腸炎沙門菌ΔspiCΔcrp基因工程疫苗候選株的構(gòu)建

曾 玲，李寶利，嚴素惠，潘志明，耿士忠，焦新安

腸炎沙門菌ΔspiCΔcrp基因工程疫苗候選株的構(gòu)建

曾 玲，李寶利，嚴素惠，潘志明，耿士忠，焦新安

目的 構(gòu)建腸炎沙門菌ΔspiCΔcrp雙基因缺失株，以探索其作為新型基因工程疫苗的可能性。方法 以等位基因同源重組方法，在構(gòu)建單基因缺失腸炎沙門菌ΔspiC基礎(chǔ)上，運用λRed重組酶系統(tǒng)構(gòu)建雙基因缺失株腸炎沙門菌ΔspiCΔcrp。結(jié)果 PCR和抗生素抗性結(jié)果表明腸炎沙門菌ΔspiCΔcrp成功構(gòu)建；生物學(xué)鑒定顯示，與野生菌相比，其生長速度與生化特性發(fā)生了變化，LD50提高約1 000倍，毒力顯著降低。結(jié)論 雙基因缺失株腸炎沙門菌ΔspiCΔcrp被成功構(gòu)建，為其作為疫苗的免疫學(xué)評價奠定基礎(chǔ)。

腸炎沙門菌;crp;spiC;基因工程疫苗

腸炎沙門菌是一種重要的食源性人獸共患細菌病的致病菌，是研究較為廣泛和深入的細菌之一。該菌易引起人的胃腸炎，但是也可以引起特定個體，如幼兒、老年人等免疫低下個體的侵襲性感染和腸熱病[1]。

在家禽養(yǎng)殖業(yè)中，腸炎沙門菌可引起禽類的無癥狀隱性感染，但是在小于兩周齡的幼雛，有引起高致死率和全身系統(tǒng)性感染的暴發(fā)的可能。世界范圍內(nèi)，由腸炎沙門菌污染的禽肉蛋制品引起人類的沙門菌感染占很大比例。人類通常是由于攝入被污染的蛋類或未完全煮熟的禽肉而感染沙門菌。除了污染禽肉制品，導(dǎo)致水平感染外，腸炎沙門菌也可以經(jīng)糞便污染蛋殼，或污染卵巢[2-4]，導(dǎo)致垂直傳播。腸炎沙門菌這種特殊的傳播方式使得該菌難以控制。在美國，2010年8月以后，至少上千人感染沙門氏菌致病，調(diào)查顯示，多數(shù)病人都是食用了被沙門氏菌污染的“毒雞蛋”。美國衛(wèi)生單位回收大量雞蛋，數(shù)量達到3.8億枚，導(dǎo)致嚴重的經(jīng)濟損失。

因此，控制腸炎沙門菌經(jīng)禽類食品水平傳播給人類，需要從養(yǎng)禽業(yè)源頭做起。使用減毒活疫苗被普遍認為是較為理想的預(yù)防措施。在我國，盡管養(yǎng)禽業(yè)規(guī)模很大，對疫苗的需求很大，但對腸炎沙門菌減毒活疫苗研制仍在進行中。

本文用等位基因同源重組技術(shù)，敲除crp和spiC基因，構(gòu)建腸炎沙門菌C50041ΔspiCΔcrp雙基因缺失突變株，為研制腸炎沙門菌減毒活疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒 試驗中用到的菌株及質(zhì)粒見表1。

1.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中沙門菌基因組序列，軟件Primer5.0設(shè)計用于spiC和crp基因敲除特異性引物，如表2所示。引物由南京金思瑞生物有限公司合成。

表1 試驗用細菌和質(zhì)粒

表2 引物序列

1.3 腸炎沙門菌C50041基因組的提取 取實驗室凍存的腸炎沙門菌C50041，在DHL固體平板三區(qū)劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基，200 r/min，37 ℃培養(yǎng)過夜，試劑盒提取腸炎沙門菌C50041基因組。

1.4spiC基因的敲除 參照文獻[5-6]，構(gòu)建腸炎沙門菌C50041ΔspiC基因缺失株，運用本實驗室已經(jīng)構(gòu)建好的自殺質(zhì)粒pGMB51-ΔspiC/Km進行基因敲除，篩選卡那霉素抗性的重組菌，并命名為腸炎沙門菌C50041ΔspiC/Km。該菌并在溫度敏感性質(zhì)粒pCP20的幫助下，去除卡那霉素抗性基因KmR，并命名為腸炎沙門菌C50041ΔspiC。

