重組HMGB1 對DEN2 感染Ana-1 細(xì)胞分泌TNF-α 及NO 的影響①

孫 偉 商正玲 左 麗 龍世棋 孟慶紅 王 琨 尹 科

(貴陽醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，貴陽醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞與組織工程中心，貴陽 550004)

登革病毒(Dengue virus，DENV)屬黃病毒科黃病毒屬，是單鏈正義RNA 病毒。該病毒主要以白紋伊蚊或埃及伊蚊為傳播媒介，感染人體后可引起臨床癥狀不等的登革熱(Dengue fever，DF)、登革出血熱(Dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革休克綜合征(Dengue shock syndrome，DSS)，目前尚無有效疫苗和特異性方法治療預(yù)防該疾?。?］。研究表明DENV 感染后引發(fā)不同程度的炎癥或免疫功能紊亂與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，而宿主的單核巨噬細(xì)胞(MΦ)既是DENV 感染的主要靶細(xì)胞也是機(jī)體抗DENV 感染的重要效應(yīng)細(xì)胞，探討體內(nèi)不同免疫分子對DENV 感染的單核巨噬細(xì)胞生物功能的影響對于該疾病的轉(zhuǎn)歸具有重要的研究意義。

高遷移率族蛋白1(High mobility group box protein1，HMGB1)是一組保守非組核蛋白。近年來，經(jīng)宿主細(xì)胞被動釋放或主動釋放的胞外HMGB1 被認(rèn)為是一種重要的免疫分子，其在敗血癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、Ⅰ型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)等疾病中發(fā)揮調(diào)控炎癥的分子機(jī)制逐漸被關(guān)注［2］。許多研究表明單核巨噬細(xì)胞是體內(nèi)胞外HMGB1 來源的重要細(xì)胞之一，該分子對DENV 感染MΦ 細(xì)胞的調(diào)控作用鮮見報道［3］。本研究以鼠源單核巨噬細(xì)胞Ana-1 為研究對象，初步探索rHMGB1 對DEN 感染靶細(xì)胞后的病毒增殖及炎癥因子分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 重組HMGB1 蛋白(Sigma 公司);TNF-α ELISA 檢測試劑盒(eBioscience 公司);FITC標(biāo)記兔抗DENV-2 包膜(E)蛋白單克隆抗體(上海億欣生物科技有限公司);H-DMEM 培養(yǎng)基、RMPI1640培養(yǎng)基、100 U/ml青-鏈霉素(HyClone 公司);TRIzol Reagent、M-MLV 第一鏈試劑盒、Premix ExTaq version 2.0 試劑盒(Invitrogen 公司);Griess試劑［1%對氨基苯磺酸、0.1%N-(N)乙二胺、5%磷酸，使用前臨時配制］。

1.2 細(xì)胞株 白紋伊蚊細(xì)胞株(C6/36)和小鼠單核巨噬細(xì)胞系A(chǔ)na-1，分別以H-DMEM 培養(yǎng)基和RPMI1640 培養(yǎng)基按常規(guī)方法培養(yǎng)及保存。

1.3 DEN2 NCG 株 購于中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病研究所，乳鼠鼠腦常規(guī)傳代保存。以C6/36 細(xì)胞增殖，病毒液經(jīng)TCID50 法滴定病毒效價，小管分裝，-80℃保存?zhèn)溆?。DEN2 感染Ana-1 細(xì)胞后TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄使用M-MLV 第一鏈合成試劑盒操作說明完成RT-PCR。對DENV2 NS5部分基因序列進(jìn)行Q-PCR 擴(kuò)增，NS5 引物:上游:5-CATCACTGCCACCCAGAAGA-3;下 游:5-TGAAGTCGCAGGAGACAACC-3。PCR 產(chǎn)物為177 bp，GAPDH 作為內(nèi)參基因，引物序列為:上游:5-CATCACTGCCACCCAGAAGA-3;下游:5-TGAAGTCGCAGGAGACAACC-3;Q-PCR 反應(yīng)條件為:變性94℃30 s，退火64℃45 s，延伸72℃60 s。2-ΔΔCt法進(jìn)行病毒增殖相對定量分析。

