非小細(xì)胞肺癌靶向基因研究新進(jìn)展

郭永軍

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 分子病理科 河南 鄭州 450008)

30年來(lái)，我國(guó)肺癌死亡率增長(zhǎng)465%，肺癌在全部因癌癥死亡患者中占22.7%，其中85%是非小細(xì)胞肺癌，肺癌已成為我國(guó)因癌癥死亡患者的第一殺手，嚴(yán)重威脅人民群眾的生命健康。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因改變的檢測(cè)及相應(yīng)靶向藥物的研發(fā)使得肺癌的治療水平得到極大提高?；驒z測(cè)繼以靶向藥物治療標(biāo)志著肺癌進(jìn)入個(gè)體化治療的時(shí)代，大大延長(zhǎng)了肺癌患者的生存期。近年來(lái)基因檢測(cè)日益常規(guī)化，本文以EGFR 和ALK 為例綜述非小細(xì)胞肺癌靶向基因研究的新進(jìn)展及技術(shù)革新對(duì)基因檢測(cè)的改變，以利于相關(guān)臨床醫(yī)師和基礎(chǔ)研究人員了解相關(guān)研究進(jìn)展。

1 EGFR 研究現(xiàn)狀

表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是ErbB 家族成員之一，與配體結(jié)合后，EGFR 同源或異源二聚體聚集，激活PI3K/AKT 和RAS/RAF/MAPK 細(xì)胞信號(hào)通路。在非小細(xì)胞肺癌(non－small cell lung cancer，NSCLC)中，EGFR 突變集中在18 ～21 外顯子，其中19 和21 外顯子突變最為常見(jiàn)，突變可導(dǎo)致受體酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域異?；罨?，引起細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化。NSCLC 中EGFR 突變率在北美和西歐人群中為10%左右，而在東亞人群中為30% ～50%，其中在亞裔、女性、非吸煙、腺癌患者中EGFR 突變率甚至高達(dá)70% ～80%［1］。表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR－TKIs)廣泛用于治療晚期NSCLC，其療效已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可。

2005年吉非替尼(易瑞沙)進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)，10年來(lái)在政府和公司的大力推動(dòng)下，EGFR 突變檢測(cè)逐漸普及，到2014年我國(guó)已有超過(guò)100 家醫(yī)院建立EGFR 突變的院內(nèi)檢測(cè)平臺(tái)，為肺癌個(gè)體化治療和臨床研究提供了保障。在此背景之下，EGFR 的研究開(kāi)始走向更多功能的研究和更靈敏檢測(cè)方法的研發(fā)。

1.1 EGFR 在腫瘤異質(zhì)性中研究 許多研究者提出了原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶EGFR 突變異質(zhì)性的假設(shè)，并進(jìn)行了多項(xiàng)研究［2］。Gow 等［3］研究67 例NSCLC 患者的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶EGFR 的突變情況發(fā)現(xiàn)，原發(fā)灶EGFR 突變呈陽(yáng)性的患者中有50%(9/18)在轉(zhuǎn)移灶中突變丟失，轉(zhuǎn)移灶EGFR 突變呈陽(yáng)性的患者中有65%(17/26)在原發(fā)灶是陰性的。利用擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該樣本EGFR 異質(zhì)性達(dá)到27%(18/67)。我們團(tuán)隊(duì)用EGFR 定量的方法檢測(cè)原發(fā)與轉(zhuǎn)移灶之間的突變發(fā)生率的關(guān)系，50 例NSCLC 患者中相符率為84%，16%患者在原發(fā)灶中檢測(cè)到10%以上的EGFR 突變，而在轉(zhuǎn)移灶中并未檢測(cè)到［4］。利用EGFR 突變狀態(tài)研究腫瘤異質(zhì)性，其結(jié)果表明腫瘤狀態(tài)是繁雜而充滿(mǎn)變化的，這令我們對(duì)單次檢測(cè)EGFR 狀態(tài)而指導(dǎo)臨床靶向用藥的合理性提出質(zhì)疑。

