴(yán)重，養(yǎng)殖區(qū)的汞污染最嚴(yán)重。

表2 渤海表層沉積物中的重金屬含量

續(xù)表2

3.2 汞還原酶MerA蛋白序列的多樣性分析

研究共獲得752個(gè)含有merA基因片段的克隆，其中采用厚壁菌門、α-變形菌綱和β/γ-變形菌綱特異性引物分別獲得了278、179和295個(gè)克隆，分別獲得了35、33和81個(gè)MerA OTUs。采用β/γ-變形菌綱特異性引物同時(shí)獲得了α/β/γ-變形菌綱merA基因片段，采用放線菌門特異性引物未獲得merA基因片段。

由表3可以得出，厚壁菌門MerA蛋白序列的平均香農(nóng)-韋弗多樣性指數(shù)在養(yǎng)殖區(qū)最高(1.82)，其次為排污河口(1.75)，渤海灣近岸最低(1.55)。采用本研究設(shè)計(jì)的α-變形菌綱merA基因特異性引物，在養(yǎng)殖區(qū)存在高比例的非特異性擴(kuò)增，僅獲得17個(gè)含有目的基因片段的克隆，對此不進(jìn)行分析比較。由表4可以得出，排污河口的α-變形菌綱MerA蛋白序列的平均香農(nóng)-韋弗多樣性指數(shù)(1.92)高于渤海灣近岸的(1.28)。α/β/γ-變形菌綱MerA蛋白序列的香農(nóng)-韋弗多樣性指數(shù)在DG10最高，在K1最低。當(dāng)不考慮BH11站位的偏高值，由表5可以得出，α/β/γ-變形菌綱的平均香農(nóng)-韋弗多樣性指數(shù)從高到低依次為排污河口(2.55)，養(yǎng)殖區(qū)(2.42)和渤海灣近岸(2.35)。

表3 渤海表層沉積物中厚壁菌門MerA多樣性

表4 渤海表層沉積物中α-變形菌綱MerA多樣性

續(xù)表4

表5 渤海表層沉積物中α/β/γ-變形菌綱MerA多樣性

3.3 MerA蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育分析

3.3.1 厚壁菌門MerA蛋白序列

如圖2所示，研究獲得35個(gè)厚壁菌門的MerA OTUs，與GenBank 數(shù)據(jù)庫中8個(gè)屬的MerA蛋白序列親緣關(guān)系最近，包括專性嗜堿芽孢桿菌BacilluspseudofirmusOF4 (相似度，93%～96%)，芽孢桿菌屬Bacillussp. SOK1b (相似度，87%)、芽孢桿菌屬Bacillussp. MB2021(相似度，94%～100%)、Paenisporosarcinasp. TG20(近似度，87%～97%)、萊氏無膽甾原體AcholeplasmalaidlawiiPG-8A(相似度，99%)、芽孢八疊菌屬Sporosarcinasp. G3(相似度，93%～94%)、輕型鏈球菌Streptococcusmitis(相似度，100%)、Pontibacillusmarinus(相似度，92%～93%)、丁酸梭菌Clostridiumbutyricum(相似度，100%)和Lacticigeniumnaphtae(相似度，74%)。這些參考序列主要分布于堿性土壤、污水、冰川底冰和南極淡水環(huán)境中，少部分分布于曬鹽場、海灣等高鹽環(huán)境，說明渤海沉積物中厚壁菌門的MerA有可能來源于陸地環(huán)境。

