NMF308nmf／nmf小鼠耳蝸毛細(xì)胞凋亡方式及z-VAD-FMK對(duì)毛細(xì)胞的保護(hù)作用△

李勝利 王玉虎 張敏燕 李白芽 鄭慶印 朱雯瑾 朱宏亮

NMF308nmf／nmf小鼠耳蝸毛細(xì)胞凋亡方式及z-VAD-FMK對(duì)毛細(xì)胞的保護(hù)作用△

李勝利1，2，3王玉虎1＃張敏燕3李白芽3鄭慶印3朱雯瑾2朱宏亮2

目的 了解年齡相關(guān)性聽力損失小鼠耳蝸毛細(xì)胞的凋亡方式，探討半胱氨酸蛋白酶（caspase）抑制劑z-VAD-FMK［z-Val-Ala-Asp（Ome）-fluoromethylketone］防治老年性聾的效果。方法 選用新生NMF308nmf／nmf小鼠14只和成年同窩NMF308nmf／nmf小鼠32只，分為新生小鼠腹腔注射組（14只）、成年小鼠腹腔注射組（14只）和成年小鼠圓窗膜注射組（18只），各組又分為治療組（注射z-VAD-FMK）和對(duì)照組［注射二甲基亞楓（dimethylsulfoxide，DMSO）］，采用圓窗膜局部和腹腔注射兩種方法給藥，給藥前后行ABR檢測(cè)，用免疫熒光染色化學(xué)技術(shù)TUNEL、caspase-3和PI（碘化丙啶）染色標(biāo)記耳蝸毛細(xì)胞，觀察各組耳蝸毛細(xì)胞的凋亡和存活狀況。結(jié)果NMF308nmf／nmf小鼠從1月齡開始發(fā)生聽力減退和毛細(xì)胞功能改變，到2月齡時(shí)，caspase-3激活表達(dá)的毛細(xì)胞凋亡現(xiàn)象是毛細(xì)胞凋亡出現(xiàn)的最早表現(xiàn)；TUNEL陽性標(biāo)記特征稍晚出現(xiàn)；PI標(biāo)記可見毛細(xì)胞細(xì)胞核固縮和碎片出現(xiàn)的時(shí)間從2月齡開始；到3月齡時(shí)該種小鼠聽力基本喪失，耳蝸毛細(xì)胞嚴(yán)重缺失；而應(yīng)用z-VAD-FMK治療后，各治療組小鼠ABR反應(yīng)閾明顯好于對(duì)照組；耳蝸毛細(xì)胞凋亡數(shù)目較對(duì)照組減少，存活數(shù)明顯較對(duì)照組多，尤以圓窗膜注射組明顯。結(jié)論 NMF308nmf／nmf小鼠耳蝸毛細(xì)胞的死亡方式以caspase-3凋亡途徑為主，應(yīng)用caspase-3抑制劑z-VAD-FMK定向內(nèi)耳給藥，可以阻斷caspase-3信號(hào)途徑激活所導(dǎo)致的毛細(xì)胞凋亡，從而有效防治老年性聾。