1.5crp基因的敲除

1.5.1crp等位基因的構(gòu)建 參照文獻[5-6]，以腸炎沙門菌C50041基因組DNA為模板，PCR方法擴增crp基因上下游crp-U、crp-D片段作為等位基因?？寺〉絧MD-20T載體后，分別命名為pMD-crp-U和pMD-crp-D。將pMD-crp-D的520 bp crp-D片段亞克隆到pMD-crp-U質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶XhoI和Hind III位點之間。重組單菌落進行PCR和酶切鑒定，正確的重組質(zhì)粒命名為pMD-Δcrp。再將pMD-CmR質(zhì)粒中1.1 kb 氯霉素抗性基因CmR片段亞克隆到重組質(zhì)粒pMD-Δcrp限制性內(nèi)切酶XhoI位點間，重組單菌落在含氯霉素(50 μg/mL)的固體LB平板上培養(yǎng)篩選，PCR和酶切鑒定后，正確的重組質(zhì)粒命名為pMD-Δcrp/Cm。

1.5.2 C50041ΔspiCΔcrp/Cm突變株的篩選與鑒定

1.5.2.1 等位基因DNA片段的準備 以pMD-Δcrp/Cm為模板，用crp-YZ引物PCR擴增，回收純化1.7 kb的DNA片段，作為等位基因重組DNA片段。

1.5.2.2 制備誘導(dǎo)表達Red重組酶的感受態(tài)細菌 參照文獻[7]，將編碼Red重組酶系統(tǒng)的質(zhì)粒pKD46電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入腸炎沙門菌C50041ΔspiC中，L-阿拉伯糖(30 mmol/L)誘導(dǎo)表達λRed重組蛋白Exo、Bet和Gam后，制備感受態(tài)細菌。

1.5.2.3 C50041ΔspiCΔcrp/Cm的篩選與鑒定 將100 ng的等位基因重組DNA片段電轉(zhuǎn)化入100 μL感受態(tài)細菌中，涂布于含有氯霉素的 LB 平板上 37 ℃過夜培養(yǎng)，篩選氯霉素抗性重組菌，用crp-U、crp-D和crp-YZ引物PCR驗證，正確的菌落命名為C50041ΔspiCΔcrp/Cm。

1.6 腸炎沙門菌突變株的生物學(xué)特性鑒定

1.6.1 生化特性鑒定 將腸炎沙門菌突變株C50041ΔspiC、C50041ΔspiCΔcrp/Cm及野生株腸炎沙門菌C50041分別劃線接種DHL固體平板，然后挑取單菌落轉(zhuǎn)接葡萄糖、鼠李糖、木糖、麥芽糖、棉籽糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、蔗糖、賴氨酸、苯丙氨酸、氰化鉀、尿素、硫化氫、蛋白胨水、側(cè)金花醇等生化鑒定管，37 ℃培養(yǎng)過夜，進行生化鑒定。

1.6.2 生長特性鑒定 將腸炎沙門菌突變株C50041ΔspiC、C50041ΔspiCΔcrp/Cm及野生株C50041分別接種LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min振搖培養(yǎng)過夜，次日調(diào)整各菌株培養(yǎng)液濃度一致，轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，調(diào)整細菌的起始濃度為1×106CFU/mL，37 ℃，靜置培養(yǎng)，每隔2 h取樣，連續(xù)10倍稀釋，選取3個合適的稀釋度，每個稀釋度取100 μL涂布LB固體平板，各做3個重復(fù)，37 ℃培養(yǎng)過夜，平板計數(shù)，根據(jù)所獲得的細菌數(shù)計算比較細菌間的生長速度。

1.6.3 LD50測定 將腸炎沙門菌C50041ΔspiC、C50041ΔspiCΔcrp/Cm突變株及野生株C50041在液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)16 h，無菌PBS洗滌細菌并懸浮，調(diào)整細菌濃度，分別以不同的劑量肌注3日齡海蘭白蛋雞，100 μL/只，每組10只，統(tǒng)計2周內(nèi)雞的死亡數(shù)，比較突變菌株與野生菌C50041毒力的變化。