3.3.2 α-變形菌綱MerA蛋白序列

如圖3所示，研究獲得33個(gè)α-變形菌綱的MerA OTUs，與GenBank 數(shù)據(jù)庫中10個(gè)屬的親緣關(guān)系最近，包括顆粒居大洋菌Oceanicolagranulosus(相似度，70%)、深海深海螺旋菌Thalassospiraprofundimaris(相似度，60%)、短桿菌屬Bradyrhizobiumsp. Is-D308(相似度，61%～73%)、南極十八桿菌Octadecabacterantarcticus(相似度，63%～87%)、雷辛格氏菌屬Leisingeraaquimarina(相似度，86%～95%)、生絲單胞菌屬Hyphomonassp. CY54-11-8 (相似度，65%～68%)、Defluviimonassp. 20V17(相似度，81%)、嗜堿海岸桿菌Maritimibacteralkaliphilus(相似度，90% )、亞硫酸鹽桿菌屬Sulfitobactersp. CB2047(相似度，98%～99%)和黏液玫瑰變色菌RoseovariusmucosusDSM 17069(相似度，84%～100%)。這些參考序列主要分布于海洋環(huán)境中。

3.3.3 α/β/γ-變形菌綱MerA蛋白序列

如圖4所示，α/β/γ-變形菌綱的MerA蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育樹有2大分支。其中一個(gè)分支屬于α-變形菌綱(49個(gè)OTUs)，含有類群Ⅰ和Ⅱ(Group Ⅰ和Group Ⅱ)，與任蒼白桿菌Ochrobactrumanthropi(相似度，76%)、深海深海螺旋菌Thalassospiraprofundimaris(相似度，75%)和海王生絲單胞菌Hyphomonasneptunium(相似度，69% )的親緣關(guān)系最近。第二個(gè)分支(32個(gè)OTUs)屬于β/γ-變形菌綱，含有類群Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ (Group Ⅲ，Group Ⅳ 和Group Ⅴ)，與海桿狀菌屬M(fèi)arinobactersp.(相似度，100%)、波羅的海深海桿菌Idiomarinabaltica(相似度，100%)、Marinobactersantoriniensis(相似度，77%)、Sedimenticolaselenatireducens(相似度，75%)、北極嗜冷單孢菌Psychromonasarctica(相似度，84%～99%)、韓國姜氏菌Kangiellakoreensis(相似度，77%)和施氏甲單孢菌Pseudomonasstutzeri(相似度，72%～100%)親緣關(guān)系最近。這些參考序列主要分布于海洋和河口環(huán)境；而類群Ⅰ和類群Ⅱ部分序列與受汞污染的淡水河流沉積環(huán)境中MerA序列的親緣關(guān)系最近。此外，多數(shù)α/β/γ-變形菌綱的MerA序列與已知序列的相似性較低，說明渤海發(fā)育新穎的MerA種類。

圖2 渤海表層沉積物中厚壁菌門MerA進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of Firmicutes MerA in Bohai Sea surface sediment

圖3 渤海表層沉積物中α-變形菌綱MerA進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of α-Proteobacteria MerA in Bohai Sea surface sediment

3.4 不同區(qū)域MerA的主要組成特征

3.4.1 不同區(qū)域厚壁菌門MerA的主要組成特征

圖2中，類群Ⅰ (Group Ⅰ)由與Paenisporosarcinasp. TG20親緣關(guān)系最近的8個(gè)OTUs 組成(相似度，87%～100%)，是排污河口的優(yōu)勢類群，其在排污河口總豐度也最高(46.3%)，其次為養(yǎng)殖區(qū)(31.0%)，渤海近岸中，離排污河口最近的BH7總豐度為50%，接近于污河口含量，其他站位的總豐度僅為2.7%。類群Ⅱ (Group Ⅱ)由與芽孢桿菌屬Bacillussp. MB2021親緣關(guān)系最近的6個(gè)OTUs (相似度，99%～100%)組成，是養(yǎng)殖區(qū)的優(yōu)勢類群，其在養(yǎng)殖區(qū)總豐度也最高(24.3%)，其次為渤海近岸(12.5%)，排污河口最低(2.8%)。

3.4.2 不同區(qū)域α-變形菌綱MerA的主要組成特征

圖3中，aa-DG7-35(與Bradyrhizobiumsp. DFCI-1相似度，59%)是排污河口的優(yōu)勢種類，豐度為29.1%，在渤海灣近岸無分布。aa-BH7-14 (與Bradyrhizobiumsp. Is-D308相似度，61%)是渤海灣近岸的優(yōu)勢種類，其豐度(27.4%)高于排污河口的(5.4%)。類群Ⅰ (Group Ⅰ)由與Hyphomonassp. CY54-11-8親緣關(guān)系最近2個(gè)OTUs組成(相似度，65%和68%)，在渤海灣近岸總豐度(16.8%)高于在排污河口的(2.1%)。

