丹參酮增強化療藥物拮抗黑色素瘤效果的研究

于 泳 張林林 秦治剛 武月婷 謝鳳洋 楊 煜 (吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，長春 130021)

上世紀的環(huán)境污染導(dǎo)致的臭氧層變薄，使過多對人類有害的紫外線到達地面。人類發(fā)生皮膚癌的概率大大增加。目前治療皮膚癌的主要手段是手術(shù)切除，加上化療藥物的使用。化療藥物的副作用之一是導(dǎo)致機體免疫功能下降，容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)。如何有效治療皮膚癌并防止復(fù)發(fā)是治療中需要著重考慮的問題。如何在進行抗腫瘤治療的同時，保護機體的免疫功能，產(chǎn)生事半功倍的效果，是目前腫瘤治療研究的熱點問題。近年來，中藥制劑在抗腫瘤中的應(yīng)用備受關(guān)注。丹參酮是一種從丹參中分離出來的菲醌類衍生物，有研究提示，丹參酮能夠在體內(nèi)外誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡［1，2］，并且能夠改善免疫功能。為此，本文利用丹參酮和卡鉑聯(lián)合用藥擬探討丹參酮對抗腫瘤藥物的促進作用，為臨床應(yīng)用中藥制劑進行抗腫瘤治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑 丹參酮、卡鉑購自上海寶曼科技有限公司;B16 黑色素瘤細胞株購于中科院上海細胞所;RPMI1640 購自美國Gibco 公司;胎牛血清購自杭州四季青生物材料有限公司。動物實驗為SPF級C57BL/6N 小鼠40 只雌雄各半，體重18～22 g，購自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。

1.2 B16 細胞株 培養(yǎng)于含10%的胎牛血清、青霉素0.06 g/L、鏈霉素0.13 g/L 的RPMI1640 培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，成貼壁生長，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 腫瘤模型的建立 取體外培養(yǎng)對數(shù)生長的B16 黑色素瘤細胞配置成濃度為5 ×106ml-1的單細胞懸液。32 只(雌雄各半)C57BL/6N 小鼠，從小鼠右下肢外側(cè)注入0.2 ml 細胞懸液即每只小鼠皮下注入106/只單細胞懸液后隨機分為4 組即:模型組、丹參酮組、卡鉑組、丹參酮+卡鉑組，每組8 只小鼠，另外設(shè)置8 只正常小鼠為空白組。次日起32 只小鼠每只每日用藥，模型組0.2 ml 生理鹽水腹腔注射、丹參酮組0.5 g/kg 丹參酮灌胃、卡鉑組0.5 g 卡鉑腹腔注射(連續(xù)給藥4 d，停藥4 d，再繼續(xù)給藥4 d，停藥4 d，該給藥方式一直持續(xù)至殺死動物)、丹參酮+卡鉑組0.5 g/kg 丹參酮灌胃加0.5 g 卡鉑腹腔注射(卡鉑給藥同卡鉑組小鼠)、空白組不做任何處理。每兩天測量小鼠體重;種植細胞處每日觀察，記錄瘤體的大小。第21 日稱體重，眼球取血，脫臼處死小鼠，分離右下肢外側(cè)瘤體。

1.4 組織學(xué)觀察 將分離取出的瘤體稱重，計算腫瘤體積(計算公式為V=ab2/2，a 為腫瘤長徑，b 為腫瘤短徑)，瘤體-80℃保存。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0 專業(yè)軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)值均采用± s。P＜0.05 被認為數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠皮下種植瘤質(zhì)量與體積變化 各組小鼠皮下種植瘤質(zhì)量與體積變化，注射藥物21 d 后處死小鼠，模型組的種植瘤成瘤率、瘤體質(zhì)量、瘤體體積全部明顯高于丹參酮組、卡鉑組、丹參酮和卡鉑聯(lián)合用藥組。其中丹參酮和卡鉑聯(lián)合用藥組的成瘤率、瘤體質(zhì)量、瘤體體積明顯低于丹參酮組、卡鉑組，P＜0.05。各組小鼠成瘤率、瘤體體積的比較見表1。

