耐異煙肼結(jié)核桿菌基因研究概況*

楊捷 葉品良 張傳濤 曾萍 盧潤生

（成都中醫(yī)藥大學(xué)·610075）

肺結(jié)核依然是當今世界性難題之一，其難以被攻克的原因是由于結(jié)核桿菌易產(chǎn)生耐藥性而對診斷以及治療造成困難。20世紀90年代以后結(jié)核病的耐藥發(fā)生率的逐漸上升，使其已成為全球結(jié)核病急劇上升的重要原因之一[1]。我國總耐藥率為27.8%，其中大部分患者為耐多藥者，且更趨向于對主要一線抗結(jié)核藥物的耐藥，其中尤以對異煙肼和利福平的耐藥率較高，分別為17.6%和16.6%，屬高耐藥國家，這也是造成結(jié)核病治療失敗的重要原因之一[2]。

異煙肼（INH）作為結(jié)核病化療最強的一線藥物，必須重視對其耐藥性的研究。國外有報道認為結(jié)核分支桿菌耐異煙肼的產(chǎn)生是和過氧化氫酶-過氧化物酶的編碼基因KatG基因的缺失和突變有關(guān)[3]，而KatG的活化為結(jié)核分枝桿菌的殺菌形式，也就是要在過氧化氫酶-過氧化物酶的作用下使其轉(zhuǎn)化為活性形式，而KatG基因發(fā)生突變或缺失，則異煙肼活化效率降低或不能活化，導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對異煙肼發(fā)生不同程度的耐藥[4]。國內(nèi)在1992年也有了相關(guān)的報到，Zhang等[5]發(fā)現(xiàn)異煙肼的耐藥性與KatG基因變異相關(guān)。近年來又有研究發(fā)現(xiàn)還有其他機制參與異煙肼耐藥，比如與inhA等基因的突變也有相關(guān)性。

1 耐異煙肼結(jié)核桿菌基因研究

由于結(jié)核菌比一般的細菌生長都要緩慢，一旦經(jīng)過抗結(jié)核治療后的結(jié)核菌生長更緩慢，通常需要數(shù)周才能生長。所以如何快速敏感的檢測結(jié)核分支桿菌耐異煙肼基因上，相關(guān)專業(yè)人員建立了等位特異多聚酶鏈反應(yīng)。也就是PCR擴增陰性的原理[6]。研究人員對結(jié)核分枝桿菌進行了一線抗結(jié)核藥物的耐藥性測定，結(jié)果顯示耐藥譜以耐異煙肼為最高[7]。對于結(jié)核分支桿菌耐異煙肼分子機制的研究已經(jīng)成為如今的較前沿的研究方向，許多研究的結(jié)果都表明耐異煙肼結(jié)核桿菌的產(chǎn)生可能是由于其 KatG 基因完全缺失或 KatG基因突變所致[8-10]。異煙肼作為重要的抗結(jié)核一線藥物，但因其結(jié)核分支桿菌對異煙肼的耐藥機制較為復(fù)雜，故近年來才在結(jié)核病研究中倍受關(guān)注。我國正處于結(jié)核病分子流行病學(xué)研究起步階段，并且我國是全球結(jié)核病高負擔國家之一，我國結(jié)核病疫情的高發(fā)為今后進一步的研究提供了很好的資源和現(xiàn)場[11]。

2 katG基因變異與耐異煙肼的關(guān)系

Leung等[12]報道，南方地區(qū)異煙肼的耐藥株有51%存在KatG基因的315位密碼子點突變，金嘉琳等[13]報道華東地區(qū)異煙肼的耐藥株有高達76.9%存在KatG基因的315位密碼子點突變，少數(shù)是由于katG基因的部分或全部缺失引起[14]。

KatG基因是唯一能激活異煙肼的酶，其315位點的變異在我國占50%以上，是我國最常見的基因突變形式，變異所占比例還是低于一些結(jié)核耐藥高發(fā)地區(qū)，如俄羅斯[15]，與南非等地區(qū)接近[16]。KatG基因315位密碼子突變可直接導(dǎo)致katG基因功能紊亂，這就導(dǎo)致了過氧化氫酶－過氧化物酶活性下降或喪失，阻止了異煙肼的活性化，從而導(dǎo)致結(jié)核分支桿菌對異煙肼產(chǎn)生不同程度的耐藥［17］。研究顯示KatG315突變與異煙肼耐藥的濃度有關(guān)，結(jié)核分支桿菌異煙肼高濃度耐藥菌株的KatG315突變率顯著高于異煙肼低濃度的耐藥菌株。同時研究顯示KatG315突變的結(jié)核分支桿菌分離株可能更容易獲得對其他抗結(jié)核藥的額外耐藥[18]。