1.2 EGFR T790M 突變研究 目前存在爭(zhēng)議的是T790M 突變是原發(fā)的，還是EGFR－TKIs 治療后新出現(xiàn)的。大多數(shù)研究是在EGFR－TKIs 出現(xiàn)耐藥的患者中發(fā)現(xiàn)T790M 突變，認(rèn)為T(mén)790M 突變是EGFR－TKIs 治療導(dǎo)致的［5］，但后來(lái)在未經(jīng)任何治療的患者標(biāo)本中也發(fā)現(xiàn)T790M 突變。因此，有學(xué)者提出T790M 突變?cè)l(fā)存在，由于這些細(xì)胞抵抗EGFR－TKIs，治療后以?xún)?yōu)勢(shì)細(xì)胞群體顯現(xiàn)出來(lái)［6］。此外，在耐藥患者樣本中還相繼發(fā)現(xiàn)了D761Y、L747S、T854A 等突變［7－9］，這些突變均可能參與耐藥，被稱(chēng)為“非T790M 繼發(fā)突變”。

1.3 EGFR 突變亞型研究 EGFR 中最常見(jiàn)改變是19外顯子缺失及21 外顯子L858R 突變。我們研究發(fā)現(xiàn)，19外顯子缺失相對(duì)21 外顯子突變?cè)谂曰颊咧型蛔兟矢撸?0］。Li 等［11］研究顯示，21 外顯子突變的肺癌惡性程度可能更高，19 外顯子缺失以左肺居多，而21 外顯子突變多發(fā)生在右肺。但是國(guó)內(nèi)其他研究卻顯示，19 外顯子缺失以右肺原發(fā)更常見(jiàn)［12］。目前，是否可將二者區(qū)別對(duì)待仍存在爭(zhēng)論。Riely 等［13］通過(guò)對(duì)34 例肺癌患者應(yīng)用EGFR－TKIs 治療發(fā)現(xiàn)，21 外顯子突變患者無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間(progression－free survival，PFS)及總生存期(overall survival，OS)明顯低于19 外顯子突變患者。Mitsudomi等［14］報(bào)道，相比其他EGFR 突變類(lèi)型肺癌患者而言，EGFR19 外顯子缺失肺癌患者對(duì)吉非替尼的反應(yīng)率更高。Zhu 等［15］從細(xì)胞水平分析了EGFR19 外顯子缺失突變和21 外顯子點(diǎn)突變對(duì)吉非替尼反應(yīng)性不同的原因，發(fā)現(xiàn)吉非替尼均能導(dǎo)致EGFR19 外顯子缺失突變和EGFR21 外顯子點(diǎn)突變的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞EGFR、Akt 和Erk 分子磷酸化受到抑制，但對(duì)前者的抑制較后者更明顯。而與21 外顯子點(diǎn)突變的細(xì)胞比較，吉非替尼能導(dǎo)致更多的19 外顯子缺失的細(xì)胞G1 期阻滯。

1.4 基于EGFR 狀態(tài)的靶向聯(lián)合化療臨床研究 EGFRTKIs 在EGFR 基因突變的晚期NSCLC 患者一線(xiàn)、二線(xiàn)、維持治療等領(lǐng)域中都不遜色于傳統(tǒng)化療，靶向治療的應(yīng)用不僅僅局限于單純靶向治療，還拓展至靶向聯(lián)合化療。

日本一項(xiàng)關(guān)于NSCLC 患者吉非替尼術(shù)后輔助化療的回顧性研究結(jié)果顯示，EGFR 基因突變患者比野生型患者的中位OS 顯著延長(zhǎng)(930 d vs 210 d，P ＜0.01)。但是回顧性研究并不能成為可靠證據(jù)，仍需更多前瞻性研究予以證實(shí)。2013年ASCO 上一項(xiàng)中國(guó)啟動(dòng)的Ⅱ期隨機(jī)臨床試驗(yàn)表明，針對(duì)EGFR 突變型的術(shù)后ⅢA 期NSCLC 患者，以EGFR基因狀態(tài)為前提，進(jìn)行帶或不帶吉非替尼的培美曲塞聯(lián)合卡鉑輔助治療，盡管靶向治療組的OS 絕對(duì)值延長(zhǎng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

