急性持續(xù)熱應激對成年兔血液部分生理生化指標的影響

黃光遠，趙 川，楊曉煉，趙 杰，潘芳燕，陽丹丹，黃慶洲

(西南大學榮昌校區(qū)動物醫(yī)學系，重慶402460)

熱應激是動物在超出適宜溫度范圍的高溫環(huán)境中飼養(yǎng)時對熱應激源所作出的非特異性生理反應［1－2］。過度的熱應激可使動物的采食量、飼料報酬、抗病力和繁殖率等生產(chǎn)指標顯著降低，甚至導致動物大量死亡，給養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來極大危害［3］。在我國大部分地區(qū)，特別是西南地區(qū)，由于夏季高溫、高濕度持續(xù)時間長，環(huán)境溫度持續(xù)在30℃左右的時間長達3個月之久，熱應激成為危害該地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)殖的重要環(huán)境因素之一［4］。對動物熱應激機制及如何降低其對養(yǎng)殖生產(chǎn)的影響已成為學術(shù)界重要的研究課題。多數(shù)學者認為，熱應激與機體交感－腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)及下丘腦－腺垂體－腎上腺皮質(zhì)機亢進，腎上腺素、糖皮質(zhì)激素等分泌增多，引起一系列代謝紊亂，免疫及生殖機能、采食量降低等相關(guān)，對動物生產(chǎn)性能帶來極大的負面影響［3］。關(guān)于急性持續(xù)熱應激對動物血液生理生化指標的影響報道較少。筆者以成年健康肉兔為試驗動物，觀察了人工35℃、72 h持續(xù)熱應激對成年動物血液部分生理生化指標的影響，以期為熱應激機制研究提供基礎試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 主要儀器。紫外分光光度計(上海菁華科技有限公司，E-14-08-007)、電解質(zhì)分析儀(深圳市航創(chuàng)醫(yī)療設備有限公司，HC-9886)、自動血細胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)、SSW型電熱恒溫水槽(上海博訊實業(yè)有限公司)、低溫離心機(上海安亭科學儀器廠制造)、－40℃低溫冰箱(海爾)、格力空調(diào)(珠海格力電器有限公司)、肝素鋰一次性真空采血管(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)。

1．1．2 生化指標測試藥盒。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)測試盒(批號分別為20140912、20140905)，包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶基質(zhì)液、谷草轉(zhuǎn)氨酶基質(zhì)液、2，4-二硝基苯肼液、丙酮酸鈉標準液等;總膽固醇(TC)測試盒(批號為F0021-1)，主要試劑有膽固醇激酶、膽固醇氧化酶、過氧化物酶等;葡萄糖(Glu)測試盒(批號為F006)，主要試劑有對羥基苯甲酸鹽、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶 、4-氨基安替比林等;甘油三酯(TG)測試盒(批號為F001-1)，主要試劑有脂肪酶、甘油磷酸氧化酶、甘油激酶、ATP等;蛋白定量測試盒(批號為A045-2):考馬斯亮藍貯備液、蛋白標準品等。試驗盒均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1．1．3 試驗動物。健康新西蘭肉兔16只，雄性，體重2．0～2．5 kg/只，由西南大學榮昌校區(qū)動物科提供。

1．1．4 動物飼料。精深兔料860ZQA兔配合飼料(成都營大農(nóng)牧發(fā)展有限公司生產(chǎn)，批號20140624)。其中，粗蛋白≥16．0%、粗纖維 10．0% ～12．0%、粗灰分≤10．0%、粗脂肪≥2．0%、鈣0．5 ～1．0%、鈣磷比(%)2∶1、氯化鈉0．5%、水分≤12．5%、賴氨酸≥0．7%;飼料中主要微量元素含量為:Cu≤40 mg/kg、Fe≥80 mg/kg、Zn≥60 mg/kg;VA≥9 000 IU/kg、VD≥900 IU/kg、VE≥40 IU/kg。

1．2 方法

1．2．1 動物分組。試驗時間安排在2014年7月7日至7月20日進行，試驗地點在西南大學榮昌校區(qū)動物房。將16只健康兔移入普通立體兔籠飼養(yǎng)，每籠2只，自由采食和飲水，試驗期間自然環(huán)境溫度27～32℃，常規(guī)飼養(yǎng)7 d，觀察采食和飲水無異常情況后，轉(zhuǎn)入正式試驗。將動物隨機分為熱應激組(飼舍溫度控制為(35±1)℃)和適溫組(飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在(24±1)℃)，每組8只，每組單獨房間飼養(yǎng)。

1．2．2 飼舍溫度控制方法。熱應激組:用200 W紅外線保溫燈泡加熱，于試驗當天8:00開始逐漸升溫，至當天12:00飼舍溫度達到(35±1)℃(空氣濕度變化范圍為65% ～75%)，高溫持續(xù)時間72 h;適溫組:用空調(diào)降溫，于試驗當天8:00開始逐漸降溫，至當天12:00飼舍溫度達到(24±1)℃(空氣濕度變化范圍為65% ～75%)，適溫持續(xù)時間72 h。

