一種檢測(cè)膽螺桿菌套式PCR方法的建立

秦和平,孫 勇,葉安麗,潘信義

一種檢測(cè)膽螺桿菌套式PCR方法的建立

秦和平1,孫 勇2,葉安麗1,潘信義1

目的 建立一種敏感性高、特異性強(qiáng)的檢測(cè)膽螺桿菌的套式PCR方法。方法 基于17種膽螺桿菌亞種的16S rRNA 基因設(shè)計(jì)篩選出1套套式引物(2條內(nèi)引物、2條外引物)，優(yōu)化反應(yīng)條件后，通過(guò)模擬糞便標(biāo)本、動(dòng)物模型標(biāo)本和臨床標(biāo)本的檢測(cè)對(duì)方法的敏感性和特異性進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果 模擬糞便標(biāo)本中，該方法檢測(cè)膽螺桿菌的敏感性達(dá)到10 CFU/100 μL。3例感染膽螺桿菌的SPF級(jí)BALB/c小鼠模型中，3例小鼠糞便和盲腸中均可檢測(cè)到膽螺桿菌，1例肝臟標(biāo)本中檢測(cè)到了膽螺桿菌。10例膽石病患者中，有2例患者的膽汁、膽囊粘膜和糞便標(biāo)本中檢測(cè)到了膽螺桿菌。結(jié)論 本研究建立的套式PCR方法，敏感性高、特異性強(qiáng)，可用于檢測(cè)膽螺桿菌的感染。

膽螺桿菌； 套式PCR； 16S rRNA

1995年Fox等從自交系小鼠的膽汁、肝臟及腸道中分離出一種新的腸肝螺桿菌-膽螺桿菌(helicobacterbilis，H.bilis)[1]。它的感染會(huì)影響動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。1998年，F(xiàn)ox等在智利的研究發(fā)現(xiàn)，慢性膽囊炎患者的膽汁及膽囊粘膜中有H.bilis的DNA存在[2]。另外，一些研究則報(bào)道H.bilis的感染可能引起人腸炎[3-4]。因此，檢測(cè)H.bilis對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制和人類(lèi)消化系統(tǒng)疾病的研究意義重大。另外，隨著H.bilis亞種的不斷增多，有必要根據(jù)更新的數(shù)據(jù)庫(kù)重新設(shè)計(jì)引物。目前，核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)RDP(http://rdp.cme.msu.edu/)提供了17種H.bilis亞種的16S rRNA。本研究基于此建立一種檢測(cè)H.bilis高敏感性和特異性的套式PCR方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1H.bilis(ATCC43879)來(lái)自南方醫(yī)院消化科。

1.1.2 選取3只SPF級(jí)的BLAB/c 小鼠經(jīng)胃灌入200 μL含有H.bilis的PBS液 (107-9CFU/只)，建立感染H.bilis的動(dòng)物模型后處死(1～6 周)，取其肝臟、盲腸及糞便標(biāo)本。造模前，我們提前收集BLAB/c小鼠糞便標(biāo)本,用我們的檢測(cè)方法和文獻(xiàn)中的檢測(cè)方法(C97-C05、C97-C98)明確沒(méi)有H.bilis的感染[2,5]。整個(gè)過(guò)程經(jīng)過(guò)了南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物管理及使用委員會(huì)的同意。

1.1.3 -80 ℃保存1位健康人糞便標(biāo)本用于模擬糞便標(biāo)本。健康人指無(wú)膽石病、膽囊炎、膽囊癌、肝炎及肝癌，用我們的方法和文獻(xiàn)中的方法(C97-C05、C97-C98)檢測(cè)糞便標(biāo)本H.bilis陰性。

1.1.4 本研究納入10位因膽石癥擬行膽囊切除術(shù)的患者，患者近4周未服用以下藥物：H2組胺受體阻斷劑、抗生素、質(zhì)子泵抑制劑、鉍劑。術(shù)前留取糞便標(biāo)本，術(shù)后留取膽汁、膽囊粘膜標(biāo)本，均保存于-80 ℃冰箱內(nèi)。