我國(guó)NCT01410214 和NCT01683175 兩項(xiàng)臨床研究均為厄洛替尼輔以長(zhǎng)春瑞濱聯(lián)合順鉑治療ⅢA 期NSCLC 切除術(shù)后EGFR 基因19 外顯子或21 外顯子突變患者，以2年DFS作為主要研究終點(diǎn)。廣東臨床試驗(yàn)協(xié)會(huì)NCT01405079 項(xiàng)目是2011年啟動(dòng)的一項(xiàng)為期8年的Ⅲ期臨床試驗(yàn)，以吉非替尼聯(lián)合長(zhǎng)春瑞濱或順鉑治療EGFR 基因發(fā)生突變的Ⅱ～ⅢA(N1 ～N2)期NSCLC 者。

目前支持早期NSCLC 術(shù)后輔助EGFR－TKIs 治療能有效延長(zhǎng)DFS 和OS 的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)并不充分，在EGFR基因突變狀態(tài)的基礎(chǔ)上，需要更多的前瞻性、多中心、隨機(jī)、與標(biāo)準(zhǔn)化療方案對(duì)照的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。

1.5 EGFR 新技術(shù)檢測(cè) 隨著數(shù)字PCR(Digital PCR)技術(shù)的日益成熟，由于其靈敏度較高，研究者將目光逐漸轉(zhuǎn)向血循環(huán)中的微量基因的檢測(cè)。Zhang 等［16］比較了ARMS－qPCR 方法和數(shù)字PCR 的檢測(cè)靈敏度。ARMS－qPCR 方法檢測(cè)到1% ～5%的突變頻率，而數(shù)字PCR 則可以檢測(cè)到低至0.1% 的突變，同時(shí)還檢測(cè)出1 例經(jīng)ARMS－qPCR 方法未檢出的T790M 突變(7/6 000)，顯示出數(shù)字PCR 在檢測(cè)稀有突變中的優(yōu)勢(shì)。數(shù)字PCR 甚至可以將靈敏度提升到0.04%［17］。由于血液檢測(cè)屬于無(wú)創(chuàng)、動(dòng)態(tài)檢測(cè)，對(duì)于術(shù)后及難以取到樣本的患者而言將具有很大的臨床使用價(jià)值，該技術(shù)在經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)驗(yàn)證之后將有可能在未來(lái)逐漸應(yīng)用用于臨床檢測(cè)。

2 ALK 融合基因研究現(xiàn)狀

間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)基因是胰島素受體超家族的成員，20年前首次以NPM－ALK 融合基因的形式在間變性大細(xì)胞淋巴瘤中被發(fā)現(xiàn)［18］，2007年Soda 等［19］在75 例NSCLC 患者中發(fā)現(xiàn)5例攜帶棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣4(echinoderm microtubule－associated protein－like 4，EML4)ALK 融合突變基因，并且發(fā)現(xiàn)EML4－ALK 融合基因有致瘤性。EML4 與ALK 基因都位于2 號(hào)染色體短臂上，由于其中1 個(gè)基因倒置而產(chǎn)生EML4－ALK 融合基因。相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)，EML4－ALK 可通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶－分裂原活化蛋白激酶－細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶、磷脂酰肌醇3－激酶－蛋白激酶B 和ras 信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子－3 信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、抗凋亡［20］。ALK 是NSCLC 的關(guān)鍵啟動(dòng)癌基因，雖然只有5%的NSCLC 患者出現(xiàn)ALK 基因融合［21］，但由于具有明確的分子靶點(diǎn)，確診ALK 基因融合將會(huì)使患者從靶向藥物治療中獲益［22］。

2.1 ALK 基因融合檢測(cè)技術(shù) 目前熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)是美國(guó)FDA 唯一批準(zhǔn)的檢測(cè)ALK 基因融合的方法［23］，是檢測(cè)EML4－ALK融合基因的金標(biāo)準(zhǔn)。免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)是一種經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的診斷方法，其敏感性低于FISH 法，可用作FISH 法前對(duì)EML4－ALK 融合基因的預(yù)篩查。研究表明，使用單克隆抗體能提高IHC 法檢測(cè)的敏感性和特異性［24］。Fukuyoshi 等［25］利用RT－PCR 分別檢測(cè)了104 例肺癌，僅1 例肺癌標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了EML4－ALK 的mRNA，顯示PCR 方法檢測(cè)ALK 融合基因仍需優(yōu)化。高通量測(cè)序的確可以發(fā)現(xiàn)未知的融合類(lèi)型，但是目前測(cè)序成本太昂貴，令其不太適合在臨床上應(yīng)用。2014年Zheng 等［26］使用新型錨定多重PCR(anchored multiplex PCR)，通過(guò)引物設(shè)計(jì)和高通量測(cè)序?qū)?86 例患者石蠟樣本進(jìn)行檢測(cè)，在不同腫瘤中發(fā)現(xiàn)了9 種新的融合基因，展現(xiàn)出其檢測(cè)未知融合基因的強(qiáng)大能力。