老年性聾； 外毛細(xì)胞； 凋亡； 抗凋亡抑制劑； 動(dòng)物模型

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20141231.1128.008.html

隨年齡增加氧化損傷主要造成耳蝸細(xì)胞損傷，并加速耳蝸細(xì)胞凋亡［1，2］。已證明caspase-3在老年豚鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中呈陽性表達(dá)，提示caspase-3在豚鼠耳蝸老化過程中起重要作用［3］?；钚匝醮x物是正常氧化磷酸化過程的副產(chǎn)物，由于在機(jī)體老化過程中長(zhǎng)期慢性活性氧代謝物的作用及清除自由基酶活性的下降，使耳蝸細(xì)胞線粒體損傷及ATP合成減少，激活半胱氨酸蛋白酶（caspases），并啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。年齡相關(guān)性聽力損失（age-related hearing loss，AHL）NMF308nmf／nmf小鼠早期耳蝸毛細(xì)胞首先出現(xiàn)DNA單鏈斷裂，隨后caspase-3信號(hào)途徑激活，導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞凋亡，這是老年性聾的主要分子機(jī)制之一［4，5］。國外研究也發(fā)現(xiàn)caspases激活是導(dǎo)致哺乳類動(dòng)物耳蝸毛細(xì)胞死亡的重要途徑［6］。caspase抑制劑z-VADFMK［z-Val-Ala-Asp（Ome）-fluoromethylketone，Z-VAD-FMK］是一種可以穿透細(xì)胞膜的泛caspase抑制劑（cell permeable pan caspase inhibitor），可以抑制由caspase激活導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。對(duì)氨基糖苷類抗生素耳中毒雞使用z-VADFMK治療后，顯示其可保護(hù)雞內(nèi)耳前庭毛細(xì)胞的存活，減少毛細(xì)胞的凋亡［7］。耳蝸局部應(yīng)用線粒體毒性3-NP酸造成耳蝸側(cè)壁纖維化退變導(dǎo)致聽力喪失豚鼠，用z-VAD-FMK治療可明顯抑制耳蝸基底回側(cè)壁的纖維化退變的程度［6］。最近研究證明，體外培養(yǎng)應(yīng)用caspase抑制劑能夠有效治療快速毛細(xì)胞死亡造成的年齡相關(guān)性聽力損失［8］，但目前尚未見到在體應(yīng)用caspase抑制劑防治老年性聾耳蝸毛細(xì)胞凋亡的報(bào)道。本研究旨在探討NMF308nmf／nmf小鼠耳蝸毛細(xì)胞的凋亡方式，并比較NMF308nmf／nmf新生和成年小鼠局部和全身應(yīng)用caspase抑制劑z-VAD-FMK治療毛細(xì)胞凋亡的效果，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用美國俄亥俄州克里夫蘭市西儲(chǔ)地大學(xué)（Case Western Reserve U-niversity，Cleveland）的NMF308小鼠46只，它是由乙?；鶃喯趸澹∟-ethyl-N-nitrosourea，ENU）神經(jīng)科學(xué)誘變（Neuroscience Mutagenesis Facility，NMF）產(chǎn)生的突變鼠，表型呈快速漸進(jìn)性聽力損失，命名為NMF308nmf／nmf，可作為年齡相關(guān)聽力損失的動(dòng)物模型［4，5］。動(dòng)物分組及處理方法見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、處理方法

1.2 圓窗膜給藥方法 成年NMF308nmf／nmf小鼠用Avertin（0.5 mg／g）麻醉后腹腔麻醉，從頸部正面腹側(cè)切開，鈍性分離并暴露一側(cè)聽泡，在手術(shù)顯微鏡下，看到明顯的聽泡凸起骨壁，仔細(xì)止血，小線狀刀在聽泡骨壁切一小口，調(diào)整光線和顳骨位置，可明顯看圓窗龕，用微量注射器將5μl caspase抑制劑z -VAD-FMK（治療組）（z-VAD-FMK溶入二甲基甲砜（dimethylsulfoxide，DMSO）中，濃度為10 m M，ALEXIS Corporation）或DMSO（Sigma）（對(duì)照組）注射到圓窗膜上，保持位置不變1小時(shí)。隨后封閉骨孔，縫合切口，消毒、包扎傷口。

1.3 腹腔注射方法 成年鼠和出生兩天的NMF308nmf／nmf小鼠腹腔注射z-VAD-FMK（購于EMD Chemicals Inc，Germany，用0.2%DMSO稀釋到100μM）（治療組）或DMSO（對(duì)照組）。按15 mg／kg劑量腹腔注射，每天一次，連續(xù)注射10 d。

1.4 ABR檢測(cè)方法 用美國Inteligent Hearing Smart聽覺誘發(fā)電位—耳聲發(fā)射儀檢測(cè)。分別檢測(cè)各組動(dòng)物click聲和tone burst聲誘發(fā)的ABR反應(yīng)閾。動(dòng)物用Avertin（0.5mg／g）麻醉后，用針電極插入顱頂為記錄電極，同側(cè)為參考電極，對(duì)側(cè)接地。刺激率19.1次／秒，高通300 Hz，低通3 000 Hz，平均疊加256～512次，以波Ⅲ出現(xiàn)為標(biāo)志判斷ABR反應(yīng)閾值［9］。

