益氣活血藥對心肌梗死大鼠心臟蛋白激酶C表達的影響

吳愛明 婁利霞 張冬梅 聶波 趙久麗 趙明鏡

·論著·

益氣活血藥對心肌梗死大鼠心臟蛋白激酶C表達的影響

吳愛明 婁利霞 張冬梅 聶波 趙久麗 趙明鏡

目的 探討益氣活血中藥(生脈注射液聯合血塞通注射液)對心肌梗死大鼠心臟蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)表達的影響。方法 SD大鼠隨機分為模型組、假手術組、卡托普利組和益氣活血組。結扎大鼠心臟左冠狀動脈前降支建立心肌梗死模型(假手術組只穿線,不結扎)。模型組和假手術組給予生理鹽水;卡托普利組給予卡托普利片4.39 mg/(kg·d)溶解灌胃;益氣活血組給予生脈注射液3.51 mL/(kg·d)聯合血塞通注射液17.54 mg/(kg·d)腹腔注射。治療4周后取材,稱重計算心臟質量指數;RT-PCR法檢測左心室心肌組織PKC mRNA的表達;Western blot法檢測PKC蛋白的表達。結果 與假手術組比較,模型組心臟質量指數顯著增加(P＜0.01),PKC的mRNA和蛋白表達亦顯著增加(P＜0.05或P＜0.01);與模型組比較,益氣活血組和卡托普利組心臟質量指數顯著降低(P＜0.05),同時PKC的mRNA和蛋白表達也顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。結論 益氣活血藥(生脈注射液聯合血塞通注射液)可以改善心臟重構,其機制與抑制心肌梗死后心肌組織PKC的高表達有關。

心肌梗死; 心臟重構; 蛋白激酶C; 益氣活血

益氣活血法是中醫(yī)治療缺血性心臟病的常用有效治法。特別在心肌梗死的治療上,益氣活血藥應用廣泛,對緩解癥狀和改善患者預后有益。本研究在益氣活血法指導下,采用生脈注射液聯合血塞通注射液對心肌梗死大鼠進行實驗性干預,觀察其對心臟質量指數和心肌組織蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)基因和蛋白表達的影響,旨在探討益氣活血中藥治療心肌梗死的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠,雄性,體質量(200±240)g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,許可證編號: SCXK(京)2006-0009。

1.2 實驗儀器

小動物呼吸機、BL-420F生物機能實驗系統、實時熒光定量PCR儀、電泳儀、垂直電泳槽和轉膜儀。

1.3 實驗試劑

SYBR Green PCR Master Mix為美國ABI公司產品;PKC一抗(生產批號:sc-10800,美國 Santa cruz公司產品);二抗為辣根酶標記山羊抗兔IgG (生產批號:ZB-2301,北京中杉金橋公司);三磷酸脫氧 核 糖 核 苷 混 合 物 (deoxy-ribonucleoside triphosphate Mix,dNTP Mix)、多聚胸腺嘧啶寡核苷酸引物[Oligo(dT)15Primer]、莫洛尼鼠白血病病毒反轉錄酶(M-MLV Reverse Transcriptase)均為美國Promega公司產品。

1.4 心肌梗死大鼠模型造模方法

麻醉大鼠,仰臥位固定,氣管插管,機械輔助呼吸,手術區(qū)消毒備皮后,在第三、四肋間開胸,暴露心臟,結扎左冠狀動脈前降支(假手術組只穿線,不結扎),復位心臟,逐層縫合,心電圖示ST段抬高為造模成功。術后給予青霉素抗感染。

1.5 分組給藥方法

大鼠術后隨機分為模型組、假手術組、卡托普利組和益氣活血組。益氣活血組給予生脈注射液(雅安三九藥業(yè)有限公司,生產批號: 100301)3.51 mL/(kg·d)聯合血塞通注射液(昆明制藥集團股份有限公司,生產批號:10DL04) 17.54 mg/(kg·d)腹腔注射;卡托普利組給予卡托普利片(中美上海施貴寶制藥有限公司,生產批號:0810031)4.39 mg/(kg·d)溶解灌胃;模型組和假手術組給予生理鹽水。療程4周。