2.2 ALK 耐藥研究 克唑替尼治療ALK 陽(yáng)性的NSCLC患者常常在1 a 內(nèi)出現(xiàn)藥物抵抗，并發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移，可能與克唑替尼在腦脊液中的濃度遠(yuǎn)低于血漿有關(guān)［27］。關(guān)于耐藥機(jī)制研究，體外實(shí)驗(yàn)顯示不同ALK 融合類(lèi)型對(duì)藥物的敏感性不同，顯示可能存在不同原發(fā)融合類(lèi)型導(dǎo)致耐藥的出現(xiàn)［28］。但是臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻不支持這一觀(guān)點(diǎn)［29］。耐藥機(jī)制可能涉及到基因突變和基因擴(kuò)增，其中突變代表是L1196M 突變，類(lèi)似于T790M 突變，L1196M 突變導(dǎo)致構(gòu)象變化、激酶活性增加，繼而導(dǎo)致耐藥。其他耐藥突變還有G1269A、C1156Y、L1152R、G1202R、S1206Y、1151Tins、F1174C、D1203N［30］。

2.3 新藥開(kāi)發(fā) 針對(duì)克唑替尼的耐藥現(xiàn)象，制藥企業(yè)也在加快新藥的研發(fā)。FDA 2011年快速批準(zhǔn)克唑替尼上市，2014年又批準(zhǔn)了第2 代靶向藥物色瑞替尼(Ceritinib)用于克唑替尼不耐受的ALK 陽(yáng)性患者［31］。目前，針對(duì)ALK－L1196M 和EGFR－T790M 雙突變的口服TKI AP26113［32］和 針 對(duì)ALK－L1196M 及C1156Y 突 變 的CH5424802［33］均在臨床實(shí)驗(yàn)中。另一類(lèi)新藥是HSP90 抑制劑，作為分子伴侶抑制劑，通過(guò)穩(wěn)定和調(diào)節(jié)ALK 蛋白，加快其蛋白降解從而達(dá)到治療效果［34］。目前HSP90 抑制劑類(lèi)新藥如Ganetespib［35］、Onalespib［36］、IPI－504［37］等均處于研發(fā)中。

3 結(jié)語(yǔ)

我國(guó)正處于社會(huì)高速發(fā)展階段，老齡化進(jìn)程、空氣污染、環(huán)境污染、社會(huì)壓力、吸煙習(xí)慣等導(dǎo)致肺癌高發(fā)，這已經(jīng)成為非常嚴(yán)峻的社會(huì)問(wèn)題。從全國(guó)來(lái)看，基因檢測(cè)率只有27%，與日本、韓國(guó)以及香港、臺(tái)灣地區(qū)超過(guò)80%的檢測(cè)率差距較大，我國(guó)基因檢測(cè)普及亟待進(jìn)一步加強(qiáng)。我國(guó)與國(guó)外相比在基因基礎(chǔ)研究方面仍存在不小差距;在臨床研究方面基本處于國(guó)際先進(jìn)水平，但仍需研究成果來(lái)奠定國(guó)際地位;在新藥研發(fā)方面與國(guó)外相比顯示出巨大差距，我國(guó)新藥研發(fā)將任重道遠(yuǎn)。最后應(yīng)該關(guān)注新技術(shù)在基因檢測(cè)領(lǐng)域帶來(lái)的變化，高通量測(cè)序、液體活檢、大數(shù)據(jù)分析、數(shù)字PCR 等新技術(shù)新理念可能在未來(lái)給該領(lǐng)域帶來(lái)革命式的改變。

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