1.5 耳蝸鋪片及毛細(xì)胞計(jì)數(shù) 各組動(dòng)物檢測(cè)ABR完成后，在麻醉狀態(tài)下，快速斷頭，迅速取出顳骨，分離出耳蝸，在解剖顯微鏡下，用纖細(xì)鋼針在耳蝸尖鉆一小孔，關(guān)鍵是將前庭膜挑破，再挑破圓窗膜和卵圓窗膜，并在耳蝸底回骨隆起出鉆一小孔，看到外淋巴液溢出。馬上用細(xì)的滴管吸取1.0%的硝酸銀溶液，從蝸尖的小孔和兩窗及底回的小孔反復(fù)灌入。用雙蒸餾水洗滌數(shù)次，再灌入10%的福爾馬林固定。在日光下曝光2～4 h。在解剖顯微鏡下分離、鋪片，對(duì)鋪片完整的樣品進(jìn)行毛細(xì)胞計(jì)數(shù)［8］。

1.6 TUNEL和PI染色標(biāo)定方法 耳蝸樣本快速用4%多聚甲醛固定（ACROS，New Jersey，USA），在4℃冰箱過夜。在解剖顯微鏡下，耳蝸置于中性磷酸鹽緩沖液中（PBS），完整取出Corti器。Corti器置于0.5%Triton X-100孵育15 min（室溫），PBS洗兩遍。加100μl TUNEL反應(yīng)混合液d UTP和Td T于Corti器管中，在37℃避光的暗盒中孵育60分鐘。隨后，洗滌兩次，再置于PI染色液中（2～5μg／ml Propidium iodine PI in PBS）室溫共30 min。最后，Corti器分回平鋪于載玻片上，加抗猝滅劑，熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.7 耳蝸超薄切片觀察 動(dòng)物在Avertin（0.5 mg／g）腹腔麻醉后，快速取下雙側(cè)聽泡，用纖細(xì)鋼針挑破圓窗和卵圓窗膜，迅速給耳蝸灌入2.5%的戊二醛溶液（Electron Microscopy Sciences），用0.1 M磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS，p H 7.4）配制，反復(fù)灌注三次。4℃固定四小時(shí)后，在解剖顯微鏡下分離出完整的Corti器，用120 m M EDTA脫鈣1～1.5小時(shí)。用0.1 M PBS洗滌三次后，置入1%鋨酸（osmium tetroxide，Electron Microscopy Sciences）后固定1小時(shí)。隨后梯度酒精脫水，臨界點(diǎn)干燥，塑料包埋，半薄切片，美蘭染色光鏡觀察定位后，再行超薄切片，用日立7100透射電鏡（Hitachi，Tokyo，Japan）觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Microsoft Office Excel錄入數(shù)據(jù)，計(jì)算平均值，制作數(shù)據(jù)表格。所有數(shù)據(jù)用SPSS10.0 for Window軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性檢驗(yàn)。組間比較采用q檢驗(yàn)（Newman-keuls）。

2 結(jié)果

2.1 各組動(dòng)物ABR反應(yīng)閾 成年小鼠圓窗膜注射給藥后，治療組較對(duì)照組ABR反應(yīng)閾值降低10～25 dB；圓窗膜給藥后的38～52天，治療組ABR反應(yīng)閾較對(duì)照組下降超過20 dB，而在給藥后59 d和64 d，兩組間16和32 k Hz的ABR閾值差異不明顯。

新生小鼠腹腔注射后27、33、38、45、52和59天可見z-VAD-FMK治療組ABR反應(yīng)閾各頻率ABR反應(yīng)閾值均明顯下降。

成年小鼠腹腔注射后，治療組在34～41天的ABR反應(yīng)閾值較對(duì)照組有一定程度下降，但到48天時(shí)，治療組與對(duì)照組的ABR閾值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。新生鼠腹腔注射組給藥后59天、成年鼠腹腔注射組給藥后58天及成年鼠圓窗注射組給藥后54天的c ABR及tb ABR反應(yīng)閾見表2。

