三維熒光光譜(3D-EEM)技術(shù)在溶解性有機(jī)質(zhì)(DOM)分析中的應(yīng)用

朱大偉，武道吉，孫翠珍，張志斌

(山東建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250101)

DOM的傳統(tǒng)分析方法通過離子交換樹脂富集后利用核磁共振、紅外光譜等進(jìn)行分析。采用離子交換樹脂法可以對DOM所有組分進(jìn)行完全的分離，相關(guān)操作模擬自然生態(tài)條件進(jìn)行，但對DOM濃度小于5 mg/L的水樣存在一定的局限性［5］，且重復(fù)使用樹脂可能得不到疏水酸性物質(zhì)(HPOA)，分離組分中也可能會含有微量的雜質(zhì)［6］，整個試驗過程冗長、樣品消耗量大，分析過程較為復(fù)雜。

目前，隨著儀器分析技術(shù)的發(fā)展，科研人員從光譜學(xué)領(lǐng)域出發(fā)，逐步推廣采用光譜技術(shù)對DOM進(jìn)行試驗分析。與傳統(tǒng)分析方法相比，三維熒光光譜靈敏度高，比一般分析方法高出2～3個數(shù)量級，選擇性較好［7］，樣品消耗量小且不破壞樣品結(jié)構(gòu)，采用該技術(shù)分析水樣中DOM效果顯著。

1 三維熒光光譜技術(shù)機(jī)理

電子激發(fā)態(tài)的多重度M=2S+1，其中S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)。自旋配對即分子同一軌道里的兩個電子自旋方向相反。假如激發(fā)后電子在躍遷過程中，自旋方向沒有變化，分子中的電子全部是自旋配對，那么此時分子便處于激發(fā)的單重態(tài)(singlet state)，即S=0。但如果激發(fā)后電子在躍遷過程中，自旋方向發(fā)生變化，那么分子此時便處于激發(fā)的三重態(tài)，即S=1。圖1為熒光產(chǎn)生原理的雅布隆斯基分子能級圖，T1代表第一電子激發(fā)三重態(tài)，S0、S1、S2分別代表分子的基態(tài)、第一電子激發(fā)單重態(tài)(first excited state)和第二電子激發(fā)單重態(tài)(second excited state)。

圖1 雅布隆斯基分子能級圖Fig．1 Jablonski Diagram

光在照射的過程中被DOM吸收，入射光的能量傳遞給有機(jī)物分子。當(dāng)它被激發(fā)后，原子核周圍的一些電子會從較低能級的軌道躍遷至較高能級的軌道，即從基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，整個過程約10-15s，而兩個能級間的能量差就是它所吸收的能量。由于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定的，會通過輻射躍遷(發(fā)射熒光)或非輻射躍遷(振動弛豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換和系間竄越)恢復(fù)至基態(tài)，這樣當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)恢復(fù)到基態(tài)時，伴隨著能量以電磁輻射的形式釋放，即產(chǎn)生熒光，這就是3D-EEM技術(shù)能夠分析DOM的機(jī)理。

三維熒光光譜圖中三維分別是指激發(fā)波長、發(fā)射波長及對應(yīng)的熒光強(qiáng)度。它有兩種表現(xiàn)形式，三維熒光投影圖和二維熒光等高線圖，后者較前者能夠克服圖譜中光譜峰遮掩的問題，更豐富地表達(dá)光譜峰的位置及熒光強(qiáng)度所揭示的信息。水體中DOM組成不同，濃度不同，它們的三維熒光光譜圖也不盡相同，因此也稱三維熒光光譜技術(shù)為“fingerprint”(指紋)技術(shù)。

由于水體中DOM是多種有機(jī)物組分的混合物，在三維熒光光譜圖中，不同組分的光譜峰位置重疊導(dǎo)致的遮掩會帶來一定的視覺誤差，故采用數(shù)學(xué)分析方法對三維熒光光譜圖進(jìn)行處理，如主成分分析法 (principal component analysis， PCA)和PARAFAC，將不同組分的三維熒光光譜圖提取分離出來。

PCA利用降維的思想將三維熒光光譜圖中的數(shù)據(jù)信息進(jìn)行分析，提取出幾個新的變量，它們是原變量的線性組合，且能夠最大限度地表征原變量所包含的信息。PARAFAC基于三線性分解理論，采用交替最小二乘方法(alternating least squares method，ALS)實現(xiàn)，它將三維熒光光譜圖分解為多個(一般為3個)獨立的二維熒光光譜圖，以便提高光譜識別的準(zhǔn)確性。與PAC相比，PARAFAC的解是唯一的，因而可以避免由于操作人為造成分析結(jié)果的誤差［8］。

式中：Δii為托架某次調(diào)姿過程中的整體誤差項系數(shù)乘以誤差項(即(Tpθ·δpθ)k中某行);f(x1,x3,,x36)為去除結(jié)構(gòu)誤差x2,x22后，其余結(jié)構(gòu)誤差對Δii的影響。線性相關(guān)列對應(yīng)的結(jié)構(gòu)誤差項無法單獨辨識，只能辨識出結(jié)構(gòu)誤差項對托架整體誤差項的綜合影響。同理，可將x3+x24,x4+x30,x5+x36作為單一整體進(jìn)行求解。因此，令：

