嵌合雙串聯(lián)OVA T細胞表位的RHDV VP60蛋白免疫特性研究

宋艷華，張 燕，胡 波，范志宇，魏后軍，劉 星，黃 兵，薛家賓，徐為中，王 芳*

(1．江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所，農業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室，國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇南京210014;

2．山東省農業(yè)科學院家禽研究所，山東濟南250023)

兔出血癥(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)是由兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的一種具有高度傳染性、高發(fā)病率、高致死性的疾病，是兔的一種毀滅性傳染?。?-2］。該病在世界各地都有發(fā)生，在歐洲和東亞地區(qū)呈地方性流行［3-5］。兔出血癥的病原RHDV是杯狀病毒的成員之一，屬于單鏈正股RNA病毒，基因組長約7．5 kb，其衣殼蛋白VP60可自行裝配形成VLPs(Virus-like particles)［6-9］，是 RHDV 結構及免疫原性研究的重點［10-13］。目前，已有大量研究表明VP60 VLPs可以作為外源表位遞呈載體和基因轉移載體，為其發(fā)展成為攜帶多表位的載體疫苗提供依據［14-18］。

為進一步擴展RHDV VLPs作為載體容納外源片段的長度以及作為載體有效遞呈外源T細胞表位的能力，筆者將外源雙串聯(lián)CD8+T細胞表位，序列為GSSIINFEKLGSSIINFEKLGS，按照以下方式分別整合到VP60序列中:將雙串聯(lián)OVA CD8+T細胞表位插入VP60 N末端;將雙串聯(lián)OVA CD8+T細胞表位序列分別替換VP60蛋白的2～13AA和302～309AA，通過桿狀病毒表達載體構建嵌合體，最終表達獲得3種嵌合蛋白，分別命名為 VP60-DN1、VP60-DN2 和 VP60-DC［19-20］。在上述研究的基礎上，筆者將獲得嵌合蛋白進行濃縮純化，選擇特異性的C57BL/6雌性小鼠進行免疫試驗，通過體液免疫應答和細胞免疫應答全面闡述VP60作為載體遞呈外源表位的能力，進一步證實VP60 VLPs具有作為疫苗載體的潛在價值。

1 材料與方法

1．1 試劑、病毒和實驗動物 重組桿狀病毒rAcV-Bac-VP60、rAcV-Bac-DN1、rAcV-Bac-DN2 和 rAcV-Bac-DC 由農業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室構建并保存［2，19-20］。OVA CD8+T細胞表位多肽由吉爾生化公司合成;ELISPOT試劑盒購自Mabtech公司。7～8周齡C57BL/6雌性小鼠購自揚州大學比較醫(yī)學中心。

1．2 病毒樣顆粒的電鏡觀察 將重組桿狀病毒rAcV-Bac-VP60、rAcV-Bac-DN1、rAcV-Bac-DN2 和 rAcV-Bac-DC 接 種Sf9細胞，培養(yǎng)4～5 d待細胞完全病變后，分別收獲細胞培養(yǎng)物，3 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用PBS重懸洗滌3次后，反復凍融3次，12 000 r/min離心5 min，取上清，用作電鏡觀察。將待檢病毒培養(yǎng)物樣品滴于載樣銅網上，吸附作用2 min，將2%的磷鎢酸染液滴于銅網上，固定2 min。室溫干燥后用H-7650型透射電鏡對嵌合蛋白進行觀察。

1．3 嵌合蛋白的制備 將4種重組桿狀病毒分別以1%體積比接種于單層Sf9昆蟲細胞，培養(yǎng)4～5 d待細胞完全病變后，分別收獲細胞培養(yǎng)物，反復凍融3次后，5 000 g離心15 min去除細胞碎片，再次10 000 g離心30 min去除大的蛋白復合物和桿狀病毒粒子，上清中的VLPs再次100 000 g離心2．5 h進行濃縮，4℃PBS重懸沉淀，進一步通過蔗糖密度梯度離心進行純化，將樣品鋪于10% ～50%蔗糖上，100 000 g 4℃離心2 h，吸取分界面的樣品，再次超速離心100 000 g 4℃離心2 h除去蔗糖，沉淀用PBS重懸。利用BAC蛋白定量試劑盒測定純化后重組蛋白的濃度，最終獲得的重組蛋白分別命名為DN1、DN2、DC和VP60蛋白。

