家兔自然感染戊型肝炎病毒的動(dòng)態(tài)觀察

李 軍，張宏馨，廉海晨，周艷春，耿彥生

家兔自然感染戊型肝炎病毒的動(dòng)態(tài)觀察

李 軍，張宏馨，廉海晨，周艷春，耿彥生

目的 了解自然條件下家兔感染戊型肝炎病毒(HEV)的方式和感染標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)變化。方法 對(duì)養(yǎng)兔場(chǎng)28 d齡家兔斷乳、分籠飼養(yǎng)，每周1次采集糞便檢測(cè)HEV RNA，糞便HEV RNA轉(zhuǎn)為陽性的家兔，每周采集靜脈血，所有家兔每滿1月齡時(shí)采集靜脈血，進(jìn)行血清HEV RNA、抗HEV-Ab及轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)，動(dòng)態(tài)觀察各種指標(biāo)的變化直至家兔滿5個(gè)月齡出欄。結(jié)果 共對(duì)47只家兔追蹤觀察，7周至5個(gè)月齡的10只家兔(21.3%，10/47)糞便中檢測(cè)到HEV RNA，排毒時(shí)間在3～10周以上；其中7只家兔(14.9%，7/47)形成了病毒血癥，病毒血癥的出現(xiàn)晚于糞便排毒1～3周，持續(xù)時(shí)間為2～5周；至出欄時(shí)共有11只家兔(23.4%，11/47)轉(zhuǎn)化為抗HEV-Ab陽性?；蛐蛄蟹治鲲@示HEV分離株均為兔HEV。結(jié)論 家兔從斷乳到出欄的整個(gè)生長(zhǎng)過程均對(duì)HEV均易感。家兔糞便排出病毒的時(shí)間比病毒血癥持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，但有家兔出欄時(shí)還處于病毒血癥時(shí)期，因而家兔糞便及肉類制品可能具有傳播兔HEV的危險(xiǎn)性。

戊型肝炎病毒；家兔；兔HEV；自然感染

戊型肝炎病毒 ( Hepatitis E Virus, HEV ) 是戊型肝炎的病原體。大量證據(jù)表明自然界存在HEV的動(dòng)物宿主，HEV能夠由動(dòng)物傳播給人，戊型肝炎是一種人獸共患病[1]。目前已經(jīng)從豬、野豬、鹿、家兔、老鼠、蝙蝠、駱駝以及禽類等動(dòng)物中分離到了HEV或HEV類似病毒。來源于不同種屬動(dòng)物的HEV的基因序列差異很大，宿主范圍不同。已確認(rèn)能夠感染人類的HEV有四種基因型，即1-4型：基因1和2型HEV只感染人，而3和4型HEV既感染人也感染豬等動(dòng)物[1]。我國(guó)各地近年來戊型肝炎多為散發(fā)病例，分離到的病毒主要為4型和少量3型HEV，這些散發(fā)病例可能與動(dòng)物HEV的傳播有關(guān)[2-3]。

2009年首次在家兔中分離到HEV，稱為兔HEV，其基因序列與HEV 1～4型中的基因3型最接近，全長(zhǎng)基因組核苷酸序列相同性為78%～81%，被認(rèn)為屬于3型HEV 的一個(gè)變種[4-5]。由于兔HEV是新發(fā)現(xiàn)的病毒株，其傳播方式、宿主范圍及致病特點(diǎn)等都有待深入研究。本研究是對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)剛剛斷乳、分籠飼養(yǎng)的家兔進(jìn)行前瞻性研究，通過動(dòng)態(tài)觀察糞便和血液中HEV RNA及血清中特異性抗HEV抗體(HEV-Ab)等指標(biāo)的變化，了解飼養(yǎng)過程中家兔感染HEV的情況及感染的發(fā)展過程。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 2013年4-10月在河北省的一個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行家兔HEV感染情況的定群前瞻性觀察。由7只母兔生產(chǎn)的7窩共47只按照養(yǎng)兔場(chǎng)的常規(guī)方法進(jìn)行飼養(yǎng)，4周齡時(shí)(28 d左右)家兔停止母乳喂養(yǎng)，分籠飼養(yǎng)。每周1次取家兔糞便樣本進(jìn)行HEV RNA檢測(cè)，若出現(xiàn)陽性，則每周采集糞便的同時(shí)采集血液樣本，其余家兔每當(dāng)滿1、2、3、4和5個(gè)月齡時(shí)采血，血液樣本分離血清，進(jìn)行HEV RNA、HEV-Ab及轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)。所有家兔連續(xù)觀察至5個(gè)月出欄，出現(xiàn)HEV感染標(biāo)志物的家兔至少觀察10周。