2 三維熒光光譜技術(shù)的影響因素

根據(jù)產(chǎn)生熒光所需的條件，三維熒光光譜技術(shù)的影響因素可以分為內(nèi)部結(jié)構(gòu)跟外部環(huán)境兩個方面。

2．1 內(nèi)部結(jié)構(gòu)

(1)躍遷類型

分子產(chǎn)生熒光主要的躍遷類型為π→π*躍遷。對于大部分的熒光有機(jī)物，首先由nπ→π或π→π*激發(fā)，然后通過振動弛豫或其他輻射躍遷，發(fā)生π*→n或π*π→躍遷從而得到熒光。研究發(fā)現(xiàn)，π*π→躍遷能夠得到較強(qiáng)的熒光［9］。

(2)剛性平面結(jié)構(gòu)和共軛效應(yīng)

熒光現(xiàn)象通常發(fā)生在具有剛性平面結(jié)構(gòu)以及電子共軛體系的分子中［10］，芳香族化合物是典型的具有熒光性的物質(zhì)。有些有機(jī)物(如8-羥基喹啉)雖然具有π-π共軛雙鍵，但是不具有剛性平面結(jié)構(gòu)，分子也不處在同一個平面中，這些有機(jī)物本身是不會發(fā)出熒光的，當(dāng)它們與金屬離子形成配位聚合物后，由于分子平面結(jié)構(gòu)的增大，分子剛性結(jié)構(gòu)的增強(qiáng)，這些配位聚合物常常也能夠發(fā)出熒光。因此ππ共軛雙鍵是物質(zhì)熒光性的必要條件，π電子的共軛程度與物質(zhì)的熒光強(qiáng)度成正比關(guān)系。

(3)取代基效應(yīng)

芳香族化合物苯環(huán)上的取代基對它的熒光強(qiáng)度有很大的影響?！狾H、—CN和—NH2等給電子基團(tuán)能夠增強(qiáng)熒光強(qiáng)度，而—NO2、—C==O、—COOH和鹵素等吸電子基團(tuán)則會使熒光強(qiáng)度減弱甚至發(fā)生猝滅［11］。

2．2 外部環(huán)境

(1)pH

一般來說，在相同溶液環(huán)境下，DOM的熒光強(qiáng)度會隨著pH的增加而增大，這主要與結(jié)構(gòu)中的酸性基團(tuán)和自身隨 pH改變的分子構(gòu)型有關(guān)［12］。GHOSH等［12］發(fā)現(xiàn)DOM分子在高pH時呈線性結(jié)構(gòu)，而在低pH時發(fā)生卷曲。對于芳香族化合物與金屬離子形成的配位聚合物，pH不但會影響它們的形成，還會影響它們的組成，從而影響到它們的性質(zhì)。比如，鄰二羥基偶氮苯與Ga3+在pH為3～4的條件下可形成1∶1的配位聚合物，可產(chǎn)生熒光;但在pH為6～7的條件下則會形成1∶2的配位聚合物，不能產(chǎn)生熒光［8］。

(2)溫度

溫度也是影響DOM熒光強(qiáng)度的一個重要因素。李紅軍等［13］進(jìn)行不同溫度對熒光素鈉溶液熒光強(qiáng)度的測試表明，隨著溫度的降低，DOM的熒光強(qiáng)度和熒光量子效率都會增大，而當(dāng)溫度升高時，DOM的熒光強(qiáng)度就會降低。這主要是由兩個方面造成的，一是分子內(nèi)部能量的轉(zhuǎn)化，二是碰撞的頻率。

(3)金屬離子

DOM與金屬離子形成配位聚合物會因它們之間的相互作用而引起熒光猝滅。在過量Cu(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)的條件下，DOM中類富里酸的熒光強(qiáng)度會發(fā)生一定的猝滅［14］。傅平青等［15］應(yīng)用三維熒光光譜技術(shù)研究DOM與Hg(Ⅱ)間的相互作用，結(jié)果表明在自然水體環(huán)境中，Hg(Ⅱ)是DOM的強(qiáng)有機(jī)配位體，DOM的熒光基團(tuán)能夠被Hg(Ⅱ)在一定程度上猝滅。另外，Cu(Ⅱ)也是DOM的熒光猝滅劑。

(4)散射光

這里的散射光主要是指拉曼散射(Raman scattering)和瑞利散射(Rayleigh scattering)。拉曼散射是由于處在激發(fā)態(tài)的分子沒有躍遷至基態(tài)而偏離原來的能級，到達(dá)稍高或稍低的能級。瑞利散射與水體中粒子的濃度和體積有關(guān)。去除散射光影響的辦法主要有加權(quán)法、空白去除法和插值法等。

(5)溶劑效應(yīng)