1．4 嵌合蛋白的免疫特性研究

1．4．1 動物免疫。將嵌合蛋白DN1、DN2、DC以及VP60蛋白分別免疫7～8周齡C57BL/6雌性小鼠，每組5只，共免3次，每次間隔2周，免疫程序見表1。設置相同注射體積的PBS組作為空白對照組。于首免后0、4和6周對所有小鼠尾部采血分離血清，采用建立的間接ELISA方法［21］檢測VP60特異性抗體滴度。于首免后6周將所有小鼠安樂死后分離脾淋巴細胞，用于檢測特異性IFN-γ分泌水平。

表1 動物實驗免疫程序

1．4．2 VP60特異性抗體效價的測定。首免后0、4和6周對所有小鼠尾部采血分離血清，采用間接ELISA法檢測各組小鼠血清中抗VP60的特異性抗體滴度。用pH 9．6包被液稀釋VP60蛋白，4℃下包被過夜。脫脂乳37℃下封閉2 h。洗滌后每孔加入倍比稀釋的待檢血清，100μl/孔，37℃孵育1 h。加入1∶10 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h。加入顯色液100μl/孔，避光作用10 min，最后加入終止液，50μl/孔。自動酶標儀測定OD450值，將P/N≥2．1即判定為陽性，計算抗體滴度。

1．4．3 ELISPOT檢測特異性IFN-γ分泌水平。首免后6周，將各免疫組小鼠處死取脾臟，分離脾淋巴細胞，用含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋細胞濃度為2．5×106個/ml。每組小鼠的脾淋巴細胞作3個重復孔，并設置非特異性刺激物ConA為陽性對照。ELISPOT檢測步驟為:用50μl/孔70%乙醇預處理ELISPOT板;棄去液體，無菌水洗滌5次;用無菌PBS(pH 7．4)稀釋包被IFN-γ 抗體(AN18)至15 μg/ml，每孔100μl，4℃包被過夜;棄去包被液，并用無菌PBS洗板5次;加入含10%胎牛血清RPMI-1640 200μl/孔，室溫孵育30 min。棄去細胞上清，加入含有2．5μg/ml OVA T細胞表位多肽刺激物的脾淋巴細胞懸液，200μl/孔。用錫箔紙包住板子置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱，孵育48 h。48 h后棄去細胞液，PBS洗板5次;用0．5%FBS-PBS稀釋檢測抗體(R4-6A2-生物素)至1 μg/ml，100 μl/孔，室溫作用2 h。PBS 洗板5 次，用0．5%FBS –PBS1∶1 000 稀釋聯(lián)合親霉素-ALP，100 μl/孔，室溫作用1 h。PBS洗板5次，底物(BCIP/NBT-plus)用0．45μm的濾器進行過濾，100μl/孔，室溫作用直至出現(xiàn)斑點。用水沖洗即可終止顯色反應，將板子倒置晾干，室溫避光保存板子。利用ELISpot reader觀察并計數斑點。

2 結果與分析

2．1 嵌合蛋白的鑒定 電鏡結果表明，3種嵌合蛋白DN1、DN2和DC均可形成大小約為40 nm的VLPs，形態(tài)大小均與VP60蛋白VLPs相似(圖1)，說明VP60的2～13AA和302～309AA區(qū)域的改造不影響VP60 VLPs的形成。

2．2 VP60特異性抗體效價的測定 為檢測嵌合VP60蛋白免疫小鼠后誘導產生的體液免疫反應，分別于首免后0、4和6周采血分離血清，采用ELISA檢測各組誘導產生的特異性抗體效價滴度。從圖2可以看出，嵌合蛋白組以及VP60組誘導產生的特異性抗體效價滴度與PBS對照組差異極顯著(P＜0．001)。DN1、DN2、DC 和 VP60組免疫后與免疫前抗體效價差異極顯著(P＜0．001)，首免后6周，嵌合蛋白組與VP60組抗體效價均高于首免后4周的水平，且消長規(guī)律一致。嵌合蛋白組與VP60組之間抗體效價并無顯著性差異(P＞0．05)。這表明，重組蛋白免疫后能有高效地誘導機體產生抗VP60特異性抗體，且外源雙串聯(lián)T細胞表位的插入并未影響抗體產生的水平，嵌合蛋白有效地保持了VP60蛋白原有的免疫特性。

2．3 ELISPOT檢測特異性IFN-γ分泌水平 為了檢測嵌合蛋白中插入的雙串聯(lián)OVA T細胞表位能否誘發(fā)特異性細胞免疫應答，首免后6周分離免疫小鼠脾淋巴細胞，利用合成OVAT細胞表位多肽刺激淋巴細胞，ELISPOT檢測各免疫組小鼠脾臟淋巴細胞分泌特異性IFN-γ的水平。從圖3可以看出，VP60組無斑點產生，而3種嵌合蛋白組均顯示出一定數量的斑點，說明能夠誘導特異性IFN-γ的分泌，同時非特異性刺激劑ConA作為陽性對照，能夠誘導產生大量的IFN-γ的分泌。