1.6 心臟質量指數測量方法

治療4周后,稱量體質量,然后麻醉,開胸取心臟,剪去非心組織,濾紙蘸干水分,稱量心臟質量,計算心臟質量/體質量(mg/g),即為心臟質量指數。

1.7 心肌組織PKCmRNA檢測方法

采用real time PCR法檢測心肌組織PKCmRNA相對表達量。PKC:133bp forward:5'-GCTTCAACATCGACATGCCTCACC-3';reverse:5'-ACATTCATGCCGCAGTCTTCACACT-3'。β-Actin:198bp forward:5'-AGATCCTGACCGAGCGTGGC-3'; reverse:5'-CCAGGGAGGAAGAGGATGCG-3'。擴增條件為:95℃10分鐘預變性,95℃變性30秒, 55℃退火30秒,72℃延伸20秒,40次循環(huán)。PKC mRNA的相對表達量按照2(-ΔΔct)法計算。

1.8 心肌組織PKC蛋白檢測方法

采用Western blot法檢測心肌組織PKC蛋白相對表達量。心肌組織低溫研磨破碎,裂解,提取總蛋白,二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)法蛋白定量,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉膜,封閉,依次與一抗、二抗孵育,化學發(fā)光法獲取條帶,掃描膠片后用IPP 6.0軟件進行目的條帶的灰度分析,計算PKC蛋白的相對表達量。

1.9 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行統計處理。實驗數據以均數±標準差(±s)表示,先進行正態(tài)性和方差齊性檢驗,符合正態(tài)分布和方差齊性的數據采用單因素方差分析,多組之間的兩兩比較采用LSD法;不符合正態(tài)分布的采用非參數檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體質量、心臟質量與心臟質量指數的比較

體質量、心臟質量與心臟質量指數均呈正態(tài)分布且方差齊,故采用單因素方差分析進行統計學比較。與假手術組比較,模型組心臟質量和心臟質量指數均顯著增加(P＜0.05或P＜0.01)。與模型組比較,卡托普利組心臟質量下降(P＜0.05);卡托普利組和益氣活血組的心臟質量指數都顯著降低(P＜0.05)。各組的體質量之間沒有統計學差異。見表1。

表1 體質量、心臟質量與心臟質量指數的比較(±s)

注:與假手術組比較,aP＜0.05,bP＜0.01;與模型組比較,cP＜0.05,dP＜0.01。

組別 n 體質量(g)心臟質量(mg)心臟質量指數(mg/g)模型組 5 369.20±33.24 1557.20±155.22a4.25±0.60b假手術組 5 390.60±15.47 1280.80±96.65c3.28±0.26d卡托普利組 5 365.00±39.38 1298.80±152.73c3.56±0.27c益氣活血組 5 384.00±38.54 1433.60±204.41 3.72±0.21c

2.2 心肌組織PKCmRNA、PKC蛋白表達的比較

PKCmRNA檢測數據呈正態(tài)分布且方差齊,故采用單因素方差分析進行統計學比較。與假手術組比較,模型組心肌組織PKC mRNA、PKC蛋白的表達顯著增加(P＜0.01)。與模型組比較,卡托普利組和益氣活血組的PKCmRNA、PKC蛋白表達顯著降低(P＜0.05),見表2、圖1。

表2 心肌組織PKCmRNA表達的比較(±s)

注:與假手術組比較,aP＜0.05,bP＜0.01;與模型組比較,cP＜0.05,dP＜0.01。

組別 PKCmRNA(n=5) PKC蛋白表達量(n=3)模型組 1.45±0.19b1.72±0.23a假手術組 1.04±0.19d1.00±0.06c卡托普利組 1.14±0.14c0.97±0.43c益氣活血組 1.05±0.30c0.84±0.38d

