胰脂肪酶抑制劑產(chǎn)生菌的篩選和鑒定

朱，吳石金

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 3 1 0 0 3 2）

胰脂肪酶抑制劑產(chǎn)生菌的篩選和鑒定

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 3 1 0 0 3 2）

采用簡(jiǎn)單快速的改良篩選平板法對(duì)土壤來(lái)源的微生物進(jìn)行初篩，選取顯色圈有明顯變化的菌株進(jìn)行紫外-可見(jiàn)分光光度法復(fù)篩，最終篩選出一株胰脂肪酶抑制劑生產(chǎn)菌株z123。通過(guò)菌株的形態(tài)、生理生化特性、16S rDNA序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)鑒定，確定該菌株為枯草芽孢桿菌。研究結(jié)果表明，該菌株能夠產(chǎn)生抑制胰脂肪酶的活性物質(zhì)，其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)胰脂肪酶的抑制率為38.4%，值得進(jìn)一步研究。

脂肪酶抑制劑；枯草芽孢桿菌；分離篩選

現(xiàn)今大多數(shù)肥胖者屬于食物誘導(dǎo)肥胖。食物在小腸中消化吸收，通過(guò)全身各循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)身體各個(gè)部位。通常，當(dāng)能量攝入超過(guò)消耗時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)脂肪大量堆積。如能減少體內(nèi)能量的吸收便可有效控制體重。胰脂肪酶是由胰腺分泌并對(duì)人體內(nèi)甘油三酯消化過(guò)程起關(guān)鍵作用的酶［1］，應(yīng)用胰脂肪酶抑制劑可有效抑制腸道中胰脂肪酶對(duì)脂肪的分解，減少脂肪酸的生成，從而降低小腸黏膜對(duì)脂肪酸的吸收［2-3］。所以胰脂肪酶抑制劑是一種比較安全的新型減肥藥，它不刺激神經(jīng)系統(tǒng)，不進(jìn)入血液循序，只通過(guò)抑制腸胃中食物的吸收，達(dá)到減肥效果。

脂肪酶抑制劑的主要來(lái)源有化學(xué)合成、天然植物提取、微生物代謝等?；瘜W(xué)合成的有機(jī)磷化合物對(duì)脂肪酶有很強(qiáng)的抑制作用，但這類脂肪酶抑制劑主要用于研究脂肪酶抑制的機(jī)理［4-5］。目前對(duì)于脂肪酶抑制劑的研究以植物提取物方面為主，如：葡萄籽的提取物［6-7］、米胚芽的提取物［8-9］、荷葉生物堿［10-11］、刺五加中的三萜皂苷［12］等。目前用于治療肥胖的脂肪酶抑制劑主要是微生物發(fā)酵產(chǎn)物，如瑞士羅氏（Roche）公司在鏈霉菌中提取到有效的脂肪酶抑制劑成分lipstatin，其四氫化產(chǎn)物Orlistat是市售伊寧曼、賽尼可等減肥藥品的主要成分。

自然界中微生物種類繁多，大多微生物同時(shí)具有易分離、易培養(yǎng)、低耗高產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，已成為各種酶制劑、藥物的來(lái)源之一。微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)已對(duì)農(nóng)業(yè)、精細(xì)化工、食品加工、制藥和環(huán)境保護(hù)等產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響，隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，各種新型的微生物代謝產(chǎn)物還會(huì)不斷得到開(kāi)發(fā)［13］。本文擬通過(guò)建立能夠簡(jiǎn)單快速篩選具有胰脂肪酶活性抑制成分的篩選模型，對(duì)土壤來(lái)源的微生物進(jìn)行篩選，獲得代謝產(chǎn)物中含有胰脂肪酶活性抑制成分的菌株，為后續(xù)脂肪酶抑制劑的應(yīng)用研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

豬胰脂肪酶（購(gòu)于sigma）；對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯（購(gòu)于Alfa Aesar）；維多利亞藍(lán)（購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)）；聚乙烯醇（購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)）；橄欖油（購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

雙層全溫恒溫培養(yǎng)搖床；D-37520型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)ThermoFisher）；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療設(shè)備廠）；YXQ-LSS型全自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅醫(yī)療設(shè)備廠）；GE-100型DNA水平電泳儀；Mastercycler型聚合酶反應(yīng)儀（德國(guó)Eppendorf）；Gel Dac XR+型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD）；光學(xué)顯微鏡（日本尼康）；分光光度計(jì)（美普達(dá)儀器公司）；恒溫水浴鍋（萬(wàn)華實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，pH 7.0～7.2。

高氏一號(hào)培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉20，KNO31，NaCl 0.5，K2HPO40.5，MgSO40.5，F(xiàn)eSO40.01，pH 7.2～7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：麥芽浸粉10，蛋白胨5，NaCl 4，pH 7.0～7.2。

