小麥根際土壤中禾谷多黏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測體系的建立及應(yīng)用

王燕霞， 吳季榮， 俞明正， 趙晶晶， 邢宇俊， 徐劍宏， 史建榮

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210046;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量與安全檢測研究所，江蘇 南京 210014;3.江蘇轉(zhuǎn)基因安全評價(jià)公共技術(shù)服務(wù)中心，江蘇 南京 210014)

自1983年第一例轉(zhuǎn)基因煙草誕生以來［1］，轉(zhuǎn)基因作物便得到了迅猛的發(fā)展，商業(yè)化種植面積也從1996年的 1.70×106hm2增長到了 2014年的1.815 ×108hm2［2］。轉(zhuǎn)基因作物給人類社會(huì)帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，其對生態(tài)環(huán)境存在的潛在威脅也成為人們越來越關(guān)注的話題。目前，國內(nèi)外對轉(zhuǎn)基因作物的研究主要集中在轉(zhuǎn)Bt基因的水稻、棉花、玉米和馬鈴薯上［2-6］。其研究內(nèi)容也多以轉(zhuǎn)基因作物對其根際土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu)及主要酶活性的影響為主［7-9］，而對轉(zhuǎn)基因抗病小麥根際土壤中微生物數(shù)量的研究則比較少。

禾谷多黏菌(Polymyxa graminis)是一種專性寄生于植物根部的根腫菌目真核生物，最初在小麥中發(fā)現(xiàn)，而后又相繼在其他谷類作物中發(fā)現(xiàn)。禾谷多黏菌本身無害，但其可通過孢子傳播大麥黃花葉病毒(Barley yellow mosaic virus，BaYMV)、大麥和性花葉病毒(Barley mild mosaic virus，BaYMMV)、小麥梭條花葉病毒(Wheat spindle streak mosaic virus，WSSMV)以及小麥黃花葉病毒(Wheat yellow mosaic virus，WYMV)，進(jìn)而使寄主染?。?0-11］。因此，禾谷多黏菌數(shù)量的變化可以作為評價(jià)土壤環(huán)境的一項(xiàng)指標(biāo)。

轉(zhuǎn)基因小麥N12-1轉(zhuǎn)入了小麥黃花葉病毒的復(fù)制酶基因WYMV-Nib8，對小麥黃花葉病具有顯著的抗性［12-13］。本研究擬建立基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR)方法檢測禾谷多黏菌數(shù)量的體系，并將該體系應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因小麥N12-1及其受體小麥揚(yáng)麥158不同生長期根際土壤中禾谷多黏菌數(shù)量的檢測，以期為研究轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)的影響提供一定的技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

轉(zhuǎn)WYMV-Nib8基因小麥N12-1及其受體小麥揚(yáng)麥158，其中N12-1由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 方法

1.2.1 田間設(shè)計(jì) 大田試驗(yàn)于2013年10月—2014年6月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院轉(zhuǎn)基因作物實(shí)驗(yàn)基地(六合)進(jìn)行。每個(gè)品種種植4個(gè)小區(qū)，隨機(jī)區(qū)組。每個(gè)小區(qū)長10 m，寬6 m。小麥按行播種，行長6 m，行距30 cm，株距3 cm。

1.2.2 土壤樣品的采集 分別在小麥生長的播種期、苗期、返青期、抽穗期、灌漿期以及成熟期采集根際土壤樣品。每個(gè)小區(qū)采取“W”型五點(diǎn)取樣法，采集小麥根際土壤樣品。采樣點(diǎn)經(jīng)GPS定位后，設(shè)為固定采樣點(diǎn)。將從5個(gè)點(diǎn)采集的土樣混合成一個(gè)重復(fù)，新鮮土樣經(jīng)20目篩后，用小自封袋收集，4℃保存，備用。

1.2.3 土壤總DNA的提取 稱取0.500 g土壤樣品，利用Ultra CleanTMsoil DNA isolation kit(MoBio，USA)試劑盒，根據(jù)操作步驟進(jìn)行土壤總DNA的提取。最后將其溶于50μl ddH2O中，－20℃保存，備用。

