病毒性心肌炎小鼠體內(nèi)NT-proBNP的水平變化及意義

徐艷艷，范曉晨

病毒性心肌炎小鼠體內(nèi)NT-proBNP的水平變化及意義

徐艷艷，范曉晨

目的探討氨基末端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）在病毒性心肌炎（VMC）小鼠體內(nèi)的水平變化及其意義。方法100只Balb／c小鼠隨機(jī)分為VMC組（n＝60）和對(duì)照組（n＝40）。VMC組小鼠腹腔注射柯薩奇B3病毒（CVB3），對(duì)照組注射等量不含病毒的DMEM液。VMC模型建立后分別在第3、7、14、28天每組隨機(jī)處死10只小鼠，留取血液和心臟標(biāo)本。使用ELISA法檢測(cè)兩組小鼠血清中NT-proBNP含量，HE染色觀察心肌組織病理改變。分析VMC組小鼠不同時(shí)間血清NT-proBNP含量與心肌組織病理積分的關(guān)系。結(jié)果VMC組小鼠血清NT-proBNP水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），且VMC組不同時(shí)間的NT-proBNP水平之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。血清NT-proBNP水平與心肌組織病理積分呈顯著正相關(guān)性（r＝0.829，P＜0.05）。結(jié)論血清NT-proBNP水平可反映VMC小鼠心肌損傷的嚴(yán)重程度，可作為判斷其危險(xiǎn)分層的血清學(xué)指標(biāo)之一。

病毒性心肌炎；小鼠；氨基末端腦利鈉肽前體

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是由以腸道病毒為主感染引起的心肌組織局灶性或彌漫性炎癥。其臨床表現(xiàn)多變，輕者可無(wú)癥狀，重者可猝死，慢性病程可演變?yōu)閿U(kuò)張型心肌?。?］。目前臨床上尚無(wú)特異性診療方法。腦利鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）是利鈉肽家族中的一員。氨基末端腦利鈉肽前體（N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）是由心室肌細(xì)胞分泌的proBNP降解而成［2］。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于NT-proBNP的研究［3-4］多集中在心功能不全、腎功能不全、急性冠脈綜合征和肺部疾病等。但NT-proBNP在VMC中的研究鮮有報(bào)道。該研究以VMC模型小鼠為基礎(chǔ)，檢測(cè)其體內(nèi)NT-proBNP水平的變化，探討血清中NT-proBNP水平與VMC之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)病毒 柯薩奇病毒B3（coxsackievirus B3，CVB3）M株是由安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物教研室惠贈(zèng)，并在Hep-2細(xì)胞中傳代，反復(fù)凍融3次使病毒完全釋放，離心取上清液分裝，于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?6孔板接種Hep-2細(xì)胞，待長(zhǎng)滿后加入倍比稀釋后的病毒液，每個(gè)稀釋度8個(gè)復(fù)孔。逐日觀察4 d，顯示細(xì)胞縮小，浮于維持液。病變達(dá)到（+++）判定為病變孔，依據(jù)Reed-Muench方法計(jì)算病毒的組織培養(yǎng)半數(shù)感染量（50%tissue culture infectious dose，TCID50）為1×10-7。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性Balb／c小鼠100只，4周齡，于清潔級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)，重13～16 g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 Balb／c小鼠隨機(jī)分為VMC組（n＝60）和對(duì)照組（n＝40）。VMC組腹腔注射0.1 ml含1×102TCID50CVB3的DMEM液，對(duì)照組腹腔注射等量的不含CVB3的DMEM液。以后每天觀察記錄小鼠飲食飲水情況、活動(dòng)變化、毛發(fā)色澤改變、精神狀態(tài)、對(duì)外界刺激反應(yīng)情況、死亡情況等。

1.2.2 標(biāo)本采集 將接種當(dāng)天記為第0天，于第3、7、14、28天每組隨機(jī)抽取10只，摘眼球取血，4℃靜置30 min，3 000 r／min離心10 min，分裝，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。斷頸脫臼處死，碘伏棉球消毒胸腹部3次，打開(kāi)胸腔取出心臟，沿心臟長(zhǎng)軸面切成兩部分，生理鹽水沖洗干凈后放入10%福爾馬林溶液固定。

