休閑鹵豆干中腐敗菌的分離鑒定

彭玲慧，吳菲菲，李化強(qiáng)，趙良忠，陳 浩，卜宇芳，劉 倩，李文強(qiáng)，徐緯，尹錦輝

(邵陽(yáng)學(xué)院生物與化學(xué)工程系，湖南邵陽(yáng)422000)

豆腐干是我國(guó)的傳統(tǒng)美食，其主要原料是大豆，富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、鈣及B族維生素，營(yíng)養(yǎng)均衡，易被人體消化吸收［1］。豆腐干有鹵干、熏干、醬油干等，由于其營(yíng)養(yǎng)豐富，含有大量蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物，還含有鈣、磷、鐵等多種人體所需的礦物質(zhì)，有“植物肉”的美稱(chēng)。休閑鹵豆干，是將豆腐干經(jīng)過(guò)鹵制、調(diào)味、殺菌等工藝制成的口味多樣、營(yíng)養(yǎng)豐富、適宜旅游休閑等的即食豆腐干食品。

近年來(lái)，隨著我國(guó)休閑食品的發(fā)展，休閑豆腐干以其良好的口感，在休閑食品市場(chǎng)越來(lái)越受消費(fèi)者的歡迎，僅湖南邵陽(yáng)地區(qū)在2014年豆制品產(chǎn)值就達(dá)30億元［2］。休閑豆腐干雖然產(chǎn)量在逐漸增加，但由于其富含蛋白質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)豐富，很容易滋生微生物而導(dǎo)致腐敗變質(zhì)［3］，再加上豆腐干加工的工藝復(fù)雜，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，因而與外界環(huán)境的接觸增加了微生物污染的機(jī)會(huì);另外還有機(jī)械化程度低、手工操作多等因素，不同生產(chǎn)企業(yè)的加工環(huán)境和設(shè)施以及操作人員等差異［4］，導(dǎo)致生產(chǎn)過(guò)程中微生物污染更加難以控制，目前由微生物污染而導(dǎo)致豆制品腐敗的問(wèn)題已成為制約豆制品大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化的瓶頸之一［5］。因此，筆者以真空包裝腐敗變質(zhì)的鹵豆干為研究對(duì)象，從中分離純化出優(yōu)勢(shì)微生物，通過(guò)形態(tài)學(xué)特征、生理生化試驗(yàn)及Sensititre微生物自動(dòng)鑒定儀等方法鑒定真空包裝豆腐干中腐敗微生物，以期為休閑鹵豆干的生產(chǎn)能更好地控制該微生物的污染提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1．1 材料 供試原料:真空包裝鹵豆干，湖南恭兵食品有限公司。主要試劑:革蘭氏染液、甲醇、0．5%堿性復(fù)紅染色液、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉、葡萄糖、氯化鈉、酵母浸膏等，均由邵陽(yáng)學(xué)院生物與化學(xué)工程系實(shí)驗(yàn)室提供。

主要儀器設(shè)備:高壓滅菌鍋(LDZX-75KB型)，上海申尖醫(yī)療器械廠;恒溫培養(yǎng)箱(HP X-9272MBE型)、電熱鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9140 MBE型)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;G1200127N移液槍(1 ml和100μl)、EL20 pH計(jì)、電子天平(EL204)，梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;恒溫水浴槽(SY-1210數(shù)顯)，上?？戮S儀器有限公司;超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1F)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;自動(dòng)快速微生物鑒定儀，英國(guó)SENSITITRE公司。

1．2 方法

1．2．1 腐敗菌的分離純化。在無(wú)菌條件下，取出已經(jīng)脹包酸敗的鹵豆干，用無(wú)菌剪刀剪碎后，再用無(wú)菌鑷子夾取一小部分豆腐干加入到經(jīng)高壓滅菌的LB培養(yǎng)基中，置37℃，120 r/min，搖床增菌培養(yǎng)12 h。10倍梯度稀釋至10－7，吸取100 μl菌懸液均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24 h。挑取單個(gè)典型菌落接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，分離純化，得到純種。

1．2．2 形態(tài)觀察。觀察細(xì)菌菌落形態(tài)，挑取單個(gè)菌落，用火焰固定，進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下對(duì)細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察［6］。

1．2．3 腐敗菌的菌種鑒定。

1．2．3．1 富集培養(yǎng)。將分離純化后的純培養(yǎng)物接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，劃線培養(yǎng)，于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。