1.2 方法 用DNAMAN8.0(序列分析比對(duì)軟件包)分析比對(duì)17種H.bilis亞種的16S rRNA，確定保守區(qū)和可變區(qū)。Primer Primier6.0(引物設(shè)計(jì)軟件)設(shè)計(jì)引物，OLIGOU7.0(引物設(shè)計(jì)評(píng)估軟件)分析、評(píng)估，選取最優(yōu)引物。

表1 17種膽型螺旋桿菌亞種的16S rRNA

表2 本研究設(shè)計(jì)的套式引物序列及反應(yīng)條件

1.2.2H.bilis菌株密集劃線(xiàn)接種在空腸彎曲菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基，添加5%～10%凍融脫纖維羊血，微需氧條件下(5% O2，85% N2和10% CO2) 37 ℃培養(yǎng)3～7 d。

1.2.3 細(xì)菌基因組DNA的提取使用Qiagen RNA/DNA Mini Kit (Qiagen Inc.德國(guó))，糞便、膽汁及組織DNA的提取使用QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen Inc.德國(guó))。

1.2.4 PCR擴(kuò)增體引物(如表2 所示)由華大基因公司合成。兩輪反應(yīng)的預(yù)變性條件均為94 ℃ 3 min，終止反應(yīng)條件均為72 ℃7 min。第一輪反應(yīng)：PCR 反應(yīng)體系為50 μL，2×Premix Taq 25 μL，上、下游引物各1 μL (0.2 mmol/L)，模板5 μL，無(wú)菌去離子水補(bǔ)足至50 μL，30個(gè)循環(huán)；第二輪反應(yīng)：PCR 反應(yīng)體系為50 μL，2×Premix Taq 25 μL，上、下游引物各1 μL (0.2 mmol/L)，第一步PCR產(chǎn)物稀釋100倍后取1 μL作為模板，無(wú)菌去離子水補(bǔ)足至50 μL，30個(gè)循環(huán)，最后PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物測(cè)序由華大基因公司負(fù)責(zé)(美國(guó)ABI公司的3730XL測(cè)序分析儀，Bigdye V3.1 Mix kit， POP7測(cè)序膠，PCR產(chǎn)物原液經(jīng)柱純化后單向測(cè)序)。為避免假陽(yáng)性和假陰性條帶，我們從提取DNA到PCR擴(kuò)增設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照(H.bilis)和陰性對(duì)照(雙蒸水)。

1.2.5 模擬糞便標(biāo)本的敏感性檢測(cè)使用比濁儀調(diào)整菌液至0.5麥?zhǔn)蠁挝唬?約相當(dāng)于1.5×107CFU/100 μL，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行稀釋?zhuān)Q(chēng)取健康人糞便0.2 g/管，加入0.7 mL PBS，加入各稀釋度的菌液0.1 mL混勻，制備成一定的菌懸液模擬標(biāo)本，最終菌液濃度分別為106、105、104、103、102、10、1 CFU/100 μL， 陰性對(duì)照加入0.8 mL 的PBS，上述的各稀釋度與糞便標(biāo)本混勻，1 000 r/min 離心10 min，把上清轉(zhuǎn)入另一個(gè)離心管中，12 000 r/min離心10 min，離心后棄上清，用試劑盒提取DNA，用建立好的PCR方法檢測(cè)各稀釋度的標(biāo)本。

2 結(jié) 果

我們?cè)O(shè)計(jì)的套式PCR法檢測(cè)模擬糞便標(biāo)本的最低濃度達(dá)到了10 CFU/100μL。它不僅能檢測(cè)出小鼠糞便標(biāo)本、肝臟和盲腸標(biāo)本的H.bilis,而且在2例膽石病患者的膽囊膽汁、膽囊粘膜及糞便標(biāo)本中也檢測(cè)出了H.bilis。這種對(duì)H.bilis特異的套式PCR法于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制和人感染H.bilis的研究意義重大。

