K652 重組表達(dá)IL-6 基因?qū)K 細(xì)胞表型和功能的影響①

李登瑞 楊永輝 李 輝 郭素敏 朱桂云 李秀武 耿書軍 趙榮娣 任雪飛 高 莉 辛 欣

(河北省胸科醫(yī)院，河北省肺癌防治中心，石家莊 050041)

現(xiàn)在腫瘤對(duì)人類生存健康的威脅越來越嚴(yán)重，對(duì)腫瘤的治療方法也發(fā)生著越來越多的變化，各種各樣的腫瘤治療已經(jīng)顯現(xiàn)出來，成為治療腫瘤的重要發(fā)展方向。繼腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)、淋巴因子激活殺傷細(xì)胞(LAK)及CD3 單抗激活的殺傷細(xì)胞(CD3AK)后，自然殺傷細(xì)胞(Nature killer，NK)的殺瘤作用日益顯現(xiàn)出來［1，2］。NK 細(xì)胞是將人外周血、臍帶血或骨髓的單個(gè)核細(xì)胞在體外多種細(xì)胞因子(干擾素、白介素等)作用下培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的一群細(xì)胞。NK 細(xì)胞的過繼治療在抗病毒、抗腫瘤的治療中有著廣泛的應(yīng)用前景，在造血干細(xì)胞移植后減少移植物抗宿主反應(yīng)中的作用也倍受關(guān)注［2］。由于NK 細(xì)胞在外周血中所占的比例很少，建立一種有效的NK 細(xì)胞體外擴(kuò)增系統(tǒng)是深入研究NK 細(xì)胞功能與探討NK 細(xì)胞免疫治療的基礎(chǔ)。體外獲取人NK 細(xì)胞主要有兩種途徑:一是采用抗NK細(xì)胞特異性抗體與磁珠交聯(lián)的方法，從PBMC 中分離人NK 細(xì)胞;二是采用刺激擴(kuò)增培養(yǎng)的方法，從PBMC 中擴(kuò)增培養(yǎng)人NK 細(xì)胞［3］。與其他過繼性免疫治療細(xì)胞相比，NK 還具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣、副作用小、對(duì)正常骨髓造血影響輕微等優(yōu)點(diǎn)。因此，NK 細(xì)胞的應(yīng)用被認(rèn)為是新一代腫瘤過繼免疫治療的首選方法。

NK 細(xì)胞體外大量擴(kuò)增并且獲得強(qiáng)大的細(xì)胞毒活性與多種細(xì)胞因子的作用有著密切關(guān)系，這些細(xì)胞因 子 包 括IL-1、IL-2、IL-7、IL-12、IFN-γ 以 及CD3McAb 等［4，5］。通過體外的刺激培養(yǎng)可進(jìn)行相對(duì)大規(guī)模的NK 細(xì)胞制備，使臨床應(yīng)用成為可能。但是迄今為止多數(shù)的體外刺激擴(kuò)增培養(yǎng)也只能使NK 細(xì)胞在體外擴(kuò)增數(shù)十到百倍，且純度也不理想。在本文研究中，我們采用基因工程方法，在K562 細(xì)胞上表達(dá)IL-6 基因，構(gòu)建特定的K562 工程細(xì)胞作為刺激細(xì)胞。IL-6 基因與一段特殊的跨膜蛋白基因融合，使IL-6 蛋白在K562 細(xì)胞中表達(dá)后錨定于細(xì)胞膜表面。其次，以γ 射線照射致死的K562 工程細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，以人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)為擴(kuò)增培養(yǎng)對(duì)象，通過與IL-6 的共刺激作用，使NK 細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下得到大量的擴(kuò)增。用4 h51Cr 釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NK 細(xì)胞對(duì)K562 細(xì)胞殺傷水平的影響。用NK 細(xì)胞作用K562 細(xì)胞的毒活性進(jìn)行功能分析。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 臍帶血來源于白求恩國(guó)際和平醫(yī)院，K562 細(xì)胞來自河北省腫瘤醫(yī)院科研中心。RPMI1640 培養(yǎng)基、0.25%胰酶為美國(guó)Gibco 公司產(chǎn)品，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自德國(guó)GE 公司。流式細(xì)胞熒光標(biāo)記抗體、IL-2、IL-15、IL-6 購(gòu)自美國(guó)PeproTech 公司。流式細(xì)胞儀為美國(guó)BECKMAN-COULTER 公司。CO2培養(yǎng)箱為美國(guó)Thermo 公司。