3.4.3 不同區(qū)域α/β/γ-變形菌綱的MerA的主要組成特征

圖4中，類群Ⅰ是渤海灣近岸的優(yōu)勢類群，其總豐度(31.49%)也高于排污河口(13.9%)和養(yǎng)殖區(qū)(6.7%)的。類群Ⅱ是排污河口的優(yōu)勢類群，其總豐度(32.6%)也高于渤海灣近岸(24.0%)和養(yǎng)殖區(qū)(22.7%)的。類群Ⅲ與海洋環(huán)境中的Psychromonasarctica(相似度84%～99%)親緣關(guān)系最近，是養(yǎng)殖區(qū)的優(yōu)勢類群，其總豐度(24.6%)高于排污河口和渤海近岸的。

工會是在黨的領(lǐng)導(dǎo)下獨(dú)立自主開展工作的群眾性組織。作為國有特大型企業(yè)的工會組織，在維護(hù)職工權(quán)益、協(xié)調(diào)勞動關(guān)系、促進(jìn)和諧創(chuàng)建等方面具有其他組織不可替代的優(yōu)勢。當(dāng)前，企業(yè)的用工制度、工作環(huán)境、管理重點(diǎn)、員工隊(duì)伍構(gòu)成、需求層次、意識形態(tài)等各方面都發(fā)生了顯著的變化，因而工會權(quán)益維護(hù)、參政議政、生產(chǎn)建設(shè)、教育引領(lǐng)的難度不斷加大，工會工作面臨著全新的選擇和考驗(yàn)。在這種大環(huán)境下，如何把住時(shí)代的脈搏，高效規(guī)范地履行職責(zé)，使工會組織有作為、有地位、有影響，使工會干部有形象、有威信、有人氣，筆者認(rèn)為應(yīng)當(dāng)著重把握好以下四個(gè)方面：

3.5 MerA群落結(jié)構(gòu)和分布

3.5.1 厚壁菌門MerA的群落結(jié)構(gòu)和分布

厚壁菌門MerA的群落結(jié)構(gòu)分為3類，如圖5a所示。排污河口所有站位、渤海灣近岸的BH7、養(yǎng)殖區(qū)的K3和K5屬于第1類；K9、BH12和BH11屬于第2類；BH2和K1屬于第3類。排污河口屬于第1類，BH7地理位置靠近排污河口，也具有排污河口MerA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。養(yǎng)殖區(qū)和渤海灣近岸MerA結(jié)構(gòu)變化較大。

3.5.2 α-變形菌綱MerA的群落結(jié)構(gòu)和分布

如圖5b所示，α-變形菌綱MerA的群落結(jié)構(gòu)分為3類，渤海近岸的BH7、BH12、BH11屬于第1類；BH2屬于第2類，排污河口所有站位屬于第3類。因此，渤海近岸和排污河口的MerA具有不同的組成特點(diǎn)。

3.5.3 α/β/γ-變形菌綱的MerA的群落結(jié)構(gòu)和分布

α/β/γ-變形菌綱MerA的群落結(jié)構(gòu)劃分為4類，如圖5c所示。渤海灣近岸的4個(gè)站位和DG10屬于第1類；K1、K 3、K 9、DG7和DG 9屬于第2類；DG11和K5 分別為第3類和第4類。該結(jié)果表明渤海近岸的α/β/γ-變形菌綱MerA的組成和結(jié)構(gòu)不同于養(yǎng)殖區(qū)和排污河口的；養(yǎng)殖區(qū)和排污河口MerA的結(jié)構(gòu)變化較大，但兩個(gè)區(qū)域的相似程度仍高于與渤海近岸的。