1.2.4 禾谷多黏菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備 在NCBI中篩選出多個(gè)禾谷多黏菌核糖體DNA(rDNA)序列，通過序列分析，在其相對于其他菌的rDNA保守區(qū)域設(shè)計(jì)1對特異性引物Pg-F(5'-CTGCGGAAGGATCATTAGCGTTG-3')和 Pg-R(5'-CCGATACTCAGAGAGGCATGCT-3')。利用上述引物對土壤總DNA中的目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25.0 μl，其中包括 rTaq酶 0.125 μl，10 ×PCR buffer 2.5 μl，dNTP 2.0 μl，MgCl21.5 μl，上下游引物各1.0μl，模板1.0μl。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將特異條帶切膠回收?；厥债a(chǎn)物連接到載體pMD19-T(TaKaRa公司產(chǎn)品)上，并通過熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α。將其涂布在氨芐抗性平板上，37℃過夜篩選。PCR鑒定呈陽性的克隆送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果呈陽性的克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒。經(jīng)微量紫外分光光度計(jì)測定濃度后，計(jì)算拷貝數(shù)。質(zhì)?？截悢?shù)=質(zhì)粒濃度×6.023×1023/MW，式中MW=(克隆載體長度+目的片段長度)×324×2，質(zhì)粒濃度的單位為 g/μl，MW 單位為g/mol，克隆載體長度和目的片段長度的單位為bp。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR體系的建立 使用QuantiFastTMSYBR green PCR kit(Qiagen，Germany)試劑盒，建立20.0μl的反應(yīng)體系，其中2×Master mix 10.0μl，去離子水8.0μl，上下游引物各 0.5 μl，模板1.0μl。反應(yīng)在 Rotor Gene 6000熒光定量PCR儀(Rcorbett，Australia)上進(jìn)行，PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。每組試驗(yàn)設(shè)置1個(gè)陰性對照。將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒用ddH2O進(jìn)行1∶10的稀釋，選5個(gè)稀釋梯度與樣品一起進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 用SPSS16.0軟件統(tǒng)計(jì)分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)，采用鄧肯氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)小麥不同生長期根際土壤中禾谷多黏菌數(shù)量的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 禾谷多黏菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測體系的建立

通過微量紫外分光光度計(jì)測得標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的DNA濃度，計(jì)算得到禾谷多黏菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的濃度為1μl 5.34×1010拷貝。將起始標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒按10倍梯度稀釋，并根據(jù)敏感度分析選取10－2～10－6倍稀釋質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增。得到標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線和熔解曲線(圖1)。圖1顯示，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒熔解曲線峰值單一，擴(kuò)增曲線較光滑，呈現(xiàn)典型的“S”型，且間隔均勻，說明標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒熒光定量擴(kuò)增的特異性很高。

由標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒擴(kuò)增結(jié)果構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(r)為0.999，擴(kuò)增效率為95%，斜率為－3.444。說明該標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)誤差較小，得到的數(shù)據(jù)合理有效。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒與土壤樣品擴(kuò)增結(jié)果繪制熔解曲線(圖3)，熔解曲線的峰值為 (85.5±0.3)℃。峰值單一，沒有明顯的雜峰，且陰性對照沒有峰。說明該擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較高，且不受引物二聚體的影響。

綜合以上結(jié)果，可以確定該擴(kuò)增體系具有較高的特異性、合理的擴(kuò)增效率，擴(kuò)增結(jié)果可靠。因此，該體系可用于對小麥根際土壤中禾谷多黏菌的定量檢測與分析。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR對標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的特異性檢測Fig.1 Specificity test of quantitative real-time PCR reaction to standard plasmid

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of quantitative real-time PCR

2.2 小麥根際土壤中禾谷多黏菌數(shù)量的檢測

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的熔解曲線Fig.3 Melting curve of quantitative real-time PCR