1．2．3．2 濁度調(diào)整。取裝有標(biāo)準(zhǔn)接種液的濁度管，在濁度儀上調(diào)至100%，用滅菌棉簽挑取培養(yǎng)好的菌落，在無(wú)菌狀態(tài)下接種到濁度管中，測(cè)量，直到調(diào)至90% ～97%標(biāo)準(zhǔn)濁度值。

1．2．3．3 接種鑒定板。將調(diào)整好濁度的菌液倒入V型加樣槽，用移液器將菌液加入到微孔鑒定板上，于35℃條件下培養(yǎng)。

1．2．3．4 讀取數(shù)據(jù)。開(kāi)啟鑒定系統(tǒng)，將已培養(yǎng)16～24 h的微孔鑒定板放到Sensititre微生物自動(dòng)鑒定儀的讀數(shù)儀上，按照可能性大小給出1～2種可能菌株的名稱(chēng)。

1．2．4 優(yōu)勢(shì)腐敗菌相關(guān)生理生化試驗(yàn)。根據(jù)Sensititre微生物自動(dòng)鑒定儀鑒定出來(lái)的結(jié)果，結(jié)合GB 26427－2010對(duì)分離出的優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行MYP試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、動(dòng)力試驗(yàn)以及蛋白質(zhì)結(jié)晶毒素試驗(yàn)。

1．2．4．1 MYP試驗(yàn)。挑取已分離純化的單菌落，劃線在甘露醇卵黃多粘菌素(MYP)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察是否有粉紅色菌落且周?chē)袝炄Α?/p>

1．2．4．2 溶血試驗(yàn)。挑選純化的菌落劃線，接種在血瓊脂平板表面，37℃培養(yǎng)(24±2)h，觀察菌落形態(tài)以及是否出現(xiàn)溶血環(huán)。

1．2．4．3 動(dòng)力試驗(yàn)。用接種針挑取選出的菌落穿刺接種于動(dòng)力培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)(24±2)h，觀察動(dòng)力反應(yīng)。

1．2．4．4 蛋白質(zhì)結(jié)晶毒素試驗(yàn)。取經(jīng)37℃培養(yǎng)(24±2)h并于室溫放置2～3 d的培養(yǎng)物少許于載玻片上，滴加蒸餾水混涂成薄膜。待自然干燥后用弱火固定。于涂膜處滴加甲醇，30 s后傾去甲醇，置火焰上干燥。接著滴加0．5%堿性復(fù)紅染色液，置火焰上加熱至微見(jiàn)蒸汽(勿使染液沸騰)后維持1．5 min，移去火焰，將載玻片放置0．5 min，傾去染液。用潔凈自來(lái)水徹底漂洗、晾干、鏡檢。在油鏡下觀察有無(wú)游離芽孢和深染的似菱形的小結(jié)晶體。

1．2．5 腐敗鹵豆干中菌落計(jì)數(shù)。根據(jù)GB 4789．2－2010，在無(wú)菌操作下，稱(chēng)取腐敗變質(zhì)豆腐干25 g，加入盛有225 ml滅菌生理鹽水中無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，8 000～10 000 r/min均質(zhì)1～2 min。用1 ml無(wú)菌吸管吸取1∶10樣品勻液1 ml，沿管壁緩慢注入盛有9 ml稀釋液的無(wú)菌試管中，制成1∶100的樣品勻液。重復(fù)以上步驟，制備10倍系列稀釋樣品勻液，梯度稀釋到10－7～10－1。選擇2～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，分別吸取1 ml稀釋液轉(zhuǎn)入到滅菌平皿中，每個(gè)稀釋度做2個(gè)平皿，同時(shí)，分別吸取1 ml空白稀釋液加入到2個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。將涼至46℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15 ml，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。將制好的平板置于(36±1)℃恒溫箱中培養(yǎng)(48±2)h后，觀察菌落生長(zhǎng)和分布情況，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2．1 腐敗鹵豆干中細(xì)菌鑒定結(jié)果 從腐敗鹵豆干中分離出1株典型的菌落，命名為菌株A，將接種菌落的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后，觀察平板上有典型的菌落生長(zhǎng)。其菌落形態(tài)及細(xì)菌形態(tài)見(jiàn)圖1。腐敗豆腐干中細(xì)菌菌落和細(xì)胞顯微鏡形態(tài)如下:菌株編號(hào)為A，培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨，90%以上的菌株為陽(yáng)性反應(yīng)，菌落形態(tài)近似圓形，有光澤，似蠟燭樣，菌落大，直徑5～7 mm，表面粗糙，扁平，細(xì)胞形態(tài)特征為G+，桿狀，末端方，呈短或長(zhǎng)鏈。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，從腐敗變質(zhì)鹵豆干中分離出的菌株經(jīng)分離純化后，進(jìn)行革蘭氏染色，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察，從顯微圖片可以明顯看到該菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，呈長(zhǎng)桿狀。