1.2 抗HEV Ab的檢測(cè) 應(yīng)用北京萬泰生物藥業(yè)股份公司生產(chǎn)的“戊型肝炎病毒抗體(HEV-Ab)酶聯(lián)免疫診斷試劑盒(雙抗原夾心法)”，按照說明書進(jìn)行檢測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)S/CO = 測(cè)定的樣品OD值/Cutoff值(臨界值)，S/CO>1為陽性。

1.3 HEV RNA 的檢測(cè) 應(yīng)用北京全式金生物有限公司的“EasyPure Viral DNA/RNA Kit”，按照試劑盒說明書從200 μL血清或糞便樣品中提取病毒RNA，用50 μL純水對(duì)所提取的RNA進(jìn)行回收。取10 μL RNA提取物，應(yīng)用全式金TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒，使用隨機(jī)引物合成基因組cDNA(第一鏈)，反應(yīng)條件為42 ℃，30 min。 取第一鏈進(jìn)行cDNA套式PCR(Nested-PCR)擴(kuò)增，外側(cè)引物為：HEV-cs (5′-TCG CGC ATC ACM TTY TTC CARAA-3′) 和 HEV-cas (5′-GCC ATG TTC CAG ACD GTR TTC CA-3′); 內(nèi)側(cè)引物為: HEV-csn(5′-TGT GCT CTG TTT GGC CCN TGG TTY CDG-30)和HEV-casn (5′-CCA GGC TCA CCR GAR TGY TTC TTC CA- 3′)[6]，PCR反應(yīng)條件與以前報(bào)道相同[7]。擴(kuò)增片段282 bp，位于HEV基因組ORF1區(qū)域。

1.4 HEV的基因序列測(cè)定及序列分析：應(yīng)用上述PCR內(nèi)側(cè)引物對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向序列測(cè)定，PCR產(chǎn)物純化及測(cè)序由北京六合華大生物技術(shù)公司完成。應(yīng)用 Clustal W2和Mega5.2 軟件，將本研究分離到的HEV序列與GenBank中有代表性的HEV基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，同一指標(biāo)組間率的比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同月齡家兔HEV的感染情況 家兔滿1個(gè)月分籠，初次采集糞便和血液樣本。糞便和血清中均未檢測(cè)到HEV RNA。但16只(34%，16/47)家兔抗HEV-Ab為陽性，S/CO值在1.12-4.85之間。

1只家兔6周齡時(shí)首次在糞便中檢測(cè)到HEV RNA，是排出病毒最早的家兔。在1～2、2～3、3～4和4～5個(gè)月齡時(shí)，分別有2、3、3和2只家兔糞便HEV RNA轉(zhuǎn)化為陽性；在這幾個(gè)時(shí)間段內(nèi)血清HEV RNA轉(zhuǎn)為陽性的家兔分為0、2、3和2只(表1)。除外0～1個(gè)月(哺乳期)，不同月齡家兔新發(fā)生感染率沒有明顯差異。

家兔滿2月齡時(shí)進(jìn)行血清HEV-Ab檢測(cè)，只有1只為陽性，由此可以推測(cè)1月齡時(shí)血清中HEV-Ab來源于母體，到2月齡時(shí)已消失。到3、4和5個(gè)月齡時(shí)，分別有3、4和3只家兔的血清HEV-Ab由陰性轉(zhuǎn)化為陽性(表1)。

表1 47只家兔在不同月齡時(shí)HEV感染發(fā)生的情況

2.2 家兔糞便和血清中HEV RNA的動(dòng)態(tài)變化 在47只家兔中，有10只(21.3%，10/47)在糞便中檢測(cè)到HEV RNA，其中7只(14.9%，7/47)轉(zhuǎn)化為病毒血癥。這7只家兔中，6只血清檢測(cè)到HEV RNA的時(shí)間比糞便晚1～3周，只有1只血清和糞便中同時(shí)檢測(cè)到HEV RNA。家兔病毒血癥持續(xù)時(shí)間在1～5周，而糞便排毒時(shí)間比較長(zhǎng)，2只家兔(R3-2和R4-1)糞便HEV RNA連續(xù)陽性超過10周，另外5只糞便排毒持續(xù)2～8周(表2)。