表2 各組小鼠c ABR和tb ABR反應(yīng)閾值（dB SPL，±s）

表2 各組小鼠c ABR和tb ABR反應(yīng)閾值（dB SPL，±s）

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2.2 耳蝸外毛細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果 NMF308nmf／nmf突變鼠1月齡時(shí)耳蝸底回開始出現(xiàn)外毛細(xì)胞散在性缺失，2月齡時(shí)耳蝸底回80%OHCs喪失，3月齡時(shí)擴(kuò)展到中回50%OHCs缺失，4月齡時(shí)耳蝸中回和基底回的OHCs幾乎完全喪失（圖1）。成年NMF308小鼠圓窗膜注射z-VAD-FMK后64天，頂回耳蝸毛細(xì)胞有少量缺失，而耳蝸中回、底回很少有毛細(xì)胞缺失，提示z-VAD-FMK耳蝸局部治療能明顯抑制毛細(xì)胞的凋亡。

成年NMF308小鼠腹腔注射z-VAD-FMK后64天，耳蝸基底回的外毛細(xì)胞消失較對(duì)照組輕度減少，但無顯著性差異。新生小鼠腹腔注射z-VAD-FMK治療組較對(duì)照組的耳蝸外毛細(xì)胞消失明顯減少。

總體比較，z-VAD-FMK治療可抑制耳蝸毛細(xì)胞的凋亡，圓窗膜途徑治療的效果最好，其次是新生小鼠早期接受腹腔注射z-VAD-FMK（圖1）。

圖1 給藥64天后新生及成年小鼠治療組耳蝸毛細(xì)胞消失率比較

2.3 NMF308小鼠OHCs的TUNEL和PI染色標(biāo)記結(jié)果 NMF308小鼠在1月齡時(shí)最先出現(xiàn)耳蝸底回散在性TUNEL陽性標(biāo)記的OHCs，核呈圓型，并有少量外毛細(xì)胞缺失，但未見OHCs核固縮細(xì)胞碎片，是毛細(xì)胞凋亡的早期階段。3月齡時(shí)OHCs缺失十分嚴(yán)重，可見PI標(biāo)記的核固縮和細(xì)胞碎片出現(xiàn)，同時(shí)TUNEL陽性標(biāo)記的OHCs亦十分明顯，是毛細(xì)胞凋亡的典型表現(xiàn)（圖2）。

而成年NMF308小鼠圓窗膜注射z-VADFMK3個(gè)月后，耳蝸毛細(xì)胞的TUNEL陽性標(biāo)記明顯減少，毛細(xì)胞缺失數(shù)目亦減少，并且耳蝸毛細(xì)胞核的圓形程度亦明顯改善（圖3）；而對(duì)照組耳蝸毛細(xì)胞呈現(xiàn)廣泛的TUNEL陽性標(biāo)記，耳蝸中回的凋亡毛細(xì)胞較多，并出現(xiàn)毛細(xì)胞缺失（圖3），說明z-VADFMK治療明顯的抑制了耳蝸毛細(xì)胞凋亡進(jìn)程。

新生NMF308小鼠腹腔注射DMSO后64天，可見耳蝸外毛細(xì)胞消失從頂回向底回逐漸加重，頂回出現(xiàn)散在的外毛細(xì)胞消失，而底回出現(xiàn)成片的外毛細(xì)胞消失。TUNEL標(biāo)記亦可見耳蝸外毛細(xì)胞從頂回向底回染色逐漸加重，PI標(biāo)記的核DNA染色亦類似，TUNEL和PI的疊加顯色（Merge）表現(xiàn)出從頂回向底回染色明顯加重的現(xiàn)象（圖4）。

圖2 1月齡NMF308小鼠OHCs的TUNEL和PI染色標(biāo)記結(jié)果

圖3 成年NMF小鼠圓窗膜注射z-VAD-FMK 3個(gè)月后的耳蝸毛細(xì)胞凋亡標(biāo)記

圖4 新生NMF308nmf／nmf小鼠腹腔注射DMSO組耳蝸標(biāo)本行TUNEL和PI標(biāo)記染色結(jié)果

成年NMF308小鼠腹腔注射z-VAD-FMK后，耳蝸標(biāo)本行TUNEL和PI標(biāo)記染色，可見耳蝸外毛細(xì)胞消失從頂回向底回逐漸加重，耳蝸各回未出現(xiàn)散在的外毛細(xì)胞消失。TUNEL標(biāo)記亦可見耳蝸外毛細(xì)胞從頂回向底回染色逐漸減輕，PI標(biāo)記的核DNA染色亦類似，TUNEL和PI的疊加顯色（Merge）表現(xiàn)出從頂回向底回染色明顯加重的現(xiàn)象（圖5）。