2．2 Sensititre32型全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定

2．2．1 A號(hào)菌株的鑒定結(jié)果。A號(hào)菌株的鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)表1可以得出，A號(hào)鑒定板在培養(yǎng)18 h后，系統(tǒng)給出的最大可能結(jié)果是蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，其PROB值為100%。

表1 A號(hào)菌株培養(yǎng)18 h后鑒定結(jié)果

2．3 生理生化試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)Sensititre微生物自動(dòng)鑒定儀鑒定出的結(jié)果，結(jié)合GB 26427－2010對(duì)分離出的菌種分別進(jìn)行了MYP試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、動(dòng)力試驗(yàn)以及蛋白質(zhì)結(jié)晶毒素試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2～5及表2。根據(jù)形態(tài)觀察及生理生化測(cè)定結(jié)果，該分離菌株的生理生化結(jié)果與蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)相符。

表2 菌株A的生理生化特征

根據(jù)Sensititre微生物自動(dòng)鑒定儀鑒定結(jié)果及相關(guān)生理生化試驗(yàn)可以判斷該菌株為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)。

2．4 菌落計(jì)數(shù) 按照GB 4789．2－2010的要求，對(duì)腐敗鹵豆干中的細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，經(jīng)計(jì)算得出腐敗鹵豆干中的細(xì)菌數(shù)量是1．2 ×106CFU/g。

3 結(jié)論

蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)是一種在自然界廣泛分布的好氣性、產(chǎn)芽孢的桿菌，通常處于孢子和休眠的狀態(tài)。蠟樣芽孢桿菌一般不會(huì)致病，但有的菌株能導(dǎo)致食物中毒癥狀［7］，主要為腹瀉型和嘔吐型2種［8］。蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒是最常見(jiàn)的食物中毒之一，但目前各國(guó)并未強(qiáng)制要求檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌含量。

該試驗(yàn)通過(guò)對(duì)分離細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)特性、生理生化特性以及Sensititre微生物自動(dòng)鑒定儀鑒定，最后得出該分離的細(xì)菌為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)。

休閑鹵豆干是我國(guó)目前比較受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)的休閑食品，其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及適宜的口感是其受消費(fèi)者喜愛(ài)的主要原因。但是其在保存時(shí)期的受微生物污染而導(dǎo)致的腐敗脹包問(wèn)題一直是影響休閑豆腐干生產(chǎn)和銷(xiāo)售的主要原因，而各地工廠由于生產(chǎn)環(huán)境及原料不同，導(dǎo)致影響豆腐干腐敗的微生物也不一定相同。因此，該研究結(jié)果可以為邵陽(yáng)休閑鹵豆干生產(chǎn)中蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的控制采取針對(duì)性措施，從而延長(zhǎng)貨架期，提高豆腐干的質(zhì)量，為工廠在生產(chǎn)豆腐干過(guò)程中的防腐措施提供一定參考。

［1］陳金財(cái)．休閑豆制品行業(yè)現(xiàn)狀及未來(lái)發(fā)展方向［J］．農(nóng)產(chǎn)品加工(創(chuàng)新版)，2009(7):52 －54．

［2］謝玲．休閑豆腐干行業(yè)突破短板放眼全國(guó)［J］．農(nóng)產(chǎn)品加工，2012(7):8－9．

［3］王紅戟，陳婭，林沛璋．豆腐加工過(guò)程中微生物污染的調(diào)查與對(duì)策［J］．中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008(6):275．

［4］梁榮蓉，張一敏，李飛燕，等．雞肉調(diào)理制品生產(chǎn)過(guò)程中污染微生物的調(diào)查研究［J］．食品科學(xué)，2010(5):275．

［5］石彥國(guó)，任莉．大豆制品工藝學(xué)［M］．北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，1996:13－25．

［6］于源華．生物工程與技術(shù)專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)教程［M］．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2009:37－48．

［7］KOTIRANTA A，LOUNATMAA K，HAAPASALO M．Epidemiology and pathogenesis of Bacillus cereus infections［J］．Micro Infect，2000(2):189－198．

［8］周幗萍，袁志明．蠟樣芽孢桿菌污染及對(duì)食品安全的影響［J］．食品科學(xué)，2007，28(3):357 －361．