1.2 表達(dá)IL-6 的重組K562 細(xì)胞的構(gòu)建 采用RT-PCR 方法分別從人單核細(xì)胞(PBMC)中擴(kuò)增IL-6 cDNA，測(cè)序正確后，IL-6 基因克隆至CD8 信號(hào)肽的下游。重組的IL-6 亞克隆至含有不同篩選標(biāo)記的真核表達(dá)載體，先后脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染K562 細(xì)胞后，篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆，構(gòu)建K562 工程細(xì)胞株。K562 細(xì)胞與PBMC 共培養(yǎng)前，用γ 射線照射致死。

1.3 NK 細(xì)胞的誘導(dǎo) 將12 份(每組4 份)人外周血分離出單核細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，同時(shí)加入IL-2和IL-15 到培養(yǎng)袋中進(jìn)行培養(yǎng)，標(biāo)號(hào)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。第1 組為實(shí)驗(yàn)組，加入IL-2 和IL-15，再另加射線滅活的同等數(shù)量的重組K562 細(xì)胞，第6 天起每隔3 d 對(duì)孔中的液體半換液，同時(shí)設(shè)以下兩個(gè)平行對(duì)照組:第2 組加入IL-2 和IL-15，再加入IL-6 作用組;第3 組為空白對(duì)照組，加入IL-2 和IL-15。然后加入RPMI1640 培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)擴(kuò)增，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)并根據(jù)情況進(jìn)行擴(kuò)增。

1.4 免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)分析(FCM)NK細(xì)胞表型 培養(yǎng)21 d 后收集細(xì)胞因子刺激的PBMC細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)，為1 ×107ml-1，加入細(xì)胞懸液50 μl(用DPBS 稀釋)滅活正常兔血清，室溫作用10 min。加入CD(16 +56)-PE 和CD3-FITC 進(jìn)行膜表面雙色熒光標(biāo)記，對(duì)照組加入PE IgG1 和FITC IgG1，作用30 min。用洗滌液洗滌2 次。加適量固定液，用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞分類分析，確定CD56+CD16+CD3-細(xì)胞的比例。

1.551Cr 釋放實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)細(xì)胞毒活性 效應(yīng)細(xì)胞為人白血病細(xì)胞株K562。將K562 細(xì)胞懸液置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2.0 × 106ml-1，加入51Cr 3.7 MBq，37℃孵育1.5 h，中間每隔15 min 晃動(dòng)1次。標(biāo)記完畢后洗滌3 次，調(diào)整靶細(xì)胞數(shù)至1.0 ×105ml-1，加入96 孔U 型板，100 μl/ 孔。收集細(xì)胞因子刺激的PBMC，按照不同的效靶比加入含有預(yù)先標(biāo)記K562 細(xì)胞的96 孔U 型板中，37℃孵育4 h，380 r/min 離心5 min，收集上清液每孔100 μl，用 計(jì)數(shù)儀測(cè)定CPM 值，按以下公式如下:

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建重組K562D3 細(xì)胞 ABCDE 五組實(shí)驗(yàn)，第D 組第3 批次重組的K562 細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)IL-6，我們將其命名為K562D3 細(xì)胞，我們以后做的所有實(shí)驗(yàn)都用這一批次的重組細(xì)胞，以區(qū)別于靶細(xì)胞K562。成功構(gòu)建了表達(dá)IL-6 的重組K562D3 細(xì)胞。射線照射后的K562 細(xì)胞經(jīng)過連續(xù)2 周的培養(yǎng)，存活細(xì)胞消失。照射后的重組K562 細(xì)胞在3～7 d 內(nèi)依然具有完整的細(xì)胞形態(tài)，與PBMC 混合后，照射過的重組K562 細(xì)胞在第7 天后破碎并被逐漸吞噬干凈。