1.2.3 主要試劑及血清NT-proBNP水平的測(cè)定

NT-proBNP酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自蘇州卡爾文生物科技有限公司。取出凍存的血清，室溫下放置30 min使其完全解凍；取出ELISA試劑盒，室溫下平衡20 min，同時(shí)觀察濃縮洗滌液有無(wú)結(jié)晶，如有則水浴加熱使其溶解。按1∶20蒸餾水稀釋濃縮洗滌液。取出所需酶標(biāo)板條數(shù)，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔、樣本孔。標(biāo)準(zhǔn)品孔內(nèi)各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl；空白孔不加；樣本孔分別加入第3、7、14、28天VMC組和對(duì)照組小鼠血清10 μl，每孔再加40 μl樣本稀釋液。除空白孔外，每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μl，封板膜封住，37℃恒溫箱溫育1 h。棄去反應(yīng)孔內(nèi)液體，吸水紙上拍干。每孔加滿洗滌液，防止臨近孔洗滌液交叉污染。靜置1 min，棄去洗滌液，吸水紙上拍干，如此反復(fù)5次。每孔各加50 μl底物A、B，避光，37℃恒溫箱溫育15 min。每孔加50 μl終止液終止反應(yīng)。將96孔板放酶標(biāo)儀內(nèi)，調(diào)至450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（optical density，OD）值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值制出OD值-濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算各組小鼠血清中NT-proBNP的濃度值。

1.2.4 心肌病理學(xué)檢查 心肌組織固定后石蠟包埋，3 μm厚切片。常規(guī)HE染色，光鏡下觀察心肌病理改變。染色結(jié)果請(qǐng)兩位病理科醫(yī)師按照Rezkalla et al［5］方法進(jìn)行雙盲閱片計(jì)算心肌病理（炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死）積分，即每張切片隨機(jī)選5個(gè)高倍鏡視野（×400），計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死面積占整個(gè)視野的百分比：無(wú)病變計(jì)0分，病變＜25%計(jì)1分，25%～49%計(jì)2分，50%～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示。組間比較采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)、完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，兩變量間相關(guān)分析采用線性相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 一般情況VMC組小鼠第3天開(kāi)始有少飲、少食、少動(dòng)、聳毛、脫毛、毛色漸暗、精神萎靡、體重減輕、對(duì)外界刺激不敏感等異常情況出現(xiàn)并逐漸加重，第4天開(kāi)始有死亡，第7～10天為死亡高峰，第13天后無(wú)小鼠死亡，并且小鼠精神狀態(tài)逐漸恢復(fù)。小鼠共死亡11只，死亡率達(dá)18.33%。對(duì)照組小鼠飲食正常、活動(dòng)正常、毛色光滑發(fā)亮、體重增加、對(duì)外界刺激反應(yīng)敏捷，無(wú)死亡現(xiàn)象。

2.2 心肌組織病理變化

2.2.1 心臟大體改變 VMC組解剖顯示7～14 d小鼠心臟外膜出現(xiàn)大小不等的白色點(diǎn)狀、斑塊狀壞死灶，并且隨著病變進(jìn)展斑塊大小相繼發(fā)生改變。心外膜下可見(jiàn)點(diǎn)片狀淤血斑，心肌纖維彈性變差。對(duì)照組未見(jiàn)異常變化。

2.2.2 心肌組織形態(tài)學(xué)改變 對(duì)照組心肌纖維結(jié)構(gòu)正常，橫紋清晰，未見(jiàn)異常。VMC組第3天顯示心肌細(xì)胞腫脹，橫紋模糊不清，心肌纖維扭曲，間質(zhì)內(nèi)有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。第7天可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞大量變性、壞死融合成片，邊緣亦可見(jiàn)核碎裂。第14天部分炎癥病灶逐漸吸收，但仍處于較高水平，血管旁纖維細(xì)胞增生。第28天炎癥細(xì)胞進(jìn)一步減少，心肌細(xì)胞減少，纖維細(xì)胞增多，膠原纖維沉積，血管旁尤其明顯，纖維走形紊亂。見(jiàn)圖1。

2.2.3 各組小鼠心肌組織病理積分比較 采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析顯示，VMC組各時(shí)間小鼠心肌組織病理積分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝8.67，P＝0.001）。VMC組各時(shí)間小鼠心肌組織病理積分與對(duì)照組比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 VMC組與對(duì)照組小鼠心肌組織病理積分比較（分，）

表1 VMC組與對(duì)照組小鼠心肌組織病理積分比較（分，）

時(shí)間VMC組對(duì)照組t值P值第3天1.20±0.450.00±0.006.00＜0.001第7天2.60±0.550.00±0.0010.61＜0.001第14天2.00±0.710.00±0.006.33＜0.001第28天0.80±0.450.00±0.004.000.004

2.3 VMC組和對(duì)照組小鼠血清NT-proBNP水平的比較

2.3.1 各組小鼠血清NT-proBNP濃度比較 VMC

組小鼠血清中NT-proBNP濃度在接種CVB3后第3天開(kāi)始升高，第7天達(dá)到高峰，以后逐漸降低，第28天仍高于正常。采用方差分析各時(shí)間NT-proBNP濃度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝78.07，P＜0.001）。各時(shí)間VMC組NT-proBNP濃度與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 VMC組和對(duì)照組小鼠血清NT-proBNP的濃度值（pg／ml，）