4 討論

本研究獲得厚壁菌門、α-變形菌綱和α/β/γ-變形菌綱的149個(gè)MerA OTUs，說明渤海沉積環(huán)境中發(fā)育多樣性豐富的MerA，在汞污染的環(huán)境修復(fù)中具有重要作用。Oregaard和S?rensen[17]從添加汞的表層土壤中擴(kuò)增獲得少量的放線菌merA基因序列，在添加汞的表層以下土壤中沒有獲得。本研究在缺氧的海洋沉積物中，以及Chadhain等[21]在淡水河流沉積物中[21]也未獲得放線菌merA基因序列。這提示含有merA基因的放線菌可能并不是缺氧環(huán)境中的主要功能類群，或者在缺氧環(huán)境和有氧環(huán)境中放線菌具有不同汞還原機(jī)制。此外，研究采用β/γ-變形菌綱的merA基因特異性引物不僅獲得β/γ-變形菌綱的merA基因序列，也獲得一些與淡水河流沉積環(huán)境中α-變形菌綱的merA基因親緣關(guān)系最近的序列。由于采用該引物在土壤中沒有獲得這些基因序列[17]，我們推斷含有merA基因的α-變形菌綱不是土壤環(huán)境中的主要功能類群，而是淡水和海洋沉積環(huán)境中的主要功能類群。此外，本研究新設(shè)計(jì)了α-變形菌綱merA的特異性引物，該引物可以應(yīng)用于海洋環(huán)境中α-變形菌綱merA基因的研究，并有可能發(fā)現(xiàn)更多新的種類。

厚壁菌門、α-變形菌綱和α/β/γ-變形菌綱MerA群落組成和結(jié)構(gòu)呈一定的區(qū)域性分布，該結(jié)果支持Zinger等[28]報(bào)道的生態(tài)系統(tǒng)是影響海洋微生物分布的關(guān)鍵因素之一的結(jié)論。渤海灣近岸、排污河口和養(yǎng)殖區(qū)不同的水化學(xué)、沉積化學(xué)和生態(tài)背景等綜合因素對微生物形成長期適應(yīng)性選擇，導(dǎo)致微生物群落演替并建立各區(qū)域特有的MerA結(jié)構(gòu)和組成。汞的長期選擇性壓力會使細(xì)菌在個(gè)體水平上具備汞抗性，而MerA蛋白也可能在不同的細(xì)菌個(gè)體中具備不同的進(jìn)化和演變模式，從而形成高的多樣性[19]。如長期受到汞污染(13～917 μg/g濕質(zhì)量)的淡水河流沉積物中merA的多樣性極為豐富[21]。外源輸入以及聯(lián)合選擇壓力也會引入新的merA基因，如波羅的海海水養(yǎng)殖區(qū)的汞含量(最高0.03 μg/g干質(zhì)量)并不高，而餌料投放、養(yǎng)殖糞便、抗生素等共同作用使merA基因多樣性高于清潔對照區(qū)[19，29]。本研究結(jié)果也支持外源輸入和聯(lián)合選擇的觀點(diǎn)。(1)墾利養(yǎng)殖區(qū)

圖4 渤海表層沉積物中α/β/γ-變形菌綱MerA進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of α/β/γ-Proteobacteria MerA in Bohai Sea surface sediment

圖5 渤海沉積物環(huán)境中不同門MerA的群落結(jié)構(gòu)聚類分析Fig.5 Cluster analysis of community structure of MerA within different phyla/class in Bohai Sea surface sedimenta：厚壁菌門，b：α-變形菌綱，c: α/β/γ-變形菌綱a:Firmicutes, b:α-Proteobacteria, c:α/β/γ-Proteobacteria