改良固體篩選平板：稱取聚乙烯醇3 g，加入100 mL蒸餾水并加熱溶解，過(guò)濾除去未溶解部分后滴定至pH 10.3，分別量取聚乙烯醇溶液30 mL和橄欖油10mL，并進(jìn)行乳化，量取10mL乳化液加入90 mL甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（0.05mol/L，pH 10.3）中，同時(shí)加入1 mL 1%的維多利亞藍(lán)作為指示劑。立即混勻。

固體培養(yǎng)基添加瓊脂20 g/L。分離平板在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，發(fā)酵培養(yǎng)基在30℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)基均115℃滅菌30min。

1.4 方法

1.4.1 菌株分離培養(yǎng)

土壤樣品采集自杭州周邊山林。將采集的土壤樣品以梯度稀釋法稀釋成土壤懸液，分別涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和高氏一號(hào)培養(yǎng)基分離平板上，30℃培養(yǎng)3 d，挑取單菌落于新的分離平板上，30℃繼續(xù)培養(yǎng)2 d。

1.4.2 胰脂肪酶抑制劑篩選模型

初篩：以橄欖油為底物，維多利亞藍(lán)為指示劑的改良篩選平板法［14-16］進(jìn)行初步篩選。

挑取單菌落于15mL玻璃試管內(nèi)用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，離心取上清液，與胰脂肪酶酶液等比例混合，經(jīng)改良篩選平板篩選。根據(jù)不同菌株代謝產(chǎn)物對(duì)胰脂肪酶的不同抑制效果，固體平板上會(huì)產(chǎn)生直徑大小不同的藍(lán)色水解圈。陰性對(duì)照樣品為胰脂肪酶酶液與發(fā)酵培養(yǎng)基的上清液等比例混合液，對(duì)比陰性對(duì)照樣品水解圈大?。ㄒ种颇芰εc水解圈大小呈負(fù)相關(guān)），篩選出具有產(chǎn)脂肪酶抑制劑的菌株。

復(fù)篩：利用分光光度計(jì)，以對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯為底物，發(fā)酵液樣品上清液與胰脂肪酶酶液等比例混合作為反應(yīng)物，于波長(zhǎng)410 nm下測(cè)定吸光度值。發(fā)酵液樣品的胰脂肪酶抑制能力與吸光度變化呈負(fù)相關(guān)，胰脂肪酶抑制能力越強(qiáng)則吸光度變化越?。?7-18］。

初篩復(fù)篩均以50μg/mL奧利司他為陽(yáng)性對(duì)照樣品。

1.5 胰脂肪酶抑制活性測(cè)定

胰脂肪酶酶活定義：在37℃條件下，以每分鐘轉(zhuǎn)化生產(chǎn)1μmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)活力單位（U）。

胰脂肪酶作用于Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）中的對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯，使之水解釋放出對(duì)硝基苯酚，后者在410 nm光波下有最大吸收值，通過(guò)測(cè)定吸光值的變化率可知對(duì)硝基苯酚的生成量，從而計(jì)算出酶的活性單位。酶活力的計(jì)算：

ΔA/min：410 nm波長(zhǎng)下的吸光值的變化率；VR：反應(yīng)液的體積，mL；D：稀釋倍數(shù)；E410：410 nm波長(zhǎng)下對(duì)硝基苯酚的摩爾消光系數(shù)，18.3 L/(mol·cm)；VE：所加酶液體積，m L；C：蛋白的原始濃度，mg/ mL；L：光程。

胰脂肪酶抑制率公式：

C：胰脂肪酶抑制率（%）；A：表示酶標(biāo)準(zhǔn)活性（U）；

B：抑制作用下酶活性（U）。

1.6 菌種鑒定

1.6.1 菌株的生長(zhǎng)形態(tài)、生理生化鑒定

將篩選到的產(chǎn)胰脂肪酶抑制劑的菌株z123接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中。觀察菌落形態(tài)，利用顯微鏡觀察菌體、芽孢形態(tài)以及芽孢著生部位，并對(duì)菌株z123進(jìn)行生理生化鑒定［19-20］。

1.6.2 菌株16S rDNA基因擴(kuò)增、測(cè)序

采用16S rDNA序列分析法對(duì)菌株進(jìn)行鑒定［21］。用OMEGA公司的基因組提取試劑盒（E.Z. N.A.TM Bacterial DNA Kit）快速提取菌株基因組DNA。以基因組DNA為模板，以通用引物27F和1492R為引物進(jìn)行16S rDNA序列DNA擴(kuò)增。