1．2．3 飼養(yǎng)方式及熱應激處理時間。肉兔自由采食和飲水，每天8:00和18:00各飼喂1次，(35±1)℃熱應激處理持續(xù)時間72 h。

1．2．4 血漿收集及保存。正式試驗從早上8:00開始，每隔24 h后(即第2天早上8:00)，用肝素鋰真空采血管于兔的后肢外側(cè)靜脈采抗凝血5 ml，取1 ml抗凝血進行血細胞數(shù)量測定，其他血液4℃、3 000 r/min離心5 min，收集血漿，分裝于1．5 ml指形管(0．5 ml/管)，－40 ℃保存，1 月內(nèi)待測。

1．2．5 血細胞數(shù)量的測定。采用自動血細胞分析儀進行血細胞數(shù)量的測定。

1．2．6 血漿電解質(zhì)含量的測定。采用臨床電解質(zhì)分析儀測定血漿電解質(zhì)含量。將低溫保存的血漿自然解凍，先用A標準液基點定標，吸樣口吸取血漿125 μl，測定Na+、K+、Cl－和Ca2+的含量。

1．2．7 血漿生化指標的測定。血漿GOT和GPT活性的測定采用賴氏法，以卡門氏單位作為酶的活性單位。卡門氏單位的定義:1 ml血清，反應總?cè)萘? ml，340 nm波長，1 cm光徑，25℃、1 min內(nèi)所生成的丙酮酸，使NADH氧化成NAD而引起吸光度每下降0．001為1個卡門氏單位;血糖濃度采用葡萄糖氧化酶－過氧化物酶法測定，甘油三酯、血漿膽固醇含量的測定均采用酶偶聯(lián)比色法，血漿總蛋白溫的測定采用雙縮脲法。操作步驟按照試劑盒說明書的方法進行。

1．2．8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。試驗數(shù)據(jù)使用SPSS15．0統(tǒng)計軟件進行顯著性檢驗，結(jié)果以平均值±標準差(ˉx±s)表示。

2 結(jié)果與分析

2．1 急性持續(xù)熱應激兔血細胞數(shù)量的變化 由表1可知，急性持續(xù)熱應激24 h后，熱應激組白細胞數(shù)、中性粒細胞數(shù)、血小板數(shù)顯著高于或極顯著高于適溫組(P＜0．05或P ＜0．01)，淋巴細胞比率顯著低于適溫組(P ＜0．05);急性持續(xù)熱應激48 h后，白細胞數(shù)、血小板數(shù)顯著或極顯著高于適溫組(P＜0．05或 P＜0．01);急性持續(xù)熱應激72 h后，血小板數(shù)、中性粒細胞比率顯著高于或極顯著高于適溫組(P＜0．05或P＜0．01)，而淋巴細胞數(shù)顯著低于適溫組(P＜0．05);其他指標同一時間點各組間差異均不顯著(P＞0．05)。

表1 急性持續(xù)熱應激兔血細胞數(shù)量的變化ˉx±s

2．2 急性持續(xù)熱應激兔血漿部分生化指標的變化 由表2可知，急性熱應激處理24、48、72 h后，熱應激組血糖含量與適溫組差異均不顯著(P＞0．05);血漿總蛋白熱應激24 h后，熱應激組顯著降低(P＜0．05)，熱應激48、72 h后組間差異不顯著(P＞0．05);血漿甘油三酯和膽固醇的含量變化基本一致，熱應激24、48、72 h后熱應激組均顯著或極顯著高于適溫組(P＜0．05或P＜0．01);谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)的活性熱應激24和48 h后顯著或極顯著低于適溫組(P＜0．05或P＜0．01)，熱應激72 h后2組間差異不顯著(P ＞0．05);谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活性熱應激24、48、72 h后顯著或極顯著高于適溫組(P ＜0．05或 P ＜0．01)。

2．3 急性持續(xù)熱應激兔血漿電解質(zhì)含量的變化 由表3可知，熱應激組72 h后Na+含量極顯著低于適溫組(P＜0．01)，Cl－含量熱應激24、48 h 后高于適溫組(P ＜0．05)，血漿游離鈣(iCa)含量熱應激組48 h后顯著低于適溫組(P＜0．05);血漿 Na+、K+、Cl－、iCa2+含量其他時間點 2 組間差異均不顯著(P ＞0．05)。