表2 VMC組和對(duì)照組小鼠血清NT-proBNP的濃度值（pg／ml，）

時(shí)間VMC組對(duì)照組t值P值第3天775.80±108.3087.23±5.688.49＜0.001第7天1 864.93±60.4494.75±26.4039.24＜0.001第14天1 281.24±53.28102.31±48.1128.67＜0.001第28天413.89±97.1090.51±11.344.520.006

2.3.2 VMC組各時(shí)間血清NT-proBNP濃度比較

采用方差分析顯示，VMC組各時(shí)間血清NT-proBNP濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝260.76，P＜0.05）。

2.4 VMC組血清NT-proBNP的濃度與心肌病理積分間的相關(guān)性線性相關(guān)分析顯示，VMC組小鼠第3、7、14、28天血清NT-proBNP濃度與其心肌組織病理積分間呈顯著正相關(guān)性（r＝0.829，P＜0.05）。

3 討論

Balb／c鼠對(duì)嗜心肌病毒極其敏感，且繁殖快，易飼養(yǎng)，因而成為國(guó)內(nèi)外研究VMC首選的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。本研究以4周齡、雄性Balb／c小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)腹腔注射0.1 ml CVB3來(lái)建立VMC模型。VMC組小鼠于接種CVB3后第3天開(kāi)始有出現(xiàn)少動(dòng)、少食、精神萎靡等癥狀，第4天開(kāi)始有小鼠死亡，第7～10天死亡7只，為死亡高峰，占全部死亡小鼠的63.63%，并且VMC組小鼠心肌組織病理證實(shí)有不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)伴鄰近心肌細(xì)胞的變性或壞死，表明本實(shí)驗(yàn)中VMC模型構(gòu)建成功，為進(jìn)一步分析NT-proBNP水平與VMC之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

BNP是目前最常被用到的利鈉肽家族的核心成員，具有利尿、利鈉、舒張血管、抑制交感神經(jīng)、拮抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)等生物學(xué)活性。NT-proBNP無(wú)生物活性，但半衰期是BNP的3～6倍，且穩(wěn)定性好。NT-proBNP以此優(yōu)勢(shì)而應(yīng)用于臨床。

Narin et al［6］研究有擴(kuò)張性心肌病病史的心臟衰竭患者的心臟超聲，并檢測(cè)其血清NT-proBNP，發(fā)現(xiàn)NT-proBNP比傳統(tǒng)超聲心動(dòng)圖的各種參考指數(shù)更敏感有效，并且NT-proBNP是曾有心肌炎病史患兒持續(xù)存在心功能不全的良好標(biāo)志物［3］。目前，研究［7］已證實(shí)丙型肝炎病毒也是VMC的致病原，對(duì)于慢性丙型肝炎病毒感染患者，通過(guò)檢測(cè)NT-proBNP可以判斷患者是否出現(xiàn)心功能不全。本研究通過(guò)建立VMC小鼠模型來(lái)探討疾病發(fā)展過(guò)程與血清NT-proBNP水平之間的關(guān)系，結(jié)果顯示不同時(shí)期VMC組小鼠血清NT-proBNP水平均明顯高于對(duì)照組。VMC小鼠在病毒感染早期（第3天），心肌組織輕度病變，但血清NT-proBNP水平與對(duì)照組相比已有明顯升高；隨著疾病的進(jìn)展，第7天心肌組織病理改變達(dá)到最明顯時(shí)，NT-proBNP水平也達(dá)到最高；其后，炎癥逐漸消散，NT-proBNP也隨之降低，但仍高于正常值。VMC組不同時(shí)間的NT-proBNP水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在心肌組織病變?cè)缙冢拗魃形葱纬擅黠@的免疫應(yīng)答，病毒大量復(fù)制，這不僅可直接損傷被感染心肌細(xì)胞，還可通過(guò)腸道病毒蛋白酶2A的超表達(dá)來(lái)清除抗肌萎縮蛋白，導(dǎo)致心肌細(xì)胞骨架與外部基底膜分離，從而破壞心肌細(xì)胞的完整性，進(jìn)一步導(dǎo)致心肌細(xì)胞收縮力降低、細(xì)胞死亡［8-9］。研究［10-11］表明，此期心肌細(xì)胞的線粒體DNA（mtDNA）缺失率增加，線粒體基因表達(dá)降低，心肌細(xì)胞能量供應(yīng)不足。心臟泵血能力降低，心室內(nèi)血液積聚，牽拉房室壁，刺激心肌細(xì)胞分泌NT-proBNP。隨著疾病的發(fā)展，病毒以及自身免疫對(duì)心肌細(xì)胞的損傷、間質(zhì)水腫、大量炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、一氧化氮及細(xì)胞因子的間接損傷使心肌組織壞死并融合，心肌收縮和松弛嚴(yán)重?fù)p傷，依從性降低，引起心肌收縮和舒張功能明顯障礙，心輸出量降到最低甚至發(fā)生心源性休克［12］。此外，在病變高峰期，參與維持細(xì)胞骨架和新陳代謝的蛋白質(zhì)比例也發(fā)生很大變化［13］。同時(shí)，mtDNA缺失率在此期達(dá)到頂峰，并且mtDNA缺失率與心功能不全的程度相一致［10］。心肌的結(jié)構(gòu)、功能、能量供應(yīng)全部遭到破壞，血液進(jìn)一步積聚，房室壁的牽拉達(dá)到頂峰，從而引起NT-proBNP的大量分泌。同時(shí)這也解釋了小鼠在第7～10天死亡率達(dá)到頂峰的原因?；謴?fù)期炎癥逐漸吸收，壞死灶溶解消散，用增生的成纖維細(xì)胞取代之，心肌間質(zhì)增加。心肌收縮力逐漸恢復(fù)，心室依從性明顯改善。mtDNA缺失率以及參與維持細(xì)胞骨架和新陳代謝的蛋白質(zhì)比例都逐漸恢復(fù)。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子可促進(jìn)血管生成、細(xì)胞分裂增殖分化。在病毒感染后，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)就逐漸增加，第14天達(dá)到高峰，以促進(jìn)心臟修復(fù)［14］。因此，血清中NT-proBNP水平也隨之降低，但仍高于對(duì)照組。而這正好與本研究的另一結(jié)論相一致：VMC組血清NT-proBNP濃度與心肌組織病理積分呈顯著正相關(guān)性。以上闡述表明血清NT-proBNP可作為一種方便快捷、反應(yīng)靈敏的判斷VMC心肌損害嚴(yán)重程度的生化指標(biāo)。