2.2 NK 細(xì)胞的增長(zhǎng)曲線 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)NK 細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)3 組NK 細(xì)胞均在培養(yǎng)第3 天開始增殖，培養(yǎng)第14 天進(jìn)入快速增長(zhǎng)期，到20 d 增殖速度達(dá)到最快。20 d 以后進(jìn)入平臺(tái)期。3 組細(xì)胞懸液中都加入IL-2 和IL-15，第1 組為加射線滅活的同等數(shù)量的重組K562 細(xì)胞:第2 組為加入IL-6 作用組;第3 組為空白對(duì)照組。3 組間的NK 細(xì)胞增殖存在著不同。實(shí)驗(yàn)組第1 組NK 細(xì)胞生長(zhǎng)得快，而且細(xì)胞數(shù)量多，對(duì)照組第1 組、第2 組的NK 細(xì)胞生長(zhǎng)不如第1 組NK 細(xì)胞生長(zhǎng)得快和數(shù)量多。每組4 份細(xì)胞，到23 d 時(shí)，第1 組CD56+CD16+CD3-細(xì)胞數(shù)量比單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增了(760 ±18)倍。第2 組CD56+CD16+CD3-細(xì)胞數(shù)量比單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增了(216 ±5)倍。第3 組CD56+CD16+CD3-細(xì)胞數(shù)量比單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增了(23 ±1)倍。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異顯著，P＜0.05。結(jié)果見圖1。

2.3 擴(kuò)增的NK 細(xì)胞表面標(biāo)記分析 對(duì)第3 組重組的K562工程細(xì)胞刺激擴(kuò)增的NK細(xì)胞進(jìn)行純度檢測(cè)，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分子表面標(biāo)記物CD56、CD16、CD3 分析。結(jié)果證實(shí)，經(jīng)過23 d 的刺激培養(yǎng)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)到PBMC 細(xì)胞表面標(biāo)記物CD56+CD3-的純度增多;擴(kuò)增前是6% ±0.4%，擴(kuò)增后是91% ±2%(圖2)。

圖1 NK 細(xì)胞的增殖曲線Fig.1 Curve of cell proliferation of NK cell

2.4 不同條件下誘導(dǎo)的NK 細(xì)胞對(duì)K562 腫瘤細(xì)胞的殺傷率 由表1 可見，在相同效靶比下誘導(dǎo)的NK細(xì)胞殺傷率1 組明顯最大，說明1 組NK 細(xì)胞對(duì)K562 的殺傷作用最強(qiáng)。2、3 組次之。而在相同條件下誘導(dǎo)的NK 細(xì)胞，其在效靶比為20∶1 時(shí)，對(duì)K562 細(xì)胞的殺傷率均明顯高于10∶1。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異顯著，P＜0.05。

3 討論

NK 細(xì)胞是先天免疫中一類重要的細(xì)胞，通過細(xì)胞毒作用和分泌細(xì)胞因子參與機(jī)體抗感染和抗腫瘤免疫［6，7］。因其作用不需初次免疫活化，因而在過繼免疫治療上有其獨(dú)特的應(yīng)用前景。由于不能獲得數(shù)量大、純度高的人NK 細(xì)胞，使NK 細(xì)胞在免疫治療中的應(yīng)用受到了限制。采用體外擴(kuò)增的方法獲得足夠數(shù)量和較高純度的人NK 細(xì)胞，是近年來研究NK 細(xì)胞功能特別是探討過繼免疫治療的一個(gè)重要基礎(chǔ)平臺(tái)。尤其是對(duì)手術(shù)后或者放、化療后患者效果顯著，能消除殘留的轉(zhuǎn)移病灶，防止癌細(xì)胞的擴(kuò)散，提高機(jī)體自身的免疫力［8］。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK 細(xì)胞表型Fig.2 Immunophenotypic analysis of NK cell surface markers was performed by flow cytometry