溶劑的影響分為一般溶劑效應(yīng)和特殊溶劑效應(yīng)。一般溶劑效應(yīng)是指溶劑的介電常數(shù)n與折射率ε對熒光強(qiáng)度的影響。特殊溶劑效應(yīng)是指熒光物質(zhì)與溶劑間的化學(xué)作用，它對熒光強(qiáng)度的影響會大于一般溶劑效應(yīng)［9］。肖雪等［16］研究了溶劑效應(yīng)對苯酚三維熒光光譜特性的影響，結(jié)果表明苯酚的光譜峰位置并未隨溶劑的改變而發(fā)生明顯位移，而熒光強(qiáng)度則有顯著差異，在純乙醇中的苯酚熒光強(qiáng)度大于在純水中的苯酚熒光強(qiáng)度。

3 三維熒光光譜定性分析

不同的有機(jī)物組分都有其特定的最大激發(fā)波長和發(fā)射波長，因此可以根據(jù)對應(yīng)的光譜峰位置實現(xiàn)對熒光組分的定性分析，它包含了與有機(jī)物結(jié)構(gòu)、動力學(xué)、官能團(tuán)等有關(guān)的大量信息［17］。常見的有機(jī)物光譜峰位置如表1所示。

表1 三維熒光光譜技術(shù)常見有機(jī)物光譜峰識別位置Tab．1 Summary of Fluorescent Peak Position of Organic Matter by 3D-EEM

4 三維熒光光譜技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀與展望

祝鵬等［23］利用PARAFAC對太湖水樣的三維熒光光譜圖進(jìn)行處理，通過對得到的DOM各種組分的光譜峰值與原始三維熒光光譜中各種組分光譜峰值進(jìn)行比較，可以認(rèn)為在進(jìn)行分析時，利用前者代替后者是可行的。施俊等［24］采用3D-EEM技術(shù)分析污水處理廠進(jìn)出水水質(zhì)，通過擬合進(jìn)出水中的光譜峰處的熒光強(qiáng)度與常規(guī)指標(biāo)間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)λEx/Em=225/340和λEx/Em=230/430處可以用來對城市生活污水中銨態(tài)氮和總氮進(jìn)行在線分析和實時監(jiān)測。郝瑞霞等［25］采用3D-EEM技術(shù)研究了生活污水中DOM的熒光特性，發(fā)現(xiàn)光譜峰處的熒光強(qiáng)度與TOC或COD都有良好的線性關(guān)系。吳靜等［26］基于3D-EEM技術(shù)分析北京城市水體，研究表明三維熒光光譜圖可以展示污染的程度及污染來源。宋曉娜等［27］利用3D-EEM研究太湖表層和底層水體DOM組成和分布，對不同湖區(qū)DOM的來源進(jìn)行分析，結(jié)果表明大部分湖區(qū)水體的DOM以類蛋白質(zhì)為主，DOM的分布存在區(qū)域差異性，并且光譜峰處的熒光強(qiáng)度與各類水質(zhì)常規(guī)指標(biāo)呈顯著相關(guān)性。閆麗紅［28］對黃東海春秋季水樣進(jìn)行表、中、底層有色可溶性有機(jī)物(colored dissolved organic matter，CDOM)進(jìn)行了分析，研究表明3D-EEM能夠鑒別出黃東海水體CDOM中有10種熒光組分，CDOM發(fā)色團(tuán)與類腐殖質(zhì)組分有相似性質(zhì)，CDOM的組成和性質(zhì)具有明顯的季節(jié)性變化和遷移轉(zhuǎn)化。黃昌春等［29］基于太湖全湖樣點的CDOM三維熒光光譜數(shù)據(jù)，結(jié)合后平行因子分析法研究CDOM的組成成分及其熒光光譜特征，研究結(jié)果根據(jù)熒光基團(tuán)的類別，將太湖的CDOM源類型分為四類，即(1)陸源主導(dǎo)類型;(2)偏陸源主導(dǎo)類型;(3)偏海源主導(dǎo)類型;(4)海源主導(dǎo)類型。

目前國內(nèi)外對三維熒光光譜技術(shù)的研究大多處于實驗室階段，這可能是由以下幾個方面的原因造成的。(1)尚有未知的組分來源及特征不確定;(2)PARAFAC還需要有進(jìn)一步驗證與探索的必要;(3)暫時還沒有統(tǒng)一的DOM組分熒光特性指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)［30］。為了使三維熒光光譜技術(shù)能夠更廣泛地應(yīng)用于實際問題，今后的研究重點應(yīng)該從以下幾個方面來考慮:(1)利用現(xiàn)代化先進(jìn)儀器分析設(shè)備，更為深入地研究DOM組分;(2)進(jìn)一步研究PARAFAC，推動三維熒光光譜技術(shù)與PARAFAC的聯(lián)用;(3)建立DOM三維熒光光譜指紋數(shù)據(jù)庫，為將來快速識別分析研究提供幫助。

5 結(jié)語與展望

三維熒光光譜技術(shù)與PARAFAC聯(lián)用是研究水體中DOM的有效手段，對DOM分析具有經(jīng)濟(jì)、高效、選擇性好、靈敏度高且不破壞樣品結(jié)構(gòu)等優(yōu)點，尤其是在處理水樣中低濃度DOM方面，有廣闊的應(yīng)用前景。

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