2 結(jié) 果

2.1 C50041ΔspiCΔcrp基因缺失株的PCR鑒定 運用自殺質(zhì)粒pGMB51-ΔspiC/Km及卡那霉素篩選法構(gòu)建腸炎沙門菌spiC基因缺失株，PCR及抗生素驗證結(jié)果表明C50041ΔspiC/km構(gòu)建成功。在pCP20質(zhì)粒表達的重組酶FLP作用下去除卡那霉素抗性基因后，繼續(xù)運用λRed 重組酶系統(tǒng)，在重組蛋白Exo、Bet和Gam的作用及氯霉素篩選作用下，只有基因缺失菌株C50041ΔspiCΔcrp/Cm才能生長。用驗證引物crp-YZ-F/R PCR擴增鑒定，以C50041ΔspiCΔcrp/Cm為模板，PCR擴增出約1.7 kb的產(chǎn)物，而野生菌C50041則擴增出去1.2 kb的產(chǎn)物(圖1)，與預(yù)期結(jié)果一致。

Lane M: DL2000 DNA marker;Lane 1: C50041ΔspiCΔcrp/Cm;Lane 2-5: C50041.

圖1 C50041ΔspiCΔcrp/Cm的PCR鑒定

Fig.1 Identification of C50041ΔspiCΔcrp/Cm by PCR

2.2 C50041ΔspiCΔcrp基因缺失株的基本生物學(xué)特性鑒定

2.2.1 生化特性鑒定 細菌轉(zhuǎn)接葡萄糖、鼠李糖、木糖、麥芽糖、甘露醇、衛(wèi)矛醇、山梨醇、乳糖、蔗糖、賴氨酸脫氫酶、氰化鉀、尿素、乙酰胺、七葉苷、硫化氫、蛋白胨水、側(cè)金花醇等生化鑒定管，37 ℃過夜，生化鑒定結(jié)果(表3)顯示ΔspiC突變株與野生株細菌生化特性是一致的。而ΔcrpΔspiC則在硫化氫、山梨醇、麥芽糖、木糖、鼠李糖、甘露糖特性方面發(fā)生改變。

2.2.2 生長特性比較 調(diào)整C50041ΔspiC、C50041ΔspiCΔcrp/Cm及野生株C50041細菌的起始濃度為1×106CFU/mL，37 ℃培養(yǎng)，每隔2 h取樣，涂板計數(shù)，繪制生長曲線，比較菌株之間的生長速度。如圖2，C50041ΔspiC的生長速度與野生株腸炎沙門菌C50041相比無統(tǒng)計學(xué)意義，C50041ΔspiCΔcrp/Cm與野生型腸炎沙門菌C50041相比，生長速度降低。

表3 2株腸炎沙門菌突變株及野生株C50041的生化特性比較

Tab.3 Comparison of the biochemical properties among 2 mutants and wildtype C50041

生化特性Biochemicalcharacteristics菌株(S.enterditisstrains)WildtypeΔspiCΔcrpΔspiC硫化氫(H2S)++-山梨醇(Sorbitol)++-麥芽糖(Maltose)++-木糖(Xylose)++-鼠李糖(Rhamnose)++-甘露糖(Mannose)++-葡萄糖(Glucose)+++賴氨酸脫羧酶(Lysinedecarboxylase)+++鳥氨酸脫羧酶(ornithinedecarboxylase)+++乳糖(Lactose)---蔗糖(Sucrose)---氰化鉀(KCN)---尿素(Urea)---七葉苷(Esculin)---棉籽糖(raffinose)---苯丙氨酸(phenylalanine)---枸櫞酸鹽(citrate)---側(cè)金花醇(Adonitol)---蛋白胨水(Peptonewater)---

注：“+”代表“陽性”，“-”表示“陰性”

Note: “+” means positive, “-” means negative.