1.4 rHMGB1 干預(yù)實(shí)驗 對數(shù)生長期的Ana-1 細(xì)胞以5 ×105/孔接種于6 孔培養(yǎng)板，DEN2 以MOI(感染復(fù)數(shù))2∶1比例感染細(xì)胞。37℃共孵育2 h 后棄上清，1 ml PBS 洗滌3 次，加入含不同濃度重組HMGB1 的1 ml 維持液，其濃度分別為0、1、10、100、1 000 ng/ml，分別命名為DEN2 組、D-HMGB1-1 組、D-HMGB1-10 組、D-HMGB1-100 組、D-HMGB1-1000組同時設(shè)Ana-1 細(xì)胞空白對照。上述各組均設(shè)復(fù)孔。直接免疫熒光法(DIF)判定鑒定DEN2 是否感染Ana-1 細(xì)胞，具體操作如下:取1～2 滴感染細(xì)胞懸液滴于玻片上，設(shè)未感染對照。甲醛熏蒸固定，滴加含F(xiàn)ITC 標(biāo)記的抗E 蛋白抗體(1∶100)、0.02%伊文斯蘭的PBS 混合(98 μl PBS+1 μl 抗體+1 μl伊文斯蘭)。置37℃水浴箱，避光孵育1 h。PBS 液洗滌3 次，滴加封片劑。熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.5 ELISA 法檢測 收集各實(shí)驗組Ana-1 細(xì)胞培養(yǎng)上清，按試劑說明書進(jìn)行操作。所測細(xì)胞因子為TNF-α。

1.6 Griess 法檢測 收集的各實(shí)驗組Ana-1 細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行Griess 試劑比色法檢測。主要操作步驟如下:將亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度，分別為0、10、25、50、75 μmol/L，1 mmol/L。100 μl 標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品中，加入100 μl 新鮮配制的Griess 試劑，充分混合，室溫放置10min 。選取波長為450 nm 處，酶標(biāo)儀檢測各空吸光值。

2 結(jié)果

2.1 直接免疫熒光法鑒定DEN2 感染Ana-1 細(xì)胞熒光顯微鏡觀察顯示DEN2 感染組24 h 的Ana-1發(fā)綠色熒光，而未感染組未見熒光現(xiàn)象(見圖1)。說明DEN2 可黏附Ana-1。

圖1 直接免疫熒光法鑒定DEN2 感染Ana-1 細(xì)胞(×200)Fig.1 Direct immunofluorescent (DIF)identification of Ana-1 adhered with DEN2(×200)

2.2 RT-PCR 鑒定DEN2 感染Ana-1 細(xì)胞 感染24 h 提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行DEN2 NS5 基因RT-PCR 擴(kuò)增，凝膠成像顯示見圖2。3 號泳道(DEN2 感染Ana-1 細(xì)胞組)可見明亮的條帶。與預(yù)期的PCR 產(chǎn)物為177 bp 大小相符。而在1 號(水為模板對照組)和2號(正常Ana-1 細(xì)胞對照組)泳道未出現(xiàn)條帶。

2.3 不同濃度rHMGB1 抑制DEN2 感染Ana-1 細(xì)胞病毒增殖 見圖3、表1。Q-PCR 檢測各組DEN2 NS5 基因表達(dá)水平，計算不同濃度rHMGB1 對病毒增殖抑制率影響，計算公式為:(rHMGB1 處理組的病毒載量/DEN2 組病毒載量)×100%，表1 顯示rHMGB1 可抑制Ana-1 細(xì)胞胞內(nèi)DEN2 的復(fù)制，并隨著rHMGB1 濃度增高，抑制作用越明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

圖2 RT-PCR 鑒定Ana-1 細(xì)胞中DEN2 NS5 基因Fig.2 Identification of DEN2 NS5 gene in Ana-1 cell by RT-PCR

2.4 不同濃度重組HMGB1 對DEN2 感染Ana-1 細(xì)胞分泌TNF-α 的影響 如圖4 所示:不同濃度rHMGB1 對未感染DEN2 的Ana-1 細(xì)胞分泌TNF-α 與對照組相比，DEN2 感染后細(xì)胞分泌TNF-α 的水平明顯增高，而加入rHMGB1 干預(yù)后細(xì)胞分泌TNF-α的水平明顯增加，且與rHMGB1 濃度成正相關(guān);與DEN2 組相比，D-HMGB 組分泌TNF-α 的水平有所減少，且rHMGB1 濃度越高，其分泌量越少。

