人外周血淋巴細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備研究

徐本錦，劉 玲

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院，山西汾陽(yáng) 032200 )

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人外周血淋巴細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備研究

徐本錦，劉 玲

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院，山西汾陽(yáng) 032200 )

外周血淋巴細(xì)胞； 染色體； 分裂相； 秋水仙素

1960年，Moorhead等建立了一套比較完整的外周血體外培養(yǎng)和染色體制備方法，該技術(shù)能夠清晰的顯示染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)上的變化，對(duì)于常見遺傳性疾病的快速診斷，提高人口素質(zhì)具有十分重要的作用，對(duì)我國(guó)優(yōu)生優(yōu)育工作意義重大[1]。但該技術(shù)對(duì)細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，使得實(shí)驗(yàn)易受溫度、pH、溶血和凝血等因素影響而導(dǎo)致失敗[2]。為了臨床上能高效、快速、準(zhǔn)確地診斷遺傳性疾病，有學(xué)者已經(jīng)報(bào)道了該技術(shù)的一些心得體會(huì)[3-5]。本研究立足于獲得高質(zhì)量的人外周血染色體標(biāo)本和提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)的可操作性，對(duì)該技術(shù)的4個(gè)影響因素進(jìn)行了優(yōu)化，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取8名健康男性和8名健康女性進(jìn)行外周血采集，使用肝素抗凝。

1.2 儀器與試劑 培養(yǎng)箱，光學(xué)顯微鏡，香柏油，乙醇燈，離心機(jī)，恒溫培養(yǎng)箱，人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液(湖南湘雅基因技術(shù)有限公司)，秋水仙素(20 μg/mL)，低滲液(0.075 mol/L 氯化鉀溶液)，固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)，Giemsa染液，500 U/mL肝素。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)方法 采血：采用10 mL一次性注射器吸取少量肝素潤(rùn)濕針管，將多余肝素排出。接種：在無(wú)菌條件下，用注射器針頭刺透培養(yǎng)瓶橡皮塞，向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)注入成年男子全血26滴，或成年女子全血28滴，輕輕搖勻。培養(yǎng)：將培養(yǎng)瓶放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h[6]。細(xì)胞同步化：外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)68～70 h后，用5 mL注射器針頭加入5滴20 μg/mL秋水仙素，然后接著培養(yǎng)3～4 h[6]。細(xì)胞收集：從培養(yǎng)箱拿出培養(yǎng)瓶，搖勻之后直接倒入10 mL刻度離心管，以2 000 r/min離心10 min。低滲：棄上清，用注射器加入8 mL 37 ℃水浴的低滲液，混勻后37 ℃恒溫水浴30 min[6]。預(yù)固定：低滲結(jié)束后，立即加入1 mL固定液，混勻之后以2 000 r/min離心10 min。固定：棄上清，加入8 mL固定液，混勻后室溫固定30 min，然后以2 000 r/min離心10 min，棄上清。再固定：加入8 mL固定液，用吸管吹打，充分混勻后室溫靜置30 min或過(guò)夜。滴片：再次以2 000 r/min離心10 min，棄上清，然后每個(gè)離心管里加入5～6滴新鮮配制的固定液，吹打混勻制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液3滴，滴到冰凍的載玻片上，滴片高度30 cm，隨即吹開，酒精燈上烘干，貼標(biāo)簽。染色：用1∶10 Giemsa染液37 ℃條件下染色10 min，自來(lái)水沖洗，晾干后鏡檢[6]。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)原理 培養(yǎng)：人外周血淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)72 h，大部分淋巴細(xì)胞處于增殖周期內(nèi)。同步化：培養(yǎng)期間，利用秋水仙素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行同步化處理，使大部分細(xì)胞都停滯在有絲分裂的中期。低滲：淋巴細(xì)胞經(jīng)低滲液處理，會(huì)吸水而脹破，釋放出染色體。固定：利用低滲液對(duì)染色體進(jìn)行固定，有助于維持其完整的形態(tài)。染色：利用Giemsa染液對(duì)染色體進(jìn)行著色，便于顯微鏡下觀察。