圖2 突變菌株與C50041的生長曲線

2.2.3 LD50測定 將腸炎沙門菌C50041ΔspiC、C50041ΔspiCΔcrp/Cm突變株及野生株C50041分別以不同的濃度肌肉注1日齡海蘭白雛雞， 100 μL/只，每組10只，連續(xù)觀察2周，記錄死亡情況，比較突變菌株與野生菌株的毒力差異。結(jié)果如表4所示，C50041ΔspiC基因缺失株的LD50約為2.87×106CFU，C50041ΔspiCΔcrp/Cm雙基因缺失株的LD50約為5.36×106CFU， 2基因缺失株LD50比C50041野生株LD50(約為3.11×103CFU)升高了約1 000倍，毒力顯著降低。

表4 腸炎沙門菌LD50的測定

3 討 論

利用基因工程構(gòu)建減毒沙門菌作疫苗的研究備受關(guān)注，減毒菌株不僅遺傳背景明確，而且不會返毒返祖，減毒活疫苗比滅活疫苗和亞單位疫苗在預(yù)防控制沙門菌病方面更有優(yōu)勢。沙門菌活疫苗可在免疫動物體內(nèi)繁殖，持續(xù)刺激機體產(chǎn)生初次免疫應(yīng)答和再次免疫應(yīng)答[8]，可以通過自然感染途徑如口服或鼻內(nèi)接種，刺激黏膜淋巴細胞分泌SlgA，形成一道保護屏障，有效地阻止沙門菌經(jīng)黏膜感染，及其在黏膜表面的定居和對宿主細胞的侵襲[9]。

新型沙門菌的減毒活疫苗是通過基因重組工程方法將毒力相關(guān)基因敲除而獲得的。這些與毒力相關(guān)的基因主要有：多效調(diào)節(jié)基因(crp，phoP)，參與細菌結(jié)構(gòu)成分生物合成的基因(如OMP)或參與必要的代謝產(chǎn)物(如：嘌呤類、嘧啶類、組氨酸、甲硫氨酸、cAMP及芳香族氨基酸等)合成的基因，及一些毒力基因(如：沙門菌毒力島及III型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因)，特別是參與細菌抵抗宿主機制的毒力基因[10]。在本研究中，crp基因的缺失導(dǎo)致沙門菌硫化氫、山梨醇、麥芽糖、木糖、鼠李糖、甘露醇生化特性的轉(zhuǎn)變，表明crp蛋白參與并影響了這些物質(zhì)的合成。

本研究在沙門菌SPI-2 III型分泌系統(tǒng)的效應(yīng)蛋白spiC編碼基因的缺失的基礎(chǔ)上，以多效調(diào)節(jié)基因crp為突變的目的基因，結(jié)合重組自殺質(zhì)粒介導(dǎo)細菌的同源重組和λRed重組兩種方法，制備了減毒腸炎沙門菌C50041ΔspiCΔcrp/Cm突變菌。本文在使用λRed重組系統(tǒng)敲除crp基因的過程中，將兩端的同源序列加長到300-400 bp時，遠高于該系統(tǒng)同源臂50 bp的要求，使篩選過程中假陽性率有效地降低，實際篩選過程中沒有篩選到假陽性。

本研究利用同源重組技術(shù)成功構(gòu)建了腸炎沙門菌C50041的2株突變菌株，spiC基因的缺失對C50041的生化特性與生長特性無顯著影響，但crp基因缺失后C50041對多種糖類物質(zhì)的代謝情況發(fā)生改變，而且生長速度顯著下降。肌注接種1日齡海蘭白雛雞，spiC缺失株的LD50約為2.87×106CFU，C50041ΔspiCΔcrp/Cm雙缺失株的LD50約為5.36×106CFU，二缺失株之間差別不明顯，但與C50041野生株LD50(約為3.11×103CFU)相比，LD50升高了約1 000倍，毒力顯著降低。沙門菌是胞內(nèi)寄生菌，其侵入細胞和在胞內(nèi)的存活是其致病的關(guān)鍵，crp基因和spiC基因的缺失分別影響到了其通過SPI-1介導(dǎo)的侵入細胞的能力，和通過SPI-2介導(dǎo)的在巨噬細胞內(nèi)存活的能力，從而使其毒力有顯著的降低，這為后期研究其作為減毒腸炎沙門菌活疫苗的可能性奠定了重要基礎(chǔ)。

[1]Raphael S, Sharon MT, Wang JY, et al.Salmonellaentericaserovar Enteritidis core O polysaccharide conjugated to H:g,m flagellin as a candidate vaccine or protection against invasive infection withS. Enteritidis[J]. Infect Immun, 2011, 79(10): 4240-4249. DOI: 10.1128/IAI.05484-11

[2]Mickael CS, Lam PKS, Berberov EM, et al.Salmonellaentericaserovar EnteritidistatBandtatCmutants are impaired in Caco-2 Cell invasioninvitroand show reduced systemic spread in chickens[J]. Infect Immun, 2010, 78(8): 3493-3505. DOI: 10.1128/IAI.00090-10

[3]Keller LH, Benson CE, Krotec K, et al.SalmonellaEnteritidis colonization of the reproductive tract and forming and freshly laid eggs of chickens[J]. Infect Immun, 1995, 63(7): 2443-2449.