2.2 丹參酮和卡鉑聯(lián)合應(yīng)用對腫瘤的抑制作用 從表1、圖1、2 可見，單純應(yīng)用卡鉑或丹參酮對腫瘤具有抑制作用。丹參酮和卡鉑聯(lián)合用藥抑制腫瘤效應(yīng)明顯加強，腫瘤生長速度明顯緩慢于其他組，腫瘤質(zhì)量也低于其他組，如圖2 顯示。聯(lián)合用藥腫瘤潛伏期亦比其他組顯著延長，具體的各組腫瘤潛伏期的比較見圖3。

表1 各組小鼠成瘤率，瘤體質(zhì)量和瘤體體積比較Tab.1 Comparison of tumor formation rate，tumor weight，tumor volume in mice from different groups

2.3 丹參酮和卡鉑聯(lián)合用藥對小鼠體重的影響 從圖4 可見，丹參酮和卡鉑聯(lián)合用藥小鼠體重的增長顯著快于單一用丹參酮或卡鉑小鼠的體重增長。單一應(yīng)用丹參酮和卡鉑的小鼠體重增長速度顯著快于模型組小鼠，模型組小鼠的體重增長較緩慢。模型組體重體明顯低于其他治療組小鼠體重(P＜0.05)，各組小鼠的平均體重增長情況比較，見圖5。

圖1 各組小鼠種植瘤平均體積比較Fig.1 Comparison of tumor volume in mice from different groups

圖2 各組小鼠種植瘤平均質(zhì)量比較Fig.2 Comparison of tumor weight in mice from different groups

圖3 各組小鼠種植瘤平均潛伏期比較Fig.3 Comparison of tumor latency in mice from different groups

圖4 各組腫瘤照片F(xiàn)ig.4 Tumor size comparison among different groups

圖5 各組小鼠體重增長趨勢比較Fig.5 Comparison of body weight growth of mice among different groups

3 討論

惡性黑色素瘤是一種惡性程度極高的腫瘤，惡性黑色素瘤浸潤、轉(zhuǎn)移能力強，擴散迅速，早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，近年來，其發(fā)病率和死亡率都急劇上升，呈現(xiàn)出年輕化趨勢［3］。黑色素是由蛋白質(zhì)、醌和吲哚物質(zhì)結(jié)合的高分子聚合物，決定了人體膚色和毛發(fā)顏色，分布于人表皮細胞中。酪氨酸是一種非必需氨基酸，是制造黑色素的主要原料，經(jīng)過酪氨酸酶的催化反應(yīng)后生成3，4-二羥基苯丙氨酸(LDOPA)［4，5］。酪氨酸酶又稱多酚氧化酶，是黑色素合成的主要限速酶［6］，它不僅決定黑色素合成的速率，還是黑色素成熟的主要標志［7］。生成的L-DOPA 在活性氧的參與下經(jīng)過多次反應(yīng)生成成熟黑色素顆粒［8］，經(jīng)過運輸?shù)竭_表皮。本文采用小鼠B16黑色素瘤細胞做動物模型，探討丹參酮與卡鉑用黑色素瘤形成，增殖的抑制作用。丹參酮可以改善心、肝、肺因缺血的再灌注損傷，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答作用［9］。同時對腫瘤細胞有誘導(dǎo)分化、凋亡作用［10］。其中對Bcl-2 基因表達有降低作用，對P53、Bax、fas 基因有增強表達作用［11-13］，抑制P53 基因的突變進而抑制腫瘤細胞的成長［14］，Bax、fas 是凋亡因子，拮抗Bcl-2 使細胞發(fā)生凋亡，可使Bcl-2 基因蛋白形成異源二聚體，加速腫瘤細胞的死亡［15］?？ㄣK分子通過破壞DNA 使腫瘤細胞無法進行自我復(fù)制從而抑制腫瘤細胞的生長［16］。單獨使用抗腫瘤藥物由于其毒性大，以鉑類藥物為基礎(chǔ)聯(lián)合用藥可以改善癥狀、生存質(zhì)量，降低藥物毒性。

總之，丹參酮、卡鉑聯(lián)合用藥可以抑制B16 黑色素瘤的增殖、轉(zhuǎn)移。抑制B16 黑色素瘤細胞內(nèi)黑色素的合成，降低黑色素瘤的發(fā)生率。聯(lián)合用藥強化了化療藥物的效果，同時降低了單獨使用化療藥物的毒性作用，聯(lián)合用藥具有深遠意義，值得進一步研究開發(fā)。

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