2.1 模擬糞便標(biāo)本的敏感性檢測(cè) 以10倍梯度稀釋制備的糞便模擬標(biāo)本，提取DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 可以檢測(cè)的最低菌液濃度為10CFU/100 μL(圖1)。

2.2 3只SPF級(jí)BALB/c小鼠造模前后糞便標(biāo)本的檢測(cè)。造模后3例糞便標(biāo)本中檢測(cè)到了334 bp的特異條帶，測(cè)序后比對(duì)為H.bilis的16S rDNA部分片段(圖2)。

2.3 3只SPF級(jí)BALB/c小鼠造模后，1例肝臟標(biāo)本和3例盲腸標(biāo)本均檢測(cè)到了334 bp的特異條帶，測(cè)序后比對(duì)為H.bilis的16S rDNA部分片段(圖3)。

2.4 10例膽石病患者中，2例患者的膽汁(圖4-A)、膽囊粘膜(圖4-B)及糞便(圖4-C)標(biāo)本中均檢測(cè)到了334 bp的特異條帶，測(cè)序后比對(duì)為H.bilis的16S rDNA部分片段。

Tenfold dilutions of pure bacterial culture were spiked into healthy human stool, and nested PCR was performed by using the extracted DNA from contaminate stool.

M:markers (Omega Marker DL-2000); PC:positive control; NC:negative control; 1:106CFU/100 μL; Lane 2:105CFU/100 μL; 3:104CFU/100 μL; 4:103CFU/100 μL; 5:102CFU/100 μL; 6:10CFU/100 μL; 7:1 CFU/100 μL.

圖1 基于H.bilis16s rDNA的特異性套式PCR法敏感性檢測(cè)

Fig.1 Sensitivity of detection ofH.bilis-specific 16s rDNA gene by the nested PCR

M:markers (Omega Marker DL-2000); PC:positive control; NC:negative control; 1 to 3:mice uninfected withH.bilis; 4 to 6:mice infected withH.bilis.

圖2 套式PCR法檢測(cè)造模前后小鼠的糞便標(biāo)本

Fig.2 Nested PCR amplification of DNA extracted from feces samples from uninfected control and infected mice

3 討 論

H.bilis是一種重要的腸肝螺桿菌，小鼠是其自然宿主。它主要定植于小鼠的肝膽系統(tǒng)，也可下行至小鼠的結(jié)腸，可導(dǎo)致小鼠慢性肝炎、膽囊炎及慢性腸炎，影響動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果[1]。Maurer等的研究發(fā)現(xiàn)H.bilis感染與小鼠膽石癥的發(fā)生相關(guān)[6]，為我們研究人類(lèi)膽石病提供了一種很好的模型。兩份來(lái)自亞洲的研究發(fā)現(xiàn)，亞洲人群中膽管癌和膽囊癌的粘膜標(biāo)本中H.bilis的陽(yáng)性率非常高[7-8]。Okoli等的研究也提示人類(lèi)原發(fā)性肝癌的發(fā)生中H.bilis和HCV病毒有協(xié)同作用[9]。因此，研究H.bilis的意義重大。

M:markers (Omega Marker DL-2000); PC:positive control; NC:negative control; 1 to 3:liver samples; 4 to 6:ceacum samples.

M:markers (Omega Marker DL-2000); PC:positive control; NC:negative control; 1 to 10:ten patients with cholelithiasis.