2.5 不同濃度rHMGB1 對DEN2 感染Ana-1 細(xì)胞分泌NO 的影響 見圖5、表2。如表2 所示，與空白對照組相比，DEN2 組分泌NO 的水平明顯增高，各rHMGB1 刺激組分泌NO 的水平也有所增高，且與rHMGB1 濃度成正相關(guān);與DEN2 組相比，各DHMGB1 組分泌NO 的水平有所降低，且與rHMGB1濃度成負(fù)相關(guān)。

表1 不同劑量rHMGB1 處理后DEN2 感染Ana-1 細(xì)胞中病毒載量的變化(±s，n=3)Tab.1 Expressional level of DEN2 NS5 gene in Ana-1 cell treated by different concentration of rHMGB1(±s，n=3)

表1 不同劑量rHMGB1 處理后DEN2 感染Ana-1 細(xì)胞中病毒載量的變化(±s，n=3)Tab.1 Expressional level of DEN2 NS5 gene in Ana-1 cell treated by different concentration of rHMGB1(±s，n=3)

Note:The different concentration of HMGB1 infected groups compared with control groups，1)P ＜0.05.

圖3 不同劑量rHMGB1 處理后DEN2 感染Ana-1 細(xì)胞中病毒載量的變化Fig.3 Expressional level of DEN2 NS5 gene in Ana-1 cell treated by different concentration of rHMGB1

圖4 不同濃度rHMGB1 處理后DEN2 感染Ana-1 細(xì)胞分泌TNF-α 情況Fig.4 TNF-α secreted for Ana-1 infected DEN2 treated with different concentration of rHMGB1

表2 rHMGB1 對DEN2 感染Ana-1 細(xì)胞分泌NO 的影響(±s，n=3，μmol/L)Tab.2 NO secretion level of DEN2 infected Ana-1 cell treated by different concentration of rHMGB1(±s，n=3，μmol/L)

表2 rHMGB1 對DEN2 感染Ana-1 細(xì)胞分泌NO 的影響(±s，n=3，μmol/L)Tab.2 NO secretion level of DEN2 infected Ana-1 cell treated by different concentration of rHMGB1(±s，n=3，μmol/L)

Note:HMGB1-10，HMGB1-100，HMGB1-1000 group compared with Control，1)P ＜0.05;DEN2 group compared with Control，2)P ＜0.05;D-HMGB1-1，D-HMGB1-10，D-HMGB1-100，D-HMGB1-1000 group compared with DEN2 group，3)P ＜0.05.

圖5 不同濃度rHMGB1 處理后DEN2 感染Ana-1 細(xì)胞分泌NO 情況Fig.5 NO secreted for Ana-1 infected DEN2 treated with different concentration of rHMGB1

3 討論

HMGB1 是細(xì)胞內(nèi)保守的高遷移率蛋白家族成員。研究發(fā)現(xiàn)無論免疫細(xì)胞或非免疫細(xì)胞在多種刺激條件下，胞內(nèi)HMGB1 可通過主動或被動方式從核內(nèi)逐步釋放到胞外，被認(rèn)為是一種新型的內(nèi)源性PAMP，而巨噬細(xì)胞是體內(nèi)釋放HMGB1 的重要細(xì)胞來源之一［4］。釋放到胞外的HMGB1 可與巨噬細(xì)胞表面RAGE、TLR2、TLR4 等受體結(jié)合，通過NF-кB、NRF2 和CEBP 等信號通路發(fā)揮一系列下游生物學(xué)反應(yīng)，參與機(jī)體固有免疫應(yīng)答及適應(yīng)性免疫應(yīng)答［5］，在多種以炎癥損傷為主的感染性和非感染性疾病中的生物功能逐漸被重視［6］。單核巨噬細(xì)胞既是DENV 感染的重要靶細(xì)胞，也是抗DENV 的重要效應(yīng)細(xì)胞，病毒感染后炎性因子的異常分泌與DHF/DSS 等嚴(yán)重炎癥損傷密切相關(guān)。本研究利用rHMGB1 體外觀察其對DEN2 在細(xì)胞內(nèi)增殖作用及細(xì)胞因子分泌的影響進(jìn)行初步探討。