利用本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測體系，對轉(zhuǎn)基因小麥N12-1及其受體揚(yáng)麥158根際土壤中禾谷多黏菌的數(shù)量進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果(圖4)顯示，禾谷多黏菌的拷貝數(shù)在小麥的不同生長期不同，呈現(xiàn)先上升后逐漸下降的趨勢。從小麥播種期的1 g土壤 5.98 ×104拷貝(N12-1)和 4.86 ×104拷貝(揚(yáng)麥158)開始逐漸升高，在返青期達(dá)到最大值，分別為 1 g土壤 6.59×105拷貝(N12-1)和 8.37×105拷貝(揚(yáng)麥158)，而在抽穗期、灌漿期和成熟期又逐漸下降。方差分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小麥N12-1與其受體揚(yáng)麥158根際土壤中禾谷多黏菌的拷貝數(shù)無顯著差異(P=0.983)，但生育期之間表現(xiàn)出極顯著差異(P＜0.001)。

圖4 轉(zhuǎn)WYMV-Nib8基因小麥N12-1及其受體揚(yáng)麥158不同生育期根際土壤中禾谷多黏菌的拷貝數(shù)Fig.4 The quantity of P.graminis in transgenic wheat N12-1 and its recipient Yangmai158 during growth

3 討論

隨著轉(zhuǎn)基因作物種植面積的不斷擴(kuò)大，轉(zhuǎn)基因作物的安全性評價(jià)也不再僅僅局限于對外源基因及外源基因編碼蛋白質(zhì)的直接檢測上［14］。在整個(gè)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，土壤微生物扮演著重要的角色。土壤微生物是土壤有機(jī)質(zhì)和土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)的動(dòng)力，而其群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量又受到植物根系分泌物的影響［15］。據(jù)報(bào)道，土壤中微生物的變化也能反映整個(gè)土壤環(huán)境的變化，例如土壤中真菌與細(xì)菌的比率就能反映土壤中的C∶N。因此，評價(jià)轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物的影響具有重要的生態(tài)學(xué)意義［16］。而在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，與土壤環(huán)境對土壤微生物群落組成的影響相比，土壤微生物數(shù)量對土壤環(huán)境的變化要更為敏感［17］。。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一種靈敏度高、重復(fù)性好、方便快捷的定量方法［18-19］。本試驗(yàn)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，通過土壤微生物總DNA和特異性的引物對目的基因在土壤樣品中的分子數(shù)目進(jìn)行絕對定量。結(jié)果表明，基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)建立的檢測體系可實(shí)現(xiàn)對土壤中禾谷多黏菌拷貝數(shù)的實(shí)時(shí)監(jiān)測。通過轉(zhuǎn)基因小麥N12-1與其受體揚(yáng)麥158根際土壤中禾谷多黏菌數(shù)量的比較，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)品種之間不存在顯著差異。由此推斷，轉(zhuǎn)基因小麥N12-1對其根際土壤中禾谷多黏菌的數(shù)量沒有顯著影響。而禾谷多黏菌拷貝數(shù)在小麥生育期之間的極顯著差異可能是受到小麥根系分泌物的影響。在返青期達(dá)到最大值也與小麥黃花葉病通常發(fā)病于小麥返青期相一致［20］。Wu等研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小麥N12-1對其根際土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)及土壤酶活性沒有顯著影響［21］。而早在 2008 年，Liu 等［22］就通過PCR-DGGE和T-RFLP分析，證明了轉(zhuǎn)Bt基因水稻對其根系土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)沒有影響。更有學(xué)者證明轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈還田后對土壤微生物功能及多樣性都沒有明顯的影響［23］。因此，本研究結(jié)果也在一定程度上有效地說明了轉(zhuǎn)基因小麥N12-1種植的安全性。

由于作物種植環(huán)境的復(fù)雜性和時(shí)效性，我們還需進(jìn)行進(jìn)一步的跟蹤監(jiān)測，建立深入全面的檢測體系，以獲得長期有效的數(shù)據(jù)，進(jìn)而闡明轉(zhuǎn)基因小麥N12-1對其根際土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)的影響。

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