Fig.4 Nested PCR amplification of DNA extracted from biles (A), cholecyst mucous membranes (B) and feces (C) samples from patients with cholelithiasis

但H.bilis是苛養(yǎng)菌，培養(yǎng)條件和設(shè)備要求高，培養(yǎng)法敏感性差。血清學(xué)檢查要在培養(yǎng)法基礎(chǔ)上取得抗原，而且多是基于多克隆抗體，假陽(yáng)性率高。因此，PCR及測(cè)序是檢測(cè)H.bilis的金標(biāo)準(zhǔn)[1]。16S rDNA 因其序列高度保守，長(zhǎng)度適宜，被大多數(shù)研究人員作為首選靶序列。但臨床標(biāo)本PCR檢測(cè)的敏感性和特異性受到體內(nèi)細(xì)菌的和人體組織DNA的影響，容易出現(xiàn)錯(cuò)配，常出現(xiàn)假陰性的結(jié)果[10]。套式PCR有內(nèi)外兩對(duì)引物，通過(guò)2輪特異性擴(kuò)增，可以很大程度上減少錯(cuò)配的出現(xiàn)，提高檢測(cè)H.bilis的敏感性和特異性。

本研究根據(jù)最新的RDP數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)計(jì)并建立了一種套式PCR方法。模擬糞便標(biāo)本的環(huán)境富含腸道細(xì)菌和少量人體的DNA。這種環(huán)境下，該檢測(cè)方法的敏感性可達(dá)到10 CFU/100 μL。感染H.bilis的3只BALB/c小鼠模型中，雖然只有1例小鼠肝臟標(biāo)本中檢測(cè)到了H.bilis，但3例小鼠的盲腸及糞便標(biāo)本中都檢測(cè)到了H.bilis，原因可能是H.bilis逆行感染肝膽需要的時(shí)間更長(zhǎng)。另外，我們還用這種方法檢測(cè)了10例膽石病患者的膽汁、膽囊粘膜及糞便標(biāo)標(biāo)本。術(shù)前提前凍存的糞便標(biāo)本有2例檢測(cè)到了H.bilis；術(shù)后也是這2例患者的膽汁和膽囊粘膜標(biāo)本中檢測(cè)到H.bilis。綜上所述，該方法檢測(cè)H.bilis敏感性高，特異性強(qiáng)，對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制和研究H.bilis感染對(duì)人疾病的影響意義重大。

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Development of a nested PCR assay for detection ofHelicobacterbilis

QIN He-ping1,SUN Yong2,YE An-li1,PAN Xin-yi1

(1.LiuzhouPeople’sHospital,Liuzhou545006,China;2.NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

In this study, the objective is to establish a nested-PCR assay for the detection ofH.biliswith high sensitivity and specificity. The nested primers were designed based on sequences of 16S rRNA gene of seventeen subtypes ofH.bilis. After optimizing reaction condition, the sensitivity and specificity of the assay were examined via the detection of feces simulated samples, mice infection model samples and clinic patients’ samples. The detection sensitivity ofH.bilisstrain for feces simulated samples was 10 CFU/100 μL.H.biliswas successfully detected in the liver, caecum and feces of experimentally infected mice. Moreover,H.biliswas successfully detected in the bile, cholecyst mucous membrane and feces samples from two of ten patients with cholelithiasis. Due to the PCR assay’s high sensitivity and specificity, the method may be used to detect the infection ofH.bilis.

H.bilis; nested PCR assay; 16S rRNA

Pan Xin-yi, Email:panxinyilz@126.com

廣西省衛(wèi)生廳基金項(xiàng)目(No.Z2013651)；柳州市人民醫(yī)院“碩博醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究啟動(dòng)基金”項(xiàng)目(No.lryjj201408)

潘信義，Email：panxinyilz@126.com

1.柳州市人民醫(yī)院醫(yī)療保健部一病區(qū)，柳州 545006； 2.南方醫(yī)院消化內(nèi)科，廣州 510515

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.10.010

R378.99

A

1002-2694(2015)10-0943-04

2015-01-30；

2015-07-31

Funded by the Health Department Fund Project of Guangxi Province (No. Z2013651) and the Foundation Medicine Research Fund for Graduate in Liuzhou People’s Hosptial (No. lryjj201408)