本結(jié)果顯示，在無DENV2 感染條件下，不同劑量的胞外rHMGB1 單純刺激Ana-1 細(xì)胞分泌TNF-α水平無顯著性差異。若在MOI=2 條件下預(yù)先用病毒感染細(xì)胞2 h 后，加入外源rHMGB1，檢測感染24 h，Ana-1 細(xì)胞分泌TNF-α 的水平，發(fā)現(xiàn)隨rHMGB1劑量增加而分泌量降低，且具有統(tǒng)計學(xué)意義。感染前后胞外HMGB1 對細(xì)胞分泌TNF-α 的作用不同，說明HMGB1 對體外DEN2 感染小鼠來源的巨噬細(xì)胞具有調(diào)控作用。結(jié)合病毒復(fù)制結(jié)果，提示隨著胞外HMGB1 增加，胞內(nèi)病毒復(fù)制顯著減少(見表1)與DEN2 組相比，D-HMGB1 組TNF-α 分泌水平降低(P ＜0.05，)，說明HMGB1 可調(diào)節(jié)DEN 感染后TNF-α 的分泌，并隨著rHMGB1 濃度的升高其調(diào)節(jié)作用越明顯，但其作用機(jī)制尚不十分清楚。這與Edwin 等［7］的研究結(jié)果一致。

據(jù)報道，NO 可加重病毒感染后的病理表現(xiàn);本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，DEN 組分泌NO 水平明顯增加，rHMGB1 組分泌NO 水平有所升高;R Chakraborty 等人研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞與rHMGB1 和LPS 或者PGN 共孵育可引起對iNOS 和NO 的協(xié)同表達(dá)，這是由于上調(diào)巨噬細(xì)胞表面受體(TLR2，TLR4 和RAGE)反過來放大MAPKs 和NF-κB 的活化，最后導(dǎo)致iNOS 和NO 的產(chǎn)量增加［8］。上述資料提示rHMGB1 可刺激巨噬細(xì)胞分泌NO，但在本研究中各個D-HMGB1 處理組NO 隨著rHMGB1 濃度的升高，其分泌量逐漸減少，研究結(jié)果提示HMGB1 對DEN2 感染后所致巨噬細(xì)胞大量分泌NO 有一定調(diào)節(jié)作用;本研究還發(fā)現(xiàn)NO 分泌量與DEN 核酸水平成正相關(guān)，而NO 分泌量又與DEN 感染性疾病的病理表現(xiàn)密切相關(guān)，該現(xiàn)象的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，rHMGB1 對DEN2 在Ana-1 細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制有一定抑制作用，并且隨著rHMGB1 濃度增加，其抑制率越明顯，而TNF-α 及NO 分泌水平相應(yīng)減少。提示HMGB1 對于DEN2 感染具有抑制作用，且可調(diào)節(jié)DEN2 感染所致大量炎癥因子的分泌，一定程度降低機(jī)體的病理反應(yīng)，有利于組織損傷的修復(fù)，對于病毒免疫方面的研究具有重要的價值。

［1］Sun P，Kochel TJ.The battle between infection and host immune responses of dengue virus and its implication in dengue disease pathogenesis［J］.Scientific World J，2013:843469.doi:10.1155/2013/843469.

［2］Urbonaviciute V.Furnrohr G.Induction of inflammatory and immune responses by HMGB1-nucleosome complexes:implications for the pathogenesis of SLE［J］.J Exp Med，2008，205(13):3007-3018.

［3］Bianchi ME，Manfredi AA.High-mobility group box1(HMGB1)protein at the crossroads between innate and adaptive immunity［J］.Immunol Rev，2007，220(12):35-46.

［4］Chitanuwat A，Laosrisin N，Dhanesuan N.Role of HMGB1 in proliferation and migration of human gingival and periodontal ligament fibroblasts［J］.J Oral Science，2013，55(1):45-50.

［5］Huan Y，Daniel J，Ulf Andersson，et al.The many faces of HMGB1:molecular structure-functional activity in inflammation，apoptosis，and chemotaxis ［J］.J Leukoc Bio，2013，93(6):865-873.

［6］Li W，Wang H，Ward MF，et al.Potential role of high mobility group box 1 in viral infectious diseases［J］.Viral Immunol，2006，19(1):3-9.

［7］Edwin Kamau，Ratree Takhampunya，Tao Li，et al.Dengue virus infection promotes translocation of high mobility group box 1 protein from the nucleus to the cytosol in dendritic cells，upregulates cytokine production and modulates virus replication［J］.J General Virol，2009，90(4):1827-1835.

［8］Chakraborty R，Bhatt KH，Sodhi A.High mobility group box 1 protein synergizes with lipopolysaccharide and peptidoglycan for nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages in vitro［J］.Mol Immunol，2013，54(1):48-57.