另有3只家兔(編號(hào)為R4-2、R4-4和R5-2)糞便連續(xù)檢測(cè)到HEV RNA，但血清中未檢測(cè)到HEV RNA(表2)。

表2 自然感染HEV家兔糞便排出病毒和病毒血癥的情況

2.3 家兔血清中抗HEV-Ab的動(dòng)態(tài)變化 感染HEV形成病毒血癥的7只家兔，血清HEV-Ab的動(dòng)態(tài)變化曲線基本相同：檢測(cè)到HEV RNA的0-1周后血清HEV-Ab均轉(zhuǎn)為陽性，2～4周后HEV-Ab濃度達(dá)到最高值，HEV-Ab在高水平持續(xù)數(shù)周。只有糞便排毒而未形成病毒血癥的3只家兔中1只家兔(R4-2)在觀察期內(nèi)未檢測(cè)到HEV-Ab，另2只血清出現(xiàn)了抗體(R4-4和R5-2)，但S/CO值較低(圖1)。

有2只家兔(RA1和RA2)血清和糞便中均未檢測(cè)到HEV RNA，但分別在2個(gè)和4個(gè)月齡時(shí)血清中出現(xiàn)HEV-Ab，但隨時(shí)間延HEV-Ab的S/CO未見明顯升高(圖1)。

2.4 HEV病毒株基因序列分析 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，獲得ORF1區(qū)域282 bp的基因片段。經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)同一只家兔的血液和糞便樣本中所獲得的基因序列相同，來源于10只家兔的HEV有4個(gè)不同序列，代表4個(gè)病毒株(圖2)。在基因遺傳進(jìn)化樹中，這些新序列與GenBank中已知的兔HEV排列在一起，形成基因3型HEV中的一個(gè)分支(圖2)。

3 討 論

在我國(guó)，家兔一種重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，飼養(yǎng)普遍，與人類接觸密切。流行病學(xué)調(diào)查顯示，不同地區(qū)、不同種系的家兔中均有HEV感染[8]。由于兔HEV基因序列與感染人的基因3型HEV最接近，具有潛在的感染人的可能性。為了解家兔通過自然途徑感染HEV的發(fā)生及發(fā)展過程，本文選擇HEV感染率較高的養(yǎng)兔場(chǎng)進(jìn)行前瞻性定群研究，對(duì)普通環(huán)境下飼養(yǎng)的47只家兔從分欄到出欄的整個(gè)生長(zhǎng)期進(jìn)行跟蹤觀察。

The ELISA OD values are plotted over weeks after the presence of detectable HEV-Ab in rabbits RA1 and RA2 and the onset of faecal virus shedding in other rabbit.

圖1 自然感染HEV的家兔血清抗HEV-Ab的動(dòng)態(tài)變化

Fig.1 Seroconversion in rabbits naturally infected with HEV

The tree was constructed using the Neighbor-Joining method by Mega 5.2 software. The scale bar indicating the number of character state changes is proportional to the genetic distance. Hepatitis E virus isolates from this study are indicated by black triangle.

圖2 新檢測(cè)的兔HEV基因序列的遺傳進(jìn)化分析

Fig.2 Phylogenetic tree of hepatitis E virus isolates based on partial ORF1 sequences (282 nt)

研究發(fā)現(xiàn)，除1個(gè)月齡內(nèi)(哺乳期)的家兔糞便中均未檢測(cè)到HEV，在2、3、4 及5個(gè)月齡時(shí)，均有家兔糞便HEV RNA由陰性轉(zhuǎn)為陽性，糞便中檢測(cè)出HEV RNA的最小家兔為7周齡，而有2只家兔在4～5月齡時(shí)糞便中開始檢測(cè)到病毒，表明從斷乳到出欄的整個(gè)生長(zhǎng)過程中家兔對(duì)HEV均易感。這個(gè)結(jié)果提示，出欄時(shí)的家兔仍可能處于病毒血癥時(shí)期，從而使屠宰后的兔肉帶有病毒。