中與Bacillussp. MB2021親緣關(guān)系最近的MerA蛋白序列(相似度，99%～100%)總豐度在養(yǎng)殖區(qū)最高(24.3%)，在排污河口和渤海近岸則分布較少。該參考菌株分布于牛瘤胃中，由此推斷這些MerA蛋白序列可能來源于養(yǎng)殖產(chǎn)品(海參和蝦)的腸道并隨糞便排出。此外，與南極冰川中Paenisporosarcinasp. TG20親緣關(guān)系最近的MerA蛋白序列(相似度，87%～100%)總豐度(46.3%)在排污河口最高，說明排污河口主要的抗汞細(xì)菌可能來源于陸地的水環(huán)境。(2) 排污河口汞含量低于養(yǎng)殖區(qū)，但α/β/γ-變形菌綱MerA蛋白序列的香農(nóng)-韋弗多樣性指數(shù)卻高于養(yǎng)殖區(qū)的，這說明MerA蛋白序列多樣性的控制因素并不是單一的汞含量，可能與排污河口鉛、鎘、鎳、鉻、鋅和銅含量高于養(yǎng)殖區(qū)有關(guān)。

綜上，MerA群落組成和結(jié)構(gòu)的地理分布受到排污河口、渤海灣近岸和養(yǎng)殖區(qū)不同生態(tài)背景的控制。外源merA基因輸入、汞等污染物的聯(lián)合選擇是排污河口和養(yǎng)殖區(qū)MerA蛋白序列多樣性高于渤海灣近岸的重要原因。

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Diversity of mercuric reductase genemerAin Bohai Sea sediment

He Peiqing1，Li Li2，Liu Jihua2，F(xiàn)ang Xisheng2

(1.MarineEcologyResearchCenter，TheFirstInstituteofOceanography，StateOceanicAdministration，Qingdao266061，China; 2.KeylaboratoryofStateOceanicAdministrationforMarineSedimentology&EnvironmentalGeology，TheFirstInstituteofOceanography，StateOceanicAdministration，Qingdao266061，China)

Mercuric reductase genemerAhad a potential role in mercuric reduction and detoxification in environment. During 2011-2012，surface sediments were collected from wastewater discharge of Dagu River in Tianjin Binhai New Area from Bohai Bay，near shore of Bohai Bay and Kenli aquaculture facility from Laizhou Bay. Clone libraries ofmerAfromActinomycete，F(xiàn)irmicutes，α-Proteobacteriaand β/γ-Proteobacteriawere constructed and the sequences were determined. Deduced MerA protein sequences ofmerAgene were then analyzed. The results showed that Bohai Sea sedimentary environment contained high diversity of MerA，and MerA diversity withinFirmicutes，α-Proteobacteriaand α/β/γ-Proteobacteriafrom wastewater discharge and aquaculture facility were higher than that in near shore of Bohai Bay. The MerA composition in different locations also differed，and withinFirmicutes，the highest total abundance of MerAs that had the highest similarity withBacillussp. MB2021 was found in aquaculture facility(24.3%)，while，the highest total abundance of MerAs that had the highest similarity withPaenisporosarcinasp. TG20 was found in wastewater discharge(46.3%). Different environment context，exogenousmerAgene input，and co-selection caused by mercury and other heavy metal pollutants might together lead to the change of merA diversity，community composition in Bohai Sea sedimentary environment．

Bohai Sea; wastewater discharge; aquaculture facility; mercuric reductase; diversity

10.3969/j.issn.0253-4193.2015.08.010

2014-12-07；

2015-06-02。

海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201105003)。

何培青(1972-)，女，山東省濟(jì)南市人，博士，主要從事海洋微生物研究。E-mail：hepeiqing@fio.org.cn

*通信作者：劉季花，女，研究員，從事海洋沉積學(xué)和沉積地球化學(xué)研究。E-mail:jihliu@fio.org.cn

Q938

A

0253-4193(2015)08-0105-12

何培青，李力，劉季花，等. 渤海沉積環(huán)境中細(xì)菌汞還原酶基因merA的多樣性分析[J].海洋學(xué)報(bào)，2015，37(8)：105—116，

He Peiqing，Li Li，Liu Jihua，et al. Diversity of mercuric reductase genemerAin Bohai Sea sediment[J]. Haiyang Xuebao，2015，37(8)：105—116，doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2015.08.010