表1 不同條件誘導(dǎo)的NK 細(xì)胞對(duì)K562 腫瘤細(xì)胞的殺傷率Tab.1 Cytotoxicity of NK cells to K562 cells cultured in different conditions

人正常的外周血中含有極少量的NK 細(xì)胞，PBMC 在體外經(jīng)過多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)后獲得大量的NK 細(xì)胞。這些細(xì)胞因子包括IL-2、IL-15、單克隆抗體等［9］。上述這些擴(kuò)增方法獲得的NK 細(xì)胞似乎還不能滿足過繼免疫治療的需要，NK 細(xì)胞的增殖、活化、殺傷及分泌等功能，僅僅靠可溶性細(xì)胞因子的刺激還很難使NK 細(xì)胞得到大量的擴(kuò)增。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在擴(kuò)增的方法上進(jìn)行了各種的探索，如采用磁株分選的方法先從人PBMC 中分離NK 細(xì)胞，獲得的NK細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下，用可溶性IL-2、IL-12、IL-15等細(xì)胞因子共同刺激，能使NK 細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)十倍［10，11］。除了細(xì)胞因子外，K562、HFWT 等腫瘤細(xì)胞也能夠刺激NK 細(xì)胞的擴(kuò)增，采用照射致死的K562 細(xì)胞或HFWT 細(xì)胞與PBMC 共培養(yǎng)，也能使PBMC 中的NK 細(xì)胞得到一定的擴(kuò)增［12，13］。IL-6 的生物學(xué)活性:①刺激細(xì)胞生長(zhǎng):IL-6 可促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖，如B 淋巴細(xì)胞雜交瘤、漿細(xì)胞瘤、EBV 轉(zhuǎn)化的B 細(xì)胞、T 細(xì)胞、PMA 和IL-4 刺激的胸腺細(xì)胞、造血干細(xì)胞、角朊細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞。②促進(jìn)細(xì)胞分化:如B 細(xì)胞分化和Ig 的分泌，CTL 分化，協(xié)同IL-2 增強(qiáng)CTL 中穿孔素基因的表達(dá)，并增加T 細(xì)胞IL-2 產(chǎn)生和IL-2R 表達(dá)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和NK 細(xì)胞分化。協(xié)同IL-3 促進(jìn)干細(xì)胞分化和巨核細(xì)胞的成熟，明顯促進(jìn)小鼠骨髓移植后免疫功能的重建。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往結(jié)果相比［12，14］，在數(shù)量上，沒有將多個(gè)細(xì)胞因子如IL-15、IL-18 和4-1BBL 三種基因共同表達(dá)，只表達(dá)一種IL-6 基因的重組K562，得到NK 細(xì)胞的數(shù)量多、純度高和活性強(qiáng)，這是一個(gè)突破。本研究在以膜蛋白形式表達(dá)非可溶形式的IL-6 的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了表達(dá)IL-6 的重組K562 細(xì)胞，結(jié)果表明用重組的K562 擴(kuò)增的NK 細(xì)胞，其細(xì)胞毒活性比IL-6 單獨(dú)擴(kuò)增的NK 細(xì)胞提高了約10%，擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)到了760 倍。本擴(kuò)增方法獲得NK 細(xì)胞95%殺傷率和91%純度高，操作簡(jiǎn)單，只是表達(dá)了一種非可溶性基因，也可以達(dá)到很高的擴(kuò)增和純度。

本研究為CIK 細(xì)胞進(jìn)一步應(yīng)用于臨床腫瘤治療奠定了基礎(chǔ)，其有關(guān)作用機(jī)理還需要進(jìn)一步探索。

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