VMC的發(fā)病與機(jī)體的遺傳易感性有關(guān)。對(duì)于易感者，入侵的病毒對(duì)心肌細(xì)胞的直接損傷、炎癥細(xì)胞及各種細(xì)胞因子的間接損傷作用、T淋巴細(xì)胞的溶細(xì)胞作用等對(duì)心肌組織的攻擊更為嚴(yán)重，并且病毒、炎癥介質(zhì)可激活體內(nèi)多種轉(zhuǎn)錄因子使心肌細(xì)胞凋亡［15］。在病變高峰時(shí)心臟結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞，血液泵出大大降低，射血分?jǐn)?shù)銳減，引起心臟衰竭。Sun et al［16］提出NT-proBNP是當(dāng)前診斷心臟衰竭并評(píng)估其預(yù)后的生化標(biāo)志物中的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果顯示，血清NT-proBNP水平可以反映VMC心肌損傷的嚴(yán)重程度，可作為判斷其危險(xiǎn)分層的血清指標(biāo)之一。此外，血清NT-proBNP易于檢測(cè)，可以隨時(shí)掌握疾病的病情變化，進(jìn)而有利于制定下一步的治療方案。

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The changes and significance of serum NT-proBNP levels in mice with viral myocarditis

Xu Yanyan，F(xiàn)an Xiaochen
（Dept of Pediatrics，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the changes and significance of serum N-terminal pro-brain natriuretic peptide（NT-proBNP）levels in mice model with viral myocarditis（VMC）.Methods100 Balb／c mice were randomly divided into VMC group（n＝60）and control group（n＝40）.Mice in VMC group were injected intraperitoneallycoxsackievirus B3（CVB3），while mice in control group were treated with the same amount of virus-free DMEM cultivate liquid.10 mice of each group were sacrificed on 3，7，14，and 28th day after VMC modeling and their blood and heart tissues were collected.The serum NT-proBNP levels in two groups of mice were detected by ELISA.Pathological changes in myocardial tissue were examined with hematoxylin and eosin stain.The relationship between serum NT-proBNP concentration and cardiac pathology score of VMC group at different time points were analyzed.ResultsThe serum NT-proBNP levels of VMC group were significantly higher than that of control group（P＜0.05）.There was a significant statistical difference between NT-proBNP levels of VMC group at different time points（P＜0.05）.The NT-proBNP level was positively correlated with myocardial histopathology scores（r＝0.829，P＜0.05）.ConclusionSerum NT-proBNP levels may reflect severity of myocardial injury in mice with VMC.NT-proBNP can be used as one of serum indicators to judge the risk stratification in mice with VMC.

viral myocarditis；mice；N-terminal pro-brain natriuretic peptide

R 725.4

A

1000-1492（2015）12-1753-05

時(shí)間：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.020.html

2015-09-08接收

安徽省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研課題（編號(hào)：2009ZY36）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，合肥 230022

徐艷艷，女，碩士研究生；

范曉晨，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：xcfan2000＠163.com