圖5 成年NMF308小鼠腹腔注射z-VAD-FMK后耳蝸標(biāo)本行TUNEL和PI標(biāo)記染色結(jié)果

2.4 各組透射電鏡觀察結(jié)果 正常的耳蝸外毛細(xì)胞胞體呈長(zhǎng)拄狀，靜纖毛束存在，細(xì)胞核呈飽滿的圓形，核仁清晰而分散，細(xì)胞器大而多（圖6a、c）。成年NMF308小鼠腹腔注射z-VAD-FMK后，耳蝸外毛細(xì)胞胞體和核均固縮，尤其是核固縮明顯，靜纖毛束消失（圖6b）；內(nèi)毛細(xì)胞表現(xiàn)較外毛細(xì)胞輕，靜纖毛束均存在。新生NMF308小鼠腹腔注射z-VAD-FMK后，耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞胞體和核均固縮，尤其是核固縮明顯（圖6d）；而成年小鼠圓窗膜注射治療組耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞胞體和核固縮均不明顯（圖6e）。

圖6 透射電鏡觀察z-VAD-FMK治療各組的內(nèi)外毛細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變

3 討論

目前，老年性聾動(dòng)物耳蝸毛細(xì)胞死亡的分子途徑目前尚不十分清楚。因此探明控制耳蝸毛細(xì)胞死亡的分子機(jī)制，是發(fā)展新的預(yù)防和治療耳聾策略的關(guān)鍵［15］。老年性聾患者的顳骨標(biāo)本來源困難，而老年性聾動(dòng)物模型因其生長(zhǎng)期長(zhǎng)，用形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)方法并不能完全確定耳蝸毛細(xì)胞死亡途徑是壞死還是凋亡。因此，一些純種系的動(dòng)物因?yàn)榫哂锌焖倮匣目焖俾犃适?，而作為老年性聾研究的動(dòng)物模型［10，11］。最常用的是C57BL／6小鼠［12，13］，該種系小鼠耳蝸毛細(xì)胞在成年早期開始蛻變，隨年齡增長(zhǎng)，毛細(xì)胞從耳蝸基底回快速向蝸頂擴(kuò)展，到26月齡時(shí)，幾乎整個(gè)耳蝸的外毛細(xì)胞和大部分內(nèi)毛細(xì)胞均喪失［14］，此特點(diǎn)符合感音性老年性聽力損失耳蝸的變化規(guī)律。另一種具有快速漸進(jìn)性年齡相關(guān)性聽力損失的小鼠是Fischer 344（F344）小鼠，其耳蝸退變主要在血管紋、Corti器的蓋膜以及螺旋唇和血管紋的明顯膠原纖維化［15］，并在這些病變部位看到細(xì)胞凋亡現(xiàn)象［16］，已證明老年F344小鼠耳蝸外毛細(xì)胞凋亡是主要的死亡形式［17］。本實(shí)驗(yàn)用的NMF308nmf／nmf小鼠是典型的感音性老年性聽力損失動(dòng)物模型，耳蝸毛細(xì)胞的凋亡是導(dǎo)致其聽力減退的主要原因。

衰老細(xì)胞線粒體DNA損傷、能量代謝障礙及自由基損傷導(dǎo)致其容易凋亡?；钚匝醮x物是正常氧化磷酸化過程的副產(chǎn)物，由于在機(jī)體老化過程中長(zhǎng)期慢性活性氧代謝物的作用及清除自由基酶活性的下降，使耳蝸細(xì)胞線粒體損傷及ATP合成減少，激活半胱氨酸蛋白酶（caspases），并啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡程序。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP不足以提供凋亡所需能量時(shí)，細(xì)胞則以壞死方式死亡。年齡相關(guān)性的自由基致線粒體損傷及ATP合成減少的程度是老年耳蝸毛細(xì)胞選擇不同死亡方式的關(guān)鍵因素［18］。凋亡精確的生化機(jī)制及其不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控以及新的凋亡調(diào)控相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)，對(duì)老年性聾的防治都具有重要意義［19］。caspase激活是哺乳類動(dòng)物耳蝸毛細(xì)胞死亡的重要分子途徑。研究表明在鼠耳蝸具有增齡依賴的caspase-3激活導(dǎo)致的組織細(xì)胞凋亡的DNA碎片［20］。