3 討論

心肌梗死是危害人類健康的急危重癥[1]。隨著生活節(jié)奏的加快,飲食習慣的改變,以及中國社會日益凸顯的老齡化等問題,心肌梗死的發(fā)病率居高不下[2]。據一項基于北京市疾病預防控制中心的全人群死亡監(jiān)測研究顯示[3]:2003～2007年北京市居民急性心肌梗死的粗死亡率為45.81/100 000; 5年間,因急性心肌梗死死亡的人數占總死亡人數的9.49%,占因心臟病死亡人數的40.24%;并且死亡率呈逐年增高趨勢,從2003年43.64/100 000上升到2007年58.81/100 000,上升了34.76%。在如此嚴峻的形勢下,進一步研究心肌梗死的病理機制,并開展中醫(yī)藥干預的實驗研究具有重要的現實意義。

隨著溶栓、介入技術的普及,心肌梗死的早期病死率顯著降低[4],但是患者仍然面臨心臟重構、心功能惡化和最終發(fā)展為心力衰竭而死亡的潛在風險[5]。心肌梗死向心衰進展的基本病理機制是心臟重構[6],心臟重構是一種復雜的病理過程。心肌梗死發(fā)生后,心肌組織缺血缺氧,一方面會造成血流動力學障礙,另一方面會導致一系列神經體液因子的激活和基因表達的變化。這些共同促使心臟發(fā)生重構,表現為心臟的大小、形態(tài)的改變,心肌損傷的加重,以及心功能的持續(xù)惡化。因此,延緩和抑制心臟重構是預防心肌梗死向心衰進展,降低死亡率的重點干預途徑。

中醫(yī)早在《靈書·厥病》篇就有“真心痛,手足青至節(jié),心痛甚,旦發(fā)夕死,夕發(fā)旦死”的記載。心肌梗死屬于中醫(yī)“胸痹”“真心痛”等范疇,為本虛標實之證,雖然證型復雜,但是氣虛血瘀是心肌梗死發(fā)病的共同病機。中醫(yī)認為“氣血相關、氣為血之帥、血為氣之母、氣行則血行”,益氣活血法是心肌梗死的基本治法[7],益氣活血方藥已被廣泛用在心肌梗死的治療上。研究證明益氣活血中藥具有改善心肌缺血、縮小梗死面積、抑制心臟重構、降低炎癥因子表達、促進血管新生、抗血小板聚集等藥理作用[8-12],并且在改善心肌梗死患者心功能,提高生活質量,降低患者死亡率上發(fā)揮了有益的治療作用[13-14]。

本研究在益氣活血法指導下,采用生脈注射液聯合血塞通注射液對心肌梗死大鼠進行實驗性干預,結果顯示,心肌梗死模型大鼠造模術后四周,心臟重構明顯,表現為心臟質量指數顯著增加;與模型組比較,益氣活血組和卡托普利組,心臟質量指數顯著降低,表明生脈注射液聯合血塞通注射液與卡托普利都可以改善心肌梗死后的心臟重構。本研究還發(fā)現心肌梗死大鼠心臟PKC基因和蛋白表達均顯著上調,而在給予益氣活血藥或卡托普利治療后可以明顯抑制心肌梗死后PKC基因和蛋白表達的上調。PKC是1977年日本學者在鼠腦細胞質成分中首次發(fā)現的一種蛋白激酶,依賴于Ca2+、二?；视?diacylglycerol,DAG)及磷脂酰絲氨酸刺激而激活、催化細胞內絲氨酸/蘇氨酸殘基的磷酸化,是細胞磷脂酰肌醇信號傳遞通路的關鍵環(huán)節(jié),廣泛參與細胞的增殖、分化,腫瘤的生長以及細胞內鈣穩(wěn)態(tài)的維持等諸多生物學過程。心肌梗死后心臟局部腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin-System,RAS)激活,血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)水平增加,AngⅡ與血管緊張素受體1(angiotensin receptor 1,AT1)受體結合,激活磷酸酯酶 Cβ(phosphatase Cbeta, PLCβ), 使 磷 脂 酰 肌 醇-4.5-二 磷 酸(phosphatidylinositol-4.5-bisphosphate,PIP2)水解生成三磷酸肌醇(inositol trisphosphate,IP3)和DAG,IP3促進細胞內Ca2+的釋放,Ca2+與DAG協同活化PKC。PKC在心臟重構中發(fā)揮了重要作用。一方面PKC可以促進心肌細胞的增殖,PKC的激活與心肌肥厚的進展密切相關[15-16],另一方面,PKC還可以促進心肌成纖維細胞的增殖[17],介導了心肌膠原重塑過程,PKC的活化及表達的增加,導致了心肌組織膠原含量的增高,Ⅰ、Ⅲ型膠原表達的增加以及Ⅰ/Ⅲ膠原比例的升高[18]。因此,心肌梗死后PKC表達上調所導致的心肌細胞和心肌成纖維細胞增殖是引起心臟質量指數增加的直接原因。PKC作為心臟重構的關鍵調控分子,正在成為延緩心肌梗死向心衰進展的潛在干預靶點[19]。本研究提示,益氣活血中藥生脈注射液聯合血塞通注射液對心肌梗死大鼠心臟PKC表達的抑制作用,是其改善心臟重構的重要分子機制之一,值得進一步深入研究。