通用引物序列具體為：F27：5＇-GAGTTTGATC CTGGCTCAG-3＇，1492R：5＇-AGAAAGGAGGTGAT CCAGCC-3＇

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：96℃預(yù)變性5 min，95℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。切膠回收，擴(kuò)增產(chǎn)物交由GENEWIZ公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的初篩和復(fù)篩

在杭州市郊區(qū)梅家塢一帶采集土壤樣品，采用胰脂肪酶抑制劑篩選模型篩選分離得到200余株菌株，再經(jīng)分光光度計(jì)法檢測(cè)菌株發(fā)酵上清液對(duì)胰脂肪酶的抑制活性，最后篩選確定4株胰脂肪酶抑制劑生產(chǎn)菌株進(jìn)行后續(xù)研究。篩選結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。

圖1 胰脂肪酶抑制劑產(chǎn)生菌的初篩結(jié)果

表1 胰脂肪酶抑制劑產(chǎn)生菌的復(fù)篩結(jié)果

表2 菌株胰脂肪酶抑制劑活性測(cè)定

2.2 菌株的胰脂肪酶抑制劑活性測(cè)定

菌株4具有較強(qiáng)的胰脂肪酶抑制活性，通過(guò)上述方法測(cè)定各菌株對(duì)胰脂肪酶的抑制率，見(jiàn)表2。表2中可以看出菌株4具有較強(qiáng)的胰脂肪酶抑制活性，抑制率達(dá)到38%，因此選取菌株4進(jìn)行進(jìn)一步研究，并命名菌株4為z123。

2.3 菌株z123的形態(tài)觀察及生理生化特征

菌體在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中形態(tài)：菌苔邊緣不規(guī)則，表面白色，變厚不透明，表面干燥，有褶皺，在菌落中或菌落周邊培養(yǎng)基里形成褐色色素。革蘭氏染色呈陽(yáng)性。掃描電鏡（負(fù)染）下菌體呈桿狀，鞭毛側(cè)身，周身有纖毛，芽孢著生部落中間偏一端，細(xì)胞形態(tài)照片如圖2。菌株生理生化特征見(jiàn)表3。

(a)菌落形態(tài)

(b)革蘭氏染色

(c)菌株z123的電鏡掃描圖

(d)芽孢染色圖2菌株z123形態(tài)觀察

表3 菌株z123生理生化代謝

2.4 菌株z123的分子生物學(xué)分析

16S rDNA區(qū)域序列同源性分析是一種常用的細(xì)菌分子鑒定方法。菌株的16S rDNA片段擴(kuò)增后測(cè)序得到一個(gè)長(zhǎng)為1 427 bp的序列，16S rDNA以及Marker的瓊脂糖電泳見(jiàn)圖3。將序列結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST同源序列搜索，根據(jù)搜索結(jié)果，選取相似性較高的菌種的相關(guān)序列進(jìn)行分析。利用MEGA 6.0軟件中的Neighbor-Joining法對(duì)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖4所示。分析結(jié)果表明，菌株z123與枯草芽孢桿菌遺傳距離最近。因此初步鑒定z123為Bacillus subtilis（枯草芽孢桿菌）。

3 討論

自然界中微生物種類繁多，其代謝產(chǎn)物大相徑庭，而微生物往往具有易培養(yǎng)，生長(zhǎng)快速等優(yōu)點(diǎn)，是各種酶制劑、藥物的理想生產(chǎn)者。本文從杭州梅家塢的土壤中分離出一株產(chǎn)胰脂肪酶抑制劑的菌株，其菌苔在培養(yǎng)基上呈不透明白色，邊緣不規(guī)則，且有褶皺，并能夠在其菌苔中或菌苔周邊培養(yǎng)基內(nèi)產(chǎn)生褐色色素。通過(guò)菌株的形態(tài)、生理生化以及分子方面的鑒定，初步鑒定菌株z123為枯草芽孢桿菌。初步研究表明，其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)胰脂肪酶有較強(qiáng)的抑制能力，抑制率達(dá)到38.4%。目前，進(jìn)入商品化的脂肪酶抑制劑成分主要是Lipstatin的氫化物奧利司他，Lipstatin由毒三素鏈霉菌產(chǎn)生，其發(fā)酵效價(jià)可達(dá)911μg/m L［22］。此外，孫菲等篩選到對(duì)胰脂肪酶抑制率達(dá)61%的放線菌。而本文則從細(xì)菌代謝產(chǎn)物中獲得，后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)菌株z123進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究，提高菌株產(chǎn)胰脂肪酶抑制劑活性成分的能力，并嘗試從菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中分離胰脂肪酶抑制劑活性成分，推測(cè)其將會(huì)是一種新型的胰脂肪酶抑制劑。

圖3 菌株z123 16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳圖N—Narker；1—擴(kuò)增后的16S rDNA

圖4 菌株z123系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

［1］GARZA A L，MILAGRO F I，BOQUE N，etal.Natural inhibitors of pancreatic lipase as new players in obesity treatment［J］. PlantaMedica，2011，77(8)：773-785.