[4]Mead G, Lammerding AM, Cox N, et al. Scientific and technical factors affecting the setting ofSalmonellacriteria for raw poultry: a global perspective[J]. J Food Prot, 2010, 73(8): 1566-1590.

[5]Geng SZ, Liu NN, Jiao XA, et al. Development and identification of S06004ΔspiCmutant ofSalmonellaPullorum[J]. Chin Vet Sci, 2014, 44(4): 379-386. (in Chinese) 耿士忠, 劉男男, 焦新安,等. 雞白痢沙門菌S06004ΔspiC突變株的構(gòu)建與鑒定[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué), 2014, 44(04): 379-386.

[6]Geng SZ, Jiao XA, Pan ZM, et al.An improved method to knock out theasdgene ofSalmonellaentericaserovar Pullorum[J]. J Biomed Biotechnol, 2009, 2009: 646380. DOI: 10.1155/2009/646380

[7]Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichiacoliK-12 using PCR products[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97(12): 6640-6645.

[8]Trach DD, Cam PD, Ke NT, et al. Investigations into the safety and immunogenicity of a killed oral cholera vaccine developed in Vietnam[J]. World Health Orgam, 2002, 80: 2-8.

[9]Gunn BM, Wanda SY, Burshell D, et al. Construction of recombinant attenuatedSalmonellaentericaserovar Typhimurium vaccine vector strains for safety in newborn and infant mice[J]. Clin Vaccine Immunol, 2010, 17(3): 354-362. DOI: 10.1128/CVI.00412-09

[10]Fields PI, Swanson RV, Haidaris CG, et al. Mutants ofSalmonellatyphimuriumthat cannot survive within the macrophage are avirulent[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1986, 83: 5189-5193.

Construction of genetically engineered attenuated vaccinesSalmonellaenteritidisC50041ΔspiCΔcrp

ZENG Ling,LI Bao-li,YAN Su-hui,PAN Zhi-ming,GENG Shi-zhong,JIAO Xin-an

(KeyLaboratoryofZoonosesofJiangsuProvince,Co-InnovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)

Salmonellaenteritidisis one of the zoonotic foodborne pathogens and could infect humans mainly through contaminated poultry and egg products. To explore the possibility as new genetically engineered vaccines, the double gene-deletion strain ofSalmonellaenteritidisC50041ΔspiCΔcrpwas constructed in this study. Thecrpgene was deleted again by λ Red system on the base ofSalmonellaenteritidisΔspiCto constructSalmonellaenteritidisΔspiCΔcrp. PCR and antibiotic resistance showedSalmonellaenteritidisΔspiCΔcrphad been successfully constructed, and biological identification clarified that its growth and the biochemical properties had changed; LD50was high about 1 000 folds and virulence was significantly attenuated, comparing with wild type strain C50041. It laid an important foundation for further study ofSalmonellaenteritidisas a live attenuated vaccine.

Salmonellaenteritidis;crp;spiC; genetically engineered vaccines

Geng Shi-zhong, Email; gszhong@yzu.edu.cn

耿士忠，Email：gszhong@yzu.edu.cn

揚州大學(xué)，江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室，江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.001

R378

A

1002-2694(2015)02-0097-05

2014-04-15；

2014-09-13

863項目(No.2011AA10A212)，江蘇省博士后基金(No.1302067C)，中國博士后基金(No.2014M551670)，江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201411117058Y)聯(lián)合資助

Supported by grants from the "863" program (No. 2011AA10A212), the Jiangsu Province Postdoctoral Fund (No. 1302067C), the China Postdoctoral Fund (No. 2014M551670), and the College Students’ Innovation and Entrepreneurship Training Program of Jiangsu Province (No. 201411117058Y)