到5月齡出欄時(shí)，47只家兔中共有12只檢測(cè)到HEV RNA或HEV-Ab，表明25.5%(12/27)的家兔可能有HEV 感染，與前期對(duì)家兔感染的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果[4,7-8]一致。本研究通過連續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)兔HEV感染有3種情況： 1)7只家兔感染后形成病毒血癥； 2)3只家兔感染后，只有糞便排毒而沒有形成病毒血癥。其中3只家兔血清抗體轉(zhuǎn)為陽性，另1只觀察10周未見抗體產(chǎn)生； 3)2只家兔血清抗體陽性，血清和糞便中均未檢測(cè)到HEV RNA。最近，有學(xué)者以兔HEV作為動(dòng)物模型，通過靜脈注射的方式使家兔感染HEV進(jìn)行不同目的研究[5,9-10], 在這些研究中HEV感染通常表現(xiàn)為第一種形式，即出現(xiàn)病毒血癥和糞便排毒。家兔自然感染HEV展現(xiàn)出了更為復(fù)雜多樣的形式和過程。第二種情況的家兔值得注意，由于沒有形成病毒血癥(或未到檢出水平)，血清HEV-Ab產(chǎn)生量低，可能會(huì)延緩對(duì)病毒的清除，使HEV能夠以低水平在家兔體內(nèi)長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

在形成病毒血癥的家兔中，感染標(biāo)志物出現(xiàn)的順序依次為糞便HEV RNA、血清HEV RNA和血清HEV-Ab。家兔糞便中HEV RNA出現(xiàn)較早，消失晚，糞便排毒時(shí)間明顯比病毒血癥時(shí)間長(zhǎng)，有2只家兔排出病毒時(shí)間甚至超過10周。由于家兔糞便中含有病毒，當(dāng)兔籠、吸水瓶等器具被糞便污染后，通過器具交換使用，使HEV能夠在家兔-家兔之間進(jìn)行傳播。而飼養(yǎng)員在工作中經(jīng)手接觸家兔糞便也可能引起HEV從家兔-人的傳播。家兔長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)排毒，增加了飼養(yǎng)過程中兔HEV從家兔-家兔，以及從家兔-人的傳播的可能性。

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Dynamic observation of rabbits naturally infected with hepatitis E virus

LI Jun,ZHANG Hong-xin,LIAN Hai-chen,ZHOU Yan-chun,GENG Yan-sheng

(HebeiUniversity,Baoding071000,China)

To determine the pattern of hepatitis E virus (HEV) infection and the dynamic changes of the biological markers indicating the infection in naturally infected framed rabbits, a total of 47 weaned rabbits of age 4 weeks in a farm were studied. Feces of the rabbits were collected and HEV RNA detection was conducted weekly. Blood samples were collected monthly from the non-infected rabbits, while weekly from the rabbits with viral faecal virus shedding. HEV RNA and anti HEV-Ab were detected in all serum samples. The rabbits were monitored to slaughter at 5 months of age, and the rabbits with the presence of HEV infection markers were observed for at least 10 weeks. HEV RNA was firstly detected in feces at 7 weeks of age. Totally 10 rabbits (14.9%, 7/47) shed HEV in feces at 2-5 months of age, and 7 rabbits (21.3%, 10/47) developed viraemia. The durations of viraemia were 2-5 weeks, but in contrast the durations of faecal virus shedding were 3 to more than 10 weeks. Seroconversion occurred in 9 of the 10 rabbits with faecal virus shedding and in 2 rabbits with undetectable HEV in feces or serum. Sequence analysis of the PCR amplicons showed that all HEV isolates in this study clustered with known rabbit HEV strains. In conclusion, farmed rabbits are susceptible to HEV infection in the growth period from weaning to slaughter. The durations of virus excretion by faecal shedding are longer than viraemia. Therefore, the rabbit feces and the contaminated meat may have risks to transmit HEV.

hepatitis E virus; farmed rabbit; rabbit HEV; natural infection

Geng Yan-sheng, Email:ysgeng09@hotmail.com

河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.12277726)

耿彥生，Email:ysgeng09@hotmail.com

河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部，保定 071000

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.07.020

R373

A

1002-2694(2015)07-0687-04

2014-10-28；

2015-05-18

Supported by the Natural Science Foundation of Hebei Province (No. 12277726 )