［2］MARRELLIM，LOIZZOM R，NICOLETTIM，etal.In vitro investigation of the potential health benefits ofwild Mediterranean dietary plants as anti-obesity agents withα-amylase and pancreatic lipase inhibitory activities［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2014，94(11)：2217-2224.

［3］HOSSAIN P，KAWAR B，NAHASM E.Obesity and diabetes in the developing world：a growing challenge［J］.New England Journal of Medicine，2007，356(3)：213-215.

［4］KOKOTOSG.Inhibition of digestive lipases by 2-oxo amide triacylglycerol analogues［J］.Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2003，22(5-6)：255-269.

［5］ELLROTT T.Aktuelle medikament?se Ans?tze in der Adipositastherapie［J］.DMW-DeutscheMedizinischeWochenschrift，2000，125(9)：256-261.

［7］任秀娟，馬海樂(lè).葡萄籽提取物脂肪酶抑制活性篩選及抑制機(jī)理的研究［J］.食品工業(yè)科技，2009(6)：181-183.

［8］王燕飛，張暉，郭貫新.米胚芽中胰脂肪酶抑制劑的抑制機(jī)理研究［J］.食品科技，2004(6)：94-96.

［9］張暉，溫懷宇，姚惠源.大米胚芽中脂肪酶抑制劑的研究［J］.糧油食品科技，2004，19(1)：9-11.

［10］朱曉青，呂敬慈，霍世欣，等.荷葉生物堿對(duì)胰脂肪酶的抑制作用［J］.上海大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，13(1)：85-87.

［11］王玉霞，劉斌，姜艷艷.荷葉生物堿提取純化工藝研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，36(9)：622-626.

［12］LIFang，LIWei，F(xiàn)U Hongwei，et al.Pancreatic lipase-inhibiting triterpenoid saponins from fruits of Acanthopanax senticosus［J］.Chemical and Pharmaceutical Bulletin，2007，55(7)：1087-1089.

［13］陳堅(jiān)，堵國(guó)成，衛(wèi)功元，等.微生物重要代謝產(chǎn)物——發(fā)酵生產(chǎn)與過(guò)程解析［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

［14］施巧琴，堿性脂肪酶的研究——I.菌株的分離和篩選［J］.微生物學(xué)通報(bào)，1981，8(3)：108-110.

［15］鄔敏辰，孫崇榮，鄔顯章.平板擴(kuò)散法粗略確定堿性脂肪酶的活性［J］.無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，19(2)：168-172.

［16］劉蘭，周培華，曾偉，等.脂肪酶抑制劑產(chǎn)生菌的篩選和鑒定［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2013.32(2)：219-223.

［17］孫菲，鄭榕，楊煌建，等.胰脂肪酶抑制劑產(chǎn)生菌的篩選［J］.生物技術(shù)進(jìn)展，2014，4(1)：40-43.

［18］姚朗，蘇勇，蔣華良.96孔板比濁法胰脂肪酶抑制劑體外篩選模型的建立［C］.中國(guó)藥學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì).2004.

［19］JOHN G H，NOEL R K，HAS P，et al.Bergey's manual of determinative bacteriology［M］.9th ed.Baltimore：Williams and Wilkins Press，1994.

［20］東秀珠.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社，2001.

［21］馮興，潘康成，張順泉.一株益生芽孢桿菌PabO2的16S rDNA測(cè)序鑒定［J］.中國(guó)飼料，2008(17)：4-7.

［22］韓俊茹，陳錫永.Lipstatin高產(chǎn)菌株的篩選［J］.中國(guó)抗生素雜志，2007，32(8)：459-461.

（責(zé)任編輯：朱小惠）

Screening and identification of pancreatic lipase inhibitor-producing strain

ZHU Jun，WU Shijin
(College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China)

The soilmicrobes were preliminarily screened by a simple and modified rapid screening method.The strains with significant change in color ring were selected to conduct a secondary screening through UV-visible spectrograph and one strain z123 capable of producing pancreatic lipase inhibitor was finally obtained.It was identified as Bacillus subtilis based on morphology，physiological and biochemical characterization，16S rDNA sequence homology analysis and phylogenetic tree.The inhibition rate of the fermentation product reached 38.4%，which had great value for further study.

pancreatic lipase inhibitor；Bacillus subtilis；isolation and screening

TQ920.1

A

1674-2214(2015)04-0010-05

2015-04-16

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LQ14C170002，LY13B070008）

朱（1989—），女，浙江杭州人，碩士，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)，E-mail：240038411@qq.com.通信作者：吳石金教授，E-mail：wujan28@zjut.edu.cn.