將所有細胞孔中的斑點數據進行分析。從圖4可以看出，3種嵌合蛋白免疫小鼠脾淋巴細胞均能夠分泌特異性IFN-γ，且分泌水平顯著高于 VP60及 PBS對照組(P＜0．001)，其中DN1和DN2組分泌特異性IFN-γ的水平顯著高于DC組(P＜0．05)。該結果表明在VP60 N端插入外源T細胞表位與VP60 302～309AA相比，能夠誘導產生的細胞免疫應答更加強烈。

3 討論

在昆蟲細胞中表達RHDV VP60蛋白時，它能夠自發(fā)地形成形態(tài)學上和抗原學上與天然病毒無差異的病毒樣顆粒，其可以誘導機體產生中和抗體及有效的細胞免疫應答，不含有遺傳物質，能夠攜帶和有效遞呈外源片段，可以作為疫苗載體，為新型疫苗的研制提供基礎。Nagesha等［17］研究了對RHDV VP60的N-端和C-端進行缺失處理或用藍舌病毒衣殼蛋白VP7上的一個特征性的6個氨基酸殘基位點—Btag進行替換，結果表明在N-端插入外源序列不影響嵌合蛋白形成VLPs。E．Crisci［14］等在 VP60 的 N 端和 306AA 中插入單個OVA CD8+T細胞表位，結果顯示可形成嵌合的RHDV樣的病毒粒子，且可誘導強烈的細胞免疫應答。Khairunadwa Jemon等［22］將人通用輔助性T細胞表位PADRE插入VP60蛋白的N末端，并在形成的VLPs表面連接人乳頭瘤病毒E6蛋白中一小肽，該嵌合VLPs能夠對腫瘤小鼠的產生有效的免疫治療，并延長腫瘤小鼠的存活時間，研究表明VP60 N末端是一個良好的外源T細胞表位插入位點。在以上研究報道的基礎上，筆者選擇N端插入或替換為雙串聯(lián)OVA CD8

+T細胞表位的方式構建并獲得2種嵌合蛋白，且將302～309AA替換為串聯(lián)OVA CD8+T細胞表位構建并獲得一種嵌合蛋白，嵌合蛋白共攜帶外源片段的長度為22個氨基酸，通過嵌合蛋白的純化鑒定、動物免疫以及免疫后體液和細胞免疫應答的檢測分析，結果發(fā)現(xiàn)嵌合蛋白仍然具有形成VLPs的能力，且能夠誘導產生高水平的特異性細胞免疫應答，該試驗結果與相關報道結果一致，且進一步擴展了RHDV VP60作為載體容納外源片段的長度，驗證了VLPs具有高效遞呈外源T細胞表位的能力。

Xue Wang等通過低溫電鏡和晶體學技術解析RHDV的結構，發(fā)現(xiàn)VP60的300～318位氨基酸含有位于病毒粒子最外表面的Loop區(qū)［13］。該研究中選取的替換位點302～309AA包含在300～318位氨基酸中，位于P2亞單位突環(huán)處，且不包含保守氨基酸位點，故可能對外源基因的耐受性較高。該研究結果表明在VP60的N端和302～309位插入長達66 bp的外源片段后不影響VP60的自我組裝。

ELISPOT技術是一種國際公認的用于檢測特異性效應細胞分泌水平的方法。為檢測VP60作為展示系統(tǒng)遞呈外源OVA T細胞表位的能力，筆者在首免后6周分離脾淋巴細胞，利用ELISPOT方法進行檢測。結果表明，嵌合蛋白組均能誘導分泌特異性IFN-γ。該研究中VP60 N端插入外源T細胞表位的嵌合蛋白組比在VP60 302-309位插入外源表位的嵌合蛋白組引起的特異性細胞免疫應答能力更強，此結果與E．Crisci等的報道一致，進一步證實了N末端能夠更加有效的遞呈外源T細胞表位。

筆者利用前期構建的3種嵌合蛋白DN1、DN2和DC，進行動物免疫試驗，通過體液和細胞免疫應答檢測嵌合蛋白的免疫特性，結果表明3種嵌合蛋白均能引起針對載體VP60的特異性抗體應答;且能夠誘導特異性IFN-γ的分泌，其中DN1和DN2誘導的分泌水平高于DC組。這說明在VP60 N端插入外源T細胞表位比在VP60 302～309位插入表位引起的特異性細胞免疫應答能力更強。該研究結果擴展了VP60-VLPs作為載體容納外源片段的長度，同時進一步驗證了VP60-VLPs遞呈外源表位的載體效應。

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