本研究結(jié)果顯示，TUNEL陽性染色和caspase -3標(biāo)記凋亡OHC在時(shí)間和空間上不完全同步出現(xiàn)，說明凋亡的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程。老年性耳蝸毛細(xì)胞凋亡是一個(gè)緩慢、非一致性的改變過程［21］，老年性耳蝸毛細(xì)胞凋亡時(shí)空變化相對(duì)較慢，本研究中NMF308nmf／nmf小鼠在2月齡時(shí)才出現(xiàn)caspase-3標(biāo)記凋亡的OHC，即說明了此點(diǎn)。而給新生NMF308nmf／nmf小鼠腹腔注射z-VAD-FMK 8～10天后，明顯抑制了耳蝸毛細(xì)胞的凋亡，存活的毛細(xì)胞數(shù)目明顯增多，聽功能亦明顯改善。

本研究在NMF308nmf／nmf鼠1月齡時(shí)，用TUNEL標(biāo)記發(fā)現(xiàn)耳蝸毛細(xì)胞有較多出現(xiàn)特異的綠色標(biāo)記，被標(biāo)記的凋亡毛細(xì)胞核呈圓形，未見固縮核變形，說明此時(shí)是毛細(xì)胞凋亡的早期階段。Taylor［22］用TUNEL標(biāo)記卡那霉素?fù)p害7天的鼠耳蝸，僅看到一個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞呈現(xiàn)圓形的TUNEL陽性核。同樣在老年耳蝸切片用TUNEL標(biāo)記出現(xiàn)陽性染色的圓形細(xì)胞核［23］。噪聲損害耳蝸后，所有TUNEL熒光染成綠色的陽性細(xì)胞核固縮，表明DNA斷裂片段已經(jīng)在這些凋亡的細(xì)胞里發(fā)生［24］。順鉑（cis-Diamminedichoroplatinum，CDDP）損害Corti器后在耳蝸鋪片可見TUNEL標(biāo)記的內(nèi)外毛細(xì)胞核幾乎全部呈圓形［25］。本文結(jié)果與上述研究完全相同。噪聲暴露后，OHCs所有陽性標(biāo)記的細(xì)胞核具有明顯的核固縮，但TUNEL染色較弱，正常OHCs沒有TUNEL染色且呈現(xiàn)正常的核形態(tài)，TUNEL染色標(biāo)記在OHC已經(jīng)固縮的核上，表明OHCs已進(jìn)入快速的DNA碎片階段［6］。而本研究?jī)H在NMF308nmf／nmf小鼠3月齡后，觀察到TUNEL陽性標(biāo)記與PI重染現(xiàn)象，說明此時(shí)已是毛細(xì)胞凋亡的后期階段；TUNEL與PI雙染可以確定TUNEL染色陽性的細(xì)胞為凋亡的細(xì)胞。所以，本研究結(jié)果明確表明，年齡相關(guān)性聽力損失小鼠隨年齡增長(zhǎng)出現(xiàn)耳蝸毛細(xì)胞凋亡，老年性聾小鼠耳蝸毛細(xì)胞的死亡是以DNA單鏈斷裂開始導(dǎo)致毛細(xì)胞核凋亡為主，隨后引起細(xì)胞漿caspase-3激活，發(fā)生凋亡的串式連鎖反應(yīng)，使耳蝸毛細(xì)胞以凋亡形式死亡，導(dǎo)致老年性聾的發(fā)生，這可能是老年性聾的分子機(jī)制之一。