[1] McManus DD,Piacentine SM,Lessard D,et al.Thirty-year (1975 to 2005)trends in the incidence rates,clinical features, treatment practices,and short-term outcomes of patients＜55 years of age hospitalized with an initial acutemyocardial infarction[J]. Am JCardiol,2011,108(4):477-482.

[2] 蘇懿,王磊,張敏州.急性心肌梗死的流行病學研究進展[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志,2012,10(4):467-469.

[3] 韋再華,高燕琳,蘇健婷,等.2003-2007年北京市戶籍居民急性心肌梗死死亡人群分布特征[J].中華預防醫(yī)學雜志, 2012,46(7):651-652.

[4] FalsiniG,Liistro F,Ducci K,et al.Shifting from pharmacological to systematicmechanical reperfusion therapy for acutemyocardial infarction via a cooperating network:impact on reperfusion rate and in-hospitalmortality[J].JCardiovasc Med(Hagerstown), 2008,9(3):245-250.

[5] Fan Y,Bai X,Chen Y,et al.Late percutaneous coronary intervention prevents left ventricular remodeling and improves clinical outcomes in patients with ST-elevation myocardial infarction[J].Clin Cardiol,2015,38(2):82-91.

[6] Cohn JN,Ferrari R,Sharpe N.Cardiac remodeling—concepts and clinical implications:a consensus paper from an international forum on cardiac remodeling.Behalf of an International Forum on Cardiac Remodeling[J].J Am Coll Cardiol,2000,35(3): 569-582.

[7] 劉艷萍,郭小剛,何開明,等.益氣活血法治療急性心肌梗死的相關研究進展[J].四川中醫(yī),2013,31(9):172-174.

[8] 胡國恒,胡哲,盛望,等.益氣活血方對大鼠缺血心肌血管新生及HGF影響的研究[J].中國中醫(yī)急癥,2013,22(9): 1478-1479,1484.

[9] 章燕,戴小華.益氣活血中藥改善急性心肌梗死后左心室重構實驗研究進展[J].安徽中醫(yī)學院學報,2012,31(2): 74-76.

[10] 劉寧.益氣活血方對心肌缺血大鼠血清細胞因子的影響[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志,2013,19(8):889-891,894.

[11] 吳成哲,黃朝忠,紀凱,等.益氣活血方對實驗性心肌梗死大鼠促血管新生機制研究[J].云南中醫(yī)中藥雜志,2014,35 (9):83-85.

[12] 王寶君,張慶翔,張蕾,等.益氣活血中藥配合雙聯抗血小板治療對急性心肌梗死大鼠血栓形成的影響[J].中醫(yī)雜志, 2013,54(14):1225-1229.