1.3.3 關(guān)鍵因素優(yōu)化 通過(guò)文獻(xiàn)資料和筆者長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，本研究選取了4個(gè)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素進(jìn)行條件優(yōu)化，分別對(duì)秋水仙素加入時(shí)間、低滲時(shí)間、固定時(shí)間和染色時(shí)間設(shè)定梯度，其他條件保持不變，通過(guò)多次嘗試和反復(fù)摸索，找到最佳時(shí)間組合，確定最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件。具體時(shí)間梯度如表1所示。

2 結(jié) 果

通過(guò)對(duì)秋水仙素加入時(shí)間、低滲時(shí)間、固定時(shí)間和染色時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，找到這4個(gè)影響因素的最佳作用時(shí)間分別為2.5 h、20 min、25 min和20 min。具體結(jié)果如圖1所示。

表1 4個(gè)關(guān)鍵因素的時(shí)間梯度

注：-表示無(wú)數(shù)據(jù)。

注：A1～A3表示優(yōu)化后的染色體核型；B1～B2表示低滲時(shí)間小于或等于15 min；B3表示低滲時(shí)間等于20 min；C表示固定時(shí)間小于或等于20 min；D1表示染色時(shí)間小于或等于15 min；D2表示染色時(shí)間大于或等于25 min。

圖1 各類條件下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(100×10)

3 討 論

人外周血染色體分析技術(shù)在遺傳性疾病的診斷中發(fā)揮著十分重要的作用，在一些醫(yī)院的生殖醫(yī)學(xué)科，該專門技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用。隨著一些新的遺傳性疾病的報(bào)道及產(chǎn)前產(chǎn)后診斷的日益廣泛，診斷的高效率和準(zhǔn)確結(jié)果的保障是該技術(shù)應(yīng)用過(guò)程中亟待解決的問(wèn)題。因此，有必要對(duì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，使其更好地服務(wù)于教學(xué)實(shí)驗(yàn)或臨床。

該技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行同步化、低滲和固定處理，從而獲得大量形態(tài)清晰、數(shù)目完整的優(yōu)質(zhì)分裂相。通過(guò)查閱文獻(xiàn)和筆者長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，本研究選取了4個(gè)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素進(jìn)行條件優(yōu)化，分別是秋水仙素的加入時(shí)間、低滲時(shí)間、固定時(shí)間和染色時(shí)間。

秋水仙素是一種有絲分裂阻斷劑，通過(guò)抑制紡錘體的形成來(lái)阻止細(xì)胞分裂，可使細(xì)胞分裂停留在中期，從而得到大量的中期細(xì)胞[7]。若秋水仙素作用超時(shí)，一方面會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，影響細(xì)胞分裂，使分裂指數(shù)減少；另一方面，會(huì)使染色體縮短變粗，最終使染色體丟失而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。因此，確定好秋水仙素的作用時(shí)間非常重要。通常認(rèn)為，在終止培養(yǎng)前3～4 h內(nèi)加入秋水仙素。實(shí)驗(yàn)期間發(fā)現(xiàn)，秋水仙素的作用時(shí)間在1.5～4.0 h時(shí)，雖能在顯微鏡下找到理想的分裂相，但是，當(dāng)時(shí)間小于等于2.0 h時(shí)，停滯在中期的細(xì)胞數(shù)目會(huì)減少，并且有相當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞處于其他分裂時(shí)期，這與謝志威等[8]報(bào)道的秋水仙素加入太少或處理時(shí)間偏短，可導(dǎo)致染色體形態(tài)偏長(zhǎng)或無(wú)中期分裂相一致。當(dāng)秋水仙素加入時(shí)間大于等于3.0 h時(shí)發(fā)現(xiàn)，大部分細(xì)胞處于分裂中期，但染色體變得又粗又短，不利于觀察。而當(dāng)作用時(shí)間為2.5 h時(shí)，可獲得數(shù)目多、濃縮適中的染色體。