caspase抑制劑以不可逆的方式作用于caspase活化點(diǎn)，從而抑制細(xì)胞凋亡。有文獻(xiàn)［22］報(bào)導(dǎo)，在caspase-3水平上阻斷細(xì)胞凋亡的通路可以有效地保護(hù)神經(jīng)元和毛細(xì)胞。因此，可以考慮設(shè)計(jì)以caspase-3為靶標(biāo)的治療方案，從而阻斷細(xì)胞凋亡的通路，達(dá)到保護(hù)毛細(xì)胞和神經(jīng)元的目的，也許能為治療噪聲性聾開辟一條新的治療途徑奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)選用caspases-3抑制劑z-VAD-FMK通過對(duì)NMF308小鼠全身用藥和耳蝸局部用藥，觀察z -VAD-FMK對(duì)老年性聾耳蝸毛細(xì)胞凋亡的抑制效果。結(jié)果顯示，成年NMF308nmf／nmf小鼠應(yīng)用z-VAD-FMK經(jīng)圓窗膜途徑治療27～30天時(shí)，由于藥物直接由圓窗膜滲透進(jìn)入耳蝸的毛細(xì)胞部位，可有效、快速抑制處于早期凋亡過程的毛細(xì)胞死亡，其治療效果較全身用藥組明顯，可作為今后老年性聾防治策略的研究方向之一。

（致謝：本研究得到美國Case Western Reserve University，Cleveland，耳鼻喉-頭頸外科鄭慶印實(shí)驗(yàn)室提供的動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)幫助。特此致謝?。?/p>

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（2014-04-16收稿）

（本文編輯 周濤）

RoIes of Caspase Inhibitors in CochIear Hair CeIIs SurvivaI and Preventing Age-ReIated Hearing Loss

Li ShengIi*，Wang Yuhu，Zhang Minyan，Li Baiya，Zheng Qingyin，Zhu Wenjin，Zhu HongIiang
（*Scientific Research Centre，the Second AffiIiated HospitaI，Medicine SchooI of Xi＇an Jiaotong University，Xi＇an，710004，China）

Objective In this study，we investigated the apoptosis of hair cell in the cochlea of age-related hearing loss（AHL）generated by ENU mutagenesis，and to study a pan caspase inhibitor（z-VAD-FMK）which is to protect the cochlea hair cells from hearing loss induced by age-related hearing loss（AHL）.Methods Through z -VAD-FMK intraperitoneal injection and round window membrane（RWM）drug were delivered into the Cdh23 nmf308 nmf／nmf mice 5（postnatal days 2-32）inner ear.ResuIts The results showed that the nmf308 mice with progressive hair cell loss along a base to apex gradient with age-related hearing loss.The cochlear OHCs reduced from 5%～10%at 1 month to 100%at 3 month in the basal region.Substantial amounts of TUNEL-positive OHCs nuclei appeared at 1 month age，and activated caspase-3 labeling demonstrated that most OHCs appeared at 2 months age.These suggested that DNA single strand break was attributed primarily to apoptosis of cochlear lesions，whereas in the later stage of lesion，the expansion led to activation of caspase-3 activity reduced with furtherprogression of nuclear condensation in age-related hearing loss.ConcIusion The addition of a pan caspase inhibitor（z-VAD-FMK）significantly protected the cochlea against the hair cell loss induced by apoptosis.Our study showed that aspase inhibitor，Z-VAD-FMK appeared to play a prominent role in age-related hearing loss mediated hair cell death loss induced by apoptosis.Our study showed that aspase inhibitor，Z-VAD-FMK appeared to play a prominent role in age-related hearing loss mediated hair cell death.

Presbycusis； Outer hair cell； Apoptosis； Caspase inhibitor； Animal model

10.3969／j.issn.1006-7299.2015.01.013

時(shí)間：2014-12-31 11：28

R764.43+6

A

1006-7299（2015）01-0050-07

△ 國家自然科學(xué)基金對(duì)外交流與合作項(xiàng)目（30210103151）、國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81170922）、美國NIH項(xiàng)目（R01DC007392）聯(lián)合資助

1 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院科研中心實(shí)驗(yàn)室，藥劑科（西安 710004）； 2 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究中心； 3 Case Western Reserve University School of Medicine，Department of Otolaryngology Head＆Neck Surgery.Cleveland USA

李勝利，男，陜西人，副研究員，主要研究方向?yàn)槁犃W(xué)、內(nèi)耳病理生理學(xué)和分子生物學(xué)、耳聾防治、毛細(xì)胞再生和凋亡。

李勝利（Email：lishengli59@163.com）＃為并列第一作者

·實(shí)驗(yàn)研究·