[13] 齊延偉,吳中榮,馮志英.參麥注射液治療急性心肌梗死60例臨床觀察[J].中醫(yī)藥導報,2015,21(6):93-95.

[14] 軒靜靜,高彩霞,關懷敏,等.參麥注射液治療急性心肌梗死后心力衰竭患者的遠期臨床療效[J].中成藥,2015,37(2): 465-467.

[15] 何華,高玖鳴,王文.PKCε在心肌肥厚中的作用地位[J].高血壓雜志,2006,14(7):514-516.

[16] 劉韜,秦牧,黃從新.蛋白激酶C與心肌肥厚及室性心律失常間的關系[J].醫(yī)學研究雜志,2012,41(3):172-174.

[17] 王立英,楊世杰.蛋白激酶C在心肌纖維化中的作用[J].藥學學報,2010,42(12):1467-1471.

[18] 郭銳,路明,武怡,等.福辛普利干預對阿霉素大鼠蛋白激酶C及心肌重塑的影響[J].中國醫(yī)藥導報,2013,10(5): 27-29.

[19] Belmonte SL,Blaxall BC.PKC-ing is believing:targeting protein kinase C in heart failure[J].Circ Res,2011,109(12): 1320-1322.

Effects of Yiqi Huoxue drugs on expression of protein kinase C in ratsw ith m yocardial infarction

WU Ai-ming,LOU Li-xia,ZHANG Dong-mei,et al. Key Laboratory of Chinese Internal Medicine of Ministry of Education and Beijing,Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University ofChinese Medicine, Beijing 100700,China

ZHAO Ming-jing,E-mail:mjgx2004@163.com

Objective To study effects of Yiqi Huoxue drugs(combine Shengmai injection with Xuesaitong injection)on expression of protein kinase C(PKC)in ratswithmyocardial infarction.Methods

SD rats were randomly divided intomodel group,sham operation group,captopril group and YiqiHuoxue group.Model rats of myocardial infarction were established by occlusion of the left anterior descending coronary artery(the sham operation group without occlusion of the left anterior descending coronary artery).Captopril4.39 mg/(kg·d)and distilled water(for the sham operation and model groups)were administered orally.Yiqi Huoxue drugs(combine Shengmai injection 3.51 mL/(kg·d)with Xuesaitong injection 17.54 mg/(kg·d)were administered intraperitoneally.The cardiac mass index was recorded after 4 weeks of treatment.The expressions of PKCmRNA ofmyocardium in left ventricular were detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction.And the expressions of PKC protein were observed by Western blot.Results Compared to the sham operation group,the cardiacmass and the ex-pressions of PKC mRNA and protein index in the model group increased significantly(P＜0.05 or P＜0.01).Compared to the model group,the cardiac mass index and expressions of Cx43 mRNA and protein decreased significantly in Yiqi Huoxue group and captopril group(P＜0.05 or P＜0.01). Conclusion Yiqi Huoxue drugs(combine Shengmai injection with Xuesaitong injection)can improve cardiac remodeling aftermyocardial infarction,which may through themechanism of its suppression effects of the high expression of PKC inmyocardial tissue aftermyocardial infarction.

Myocardial infarction; Cardiac remodeling; Protein kinase C; Yiqi Huoxue

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.09.011

2013-05-28)

(本文編輯:董歷華)

國家自然科學基金(81202685);北京市教委科研基地項目(BUCM2012)

100700北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院中醫(yī)內科學教育部和北京市重點實驗室[吳愛明(博士研究生)、婁利霞、張冬梅、聶波、趙久麗、趙明鏡]

吳愛明(1979-),2014級在讀博士研究生,副研究員。研究方向:中西醫(yī)結合心腦血管病應用基礎研究。E-mail:wam688@163.com

趙明鏡(1964-),碩士,研究員,博士生導師。研究方向:中西醫(yī)結合應用基礎研究。E-mail: mjgx2004@163.com