KatG基因第463位點突變存在于20%～45%耐藥株中，但是多項研究已經(jīng)證實該突變與基因多態(tài)性相關(guān)，與異煙肼耐藥無關(guān)[12]。KatG基因除了廣泛被報到的314、463位點外，新發(fā)現(xiàn)突變頻率較高的還有A234G突變，但這個位點的突變多為聯(lián)合突變[12]。

3 inhA等基因突變與耐異煙肼的關(guān)系

異煙肼抑制結(jié)核分支桿菌的機制和部位尚不清楚。研究表明，最低抑菌濃度水平的異煙肼和乙胺丁醇可以阻斷99%的分支桿菌的分支菌酸的生物合成，且具有相同的作用位點[19]。同時研究證實結(jié)核分支桿菌耐異煙肼和乙胺丁醇的特性與inhA突變導(dǎo)致藥物結(jié)合位點減少有關(guān)[20]。也有研究證實了結(jié)核分枝桿菌KatG和inhA基因突變與耐異煙肼有關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)了2個新的katG基因突變位點(Val230Met 和Pro232Gln)，為進一步研究異煙肼的抗菌機制奠定了基礎(chǔ)[21]。

4 耐異煙肼結(jié)核分支桿菌的測定方法

PCR-DNA測序技術(shù)方法敏感、準確、特異，可快速檢測結(jié)核分枝桿菌KatG耐藥基因突變，有利于耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌耐藥性的快速檢測[22]。多數(shù)結(jié)核分支桿菌耐異煙肼是由于其 KatG 基因突變或缺失所致，PCR-SSCP方法敏感、特異，可快速檢測結(jié)核分支桿菌KatG基因突變或缺失[23]，用其篩選突變株也可達到快速檢測結(jié)核分支桿菌異煙肼耐藥的目的[24]。熒光PCR探針熔解曲線法檢測速度快速、特異性強、靈敏度較高，可用于結(jié)核分枝桿菌耐異煙肼突變的快速檢測，適于耐多藥結(jié)核病的快速篩查[25]?？焖贆z測耐利福平與異煙肼結(jié)核分枝桿菌KatG、inhA基因突變的DNA芯片具有較高的特異性和敏感性，可用于臨床結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測[26-27]。MAS-PCR方法有較高的敏感性及特異性，檢測 KatG基因315位點的突變以間接判斷對異煙肼的耐藥性[28-29]。

5 耐異煙肼肺結(jié)核臨床研究進展：

因為異煙肼的問世，并且廣泛的應(yīng)用以來，使得肺結(jié)核的治療進入了化療時代，也使得異煙肼成為了最重要的一線抗結(jié)核藥物[30]。但是由于耐藥性結(jié)核病發(fā)生率的逐年升高，使得化療進入了一個聯(lián)合用藥的階段。同時也有對耐異煙肼、耐利福平結(jié)核病的治療，治療效果雖好，但治療方案花費較高[31]。6種抗結(jié)核藥物的耐藥率中最高為異煙肼(17.6%)、最低為氨硫脲(1.3%)。初治耐藥率一般以耐鏈霉素為最高，耐異煙肼排其后，而獲得性耐藥率以耐異煙肼為最高。2000年流行病學(xué)調(diào)查中肺結(jié)核總耐藥率與1984～1985年和1990年相比呈下降趨勢，但耐藥性的發(fā)生則更趨向于耐多種藥物[32]。

6 討論

人類對結(jié)核病控制經(jīng)歷了三個具有劃時代意義的里程碑，目前我們正處于分子生物學(xué)技術(shù)的研究階段[1]。研究顯示結(jié)核分枝桿菌對異煙肼耐藥主要與KatG和inhA基因突變有關(guān)，但具體的結(jié)構(gòu)以及作用機制尚不清楚，有待未來一進步深入研究。在耐異煙肼結(jié)核分支桿菌的測定方面，我們已經(jīng)能夠做到快速篩查，但臨床應(yīng)用并不廣泛，檢測方法的優(yōu)化及推廣有待提高，以期更好的服務(wù)于臨床。

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