低滲處理的目的是誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞吸水脹破，有助于染色體從細(xì)胞分散出來(lái)。低滲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(45～60 min)，會(huì)導(dǎo)致染色體長(zhǎng)度增加，黏度增大，影響分散程度，也不利于后續(xù)的顯帶。Henegariu等[9]認(rèn)為低滲處理10 min就可以得到理想的結(jié)果。因此，低滲時(shí)間是本實(shí)驗(yàn)成敗的一個(gè)關(guān)鍵。研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)蜐B時(shí)間不超過(guò)15 min時(shí)，絕大部分細(xì)胞沒有破裂，形態(tài)完整，未能釋放出核內(nèi)的染色體(圖B1)，偶爾也能看到幾條染色體，但數(shù)目不夠，有的染色體還被細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)包裹，形態(tài)不清，這也許是細(xì)胞破裂不充分導(dǎo)致的(圖B2)，主要原因是低滲時(shí)間不夠，大部分細(xì)胞沒能充分與低滲液相互作用。若低滲時(shí)間超過(guò)25 min，則會(huì)使細(xì)胞過(guò)早破裂，導(dǎo)致染色體丟失。當(dāng)?shù)蜐B時(shí)間調(diào)整為20 min時(shí)，發(fā)現(xiàn)很多細(xì)胞破裂并釋放出染色體，達(dá)到了實(shí)驗(yàn)要求(圖B3)。

染色體釋放出來(lái)之后，為了維持其形態(tài)，得到一個(gè)分散良好的分裂相，需要使用固定液對(duì)染色體進(jìn)行固定操作。通過(guò)五個(gè)時(shí)間梯度的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，固定時(shí)間不超過(guò)20 min時(shí)，有的染色體散的太開，不利于觀察，或者相鄰2個(gè)細(xì)胞的染色體混在了一起(圖C)，無(wú)法辨別，不便于計(jì)數(shù)，也加大了后續(xù)核型分析的難度。當(dāng)固定時(shí)間為25 min時(shí)，染色體分散良好，有很多完整的分裂相，且質(zhì)量較高(圖B3)。

染色是本實(shí)驗(yàn)的最后一步，通過(guò)4個(gè)染色時(shí)間的嘗試，結(jié)果顯示，染色時(shí)間不超過(guò)15 min時(shí)，染色體著色很淡，亮度不夠，甚至看不清楚(圖D1)，也不美觀。當(dāng)染色時(shí)間大于等于25 min時(shí)，染色體又著色太深，形態(tài)不清晰，還會(huì)使玻片的背景過(guò)深，且不易沖洗，同樣對(duì)結(jié)果有很大影響(圖D2)。最終發(fā)現(xiàn)，當(dāng)這4個(gè)時(shí)間分別為2.5 h，20 min，25 min和20 min時(shí)，能夠得到高質(zhì)量的染色體(圖A1，A2和A3)。同時(shí)，在滿足上述條件的前提下，還應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：(1)淋巴細(xì)胞培養(yǎng)期間，要經(jīng)常搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，避免培養(yǎng)基與細(xì)胞分層，影響細(xì)胞增殖。(2)為了獲得分裂指數(shù)較多，形態(tài)清晰，長(zhǎng)短適中，分散良好的染色體，培養(yǎng)時(shí)間需在70～72 h。(3)收集細(xì)胞時(shí)，要搖勻培養(yǎng)液，然后將細(xì)胞和培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)入離心管，否則會(huì)造成細(xì)胞數(shù)量的減少。(4)離心后需棄去上清液的，應(yīng)盡快除去上清液，否則會(huì)引起沉淀溶解，造成細(xì)胞丟失。(5)低滲液加入后，必須混勻完全，讓細(xì)胞與其充分接觸，否則會(huì)影響染色體的釋放。(6)滴片時(shí)必須使用冰凍的載玻片，且滴片高度在30 cm左右，否則會(huì)影響染色體的分散程度[10]。

綜上所述，經(jīng)過(guò)反復(fù)摸索，本研究得到了高質(zhì)量的中期染色體，這不僅有助于后續(xù)的顯帶和核型分析，也有助于實(shí)驗(yàn)教學(xué)的順利開展。然而，外周血染色體制備技術(shù)目前還沒有統(tǒng)一的質(zhì)量控制體系，該技術(shù)所用試劑的濃度、生產(chǎn)廠家，以及實(shí)驗(yàn)室條件和設(shè)備等諸多因素參差不齊，再加上人為因素等，均會(huì)對(duì)染色體的質(zhì)量產(chǎn)生影響。因此，無(wú)論是科技工作者還是醫(yī)務(wù)人員，都應(yīng)本著相互學(xué)習(xí)的態(tài)度，取長(zhǎng)補(bǔ)短，以獲得高質(zhì)量的染色體標(biāo)本。

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