3 討論

3．1 急性持續(xù)熱應激對兔血細胞數(shù)量的影響 研究表明，在35℃持續(xù)熱應激72 h內(nèi)，白細胞數(shù)和中性粒細胞數(shù)呈先升高，然后恢復正常，淋巴細胞在前中期變化不大，72 h后呈降低趨勢，而整個試驗期間血小板數(shù)均呈極顯著升高的趨勢;細胞比率變化方面，淋巴細胞比率早期降低，中后期恢復穩(wěn)定，中性粒細胞比率前中期基本穩(wěn)定，后期顯著升高。白細胞數(shù)、中性粒細胞和淋巴細胞作為機體防御免疫細胞，是機體非特異和特異性免疫的關(guān)鍵細胞，急性持續(xù)熱應激72 h內(nèi)引起其數(shù)量的變化趨勢，一定程度上說明急性熱應激早期機體非特異免疫呈增強趨勢。但是隨著熱應激時間的持續(xù)，特異免疫機能可能受到一定程度的抑制，其原因可能與隨著熱應激的延長，腎上腺皮質(zhì)機能亢進、糖皮質(zhì)激素分泌增加和抑制淋巴細胞的生成有關(guān)［5－6］。成年兔急性持續(xù)熱應激72 h內(nèi)，血小板數(shù)量顯著升高，可能與兔處于急性高溫環(huán)境導致機體脫水及血液循環(huán)功能增強有關(guān)，但這種變化在熱應激中的生物學意義有待深入研究。該試驗中兔血細胞數(shù)量的變化趨勢與其他報道［7－8］存在一定差異，可能與熱應激的方式及持續(xù)時間長短有關(guān)。

表2 急性持續(xù)熱應激兔血漿生化指標的變化

表3 急性持續(xù)熱應激兔血漿電解質(zhì)含量的變化

3．2 急性持續(xù)熱應激對兔血液生化指標的影響 研究表明，在35℃持續(xù)急性熱應激72 h內(nèi)，兔血糖水平呈降低的趨勢，血漿總蛋白含量早期顯著降低，中后期趨于穩(wěn)定，血漿甘油三酯、膽固醇含量及GPT活性顯持續(xù)升高，而GOT活性呈降低趨勢。動物處于急性持續(xù)熱應激狀態(tài)時，機體采食量降低，耗氧增加，分解代謝加快，能量釋放增加，導致血糖及血漿蛋白降低，說明在飲水或飼料中適當添加葡萄糖及蛋白含量對于提高動物抗熱應激能力是必須的。甘油三酯和膽固醇是血脂的主要成分，血脂含量的高低反映了機體脂類代謝水平。該試驗結(jié)果表明兔血漿甘油三脂及膽固醇含量熱應激72 h內(nèi)持續(xù)升高，其原因可能是在熱應激狀態(tài)下，由于動物采食量下降，營養(yǎng)攝人不足，脂肪組織中脂肪的動員作用加強，儲存在脂肪組織中的甘油三酯和膽固醇會快速釋放入血漿，導致甘油三酯和膽固醇含量的持續(xù)上升。該試驗結(jié)果與劉梅等［9］的報道基本一致。谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)和GPT主要存在于肝細胞和心肌細胞內(nèi)，正常時其細胞內(nèi)濃度高于血清1 000～3 000倍，如GOT和GPT血清活性高于生理水平，往往表示肝細胞受損，臨床檢測血清GOT和GPT活性已成為解肝功能受損程度最敏感的檢測指標［10］。該試驗條件下GPT活性極顯著持續(xù)升高，說明急性持續(xù)熱應激對肝臟有較

強的損傷效應，其原因可能與熱應激時機體耗氧增加，自由基生成增多，對肝細胞的損害加劇有關(guān)［11］，但GOT活性降低的原因還有待進一步研究。有人認為，這可能是短期熱應激時胰島素分泌下降，使肌纖維等細胞膜的通透性降低，GOT釋放到血液的量減少的緣故［12］。

3．3 急性持續(xù)熱應激對兔血漿電解質(zhì)的影響 該試驗結(jié)果表明血清 Cl－含量增加，與劉思當?shù)龋?3］和郭長江等［14］的報道基本一致，血清Cl－含量升高的原因除與采食量減少、飲水量增加有關(guān)外，還與急性熱應激機體發(fā)生呼吸性堿中毒時，血液中的HCO3－進入細胞內(nèi)與血清Cl－進行交換，導致血清Cl－含量增加有關(guān);兔血漿游離鈣(iCa2+)濃度降低，與李建國［15］和 Teeter等［16］報道相似，其原因可能與動物熱應激時代謝性有機酸產(chǎn)生增加與Ca2+結(jié)合，從而導致血液中iCa2+濃度下降，也可能是熱應激采食量降低，引起Ca2+攝入不足，干擾小腸粘膜上皮對Ca2+的轉(zhuǎn)運等原因所致［17］;Na+和K+是維持體液滲透壓、神經(jīng)肌肉興奮性及細胞外液容量的重要成分。該試驗結(jié)果表明熱應激24和48 h后血Na+和K+變化不明顯，但熱應激72 h后Na+顯著降低，可能與機體較長時間采食量下降導致機體攝入量不足及機體通過汗液等其他途徑排出增多有關(guān)。這說明夏季高溫時適當補充電解質(zhì)Na+和Ca2+等對于維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和提高機體的抗熱應激能力有重要作用。

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