免疫透射比濁法在AU5800全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)降鈣素原的方法學(xué)評(píng)價(jià)

戴婉如，周 歡，林燕輝，伍嚴(yán)安(福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)科，福州 300001)

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免疫透射比濁法在AU5800全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)降鈣素原的方法學(xué)評(píng)價(jià)

戴婉如，周 歡，林燕輝，伍嚴(yán)安(福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)科，福州 300001)

目的 在AU5800全自動(dòng)生化分析儀上用免疫透射比濁法檢測(cè)降鈣素原(PCT)的方法學(xué)評(píng)價(jià)。方法通過(guò)AU5800全自動(dòng)生化分析儀來(lái)檢測(cè)PCT的精密度、線性、參考區(qū)間等指標(biāo)，并與酶免疫熒光法試劑盒進(jìn)行相關(guān)性比較，從而評(píng)價(jià)其性能。結(jié)果 該方法批內(nèi)和批間精密度分別小于8%和15%；0～80 ng/mL范圍內(nèi)線性良好(Y=0.994 1X+0.124 5，R2=0.999)；正常人群的參考范圍為小于0.5 ng/mL；與酶免疫熒光法的相關(guān)性良好(Y=0.357 4X+0.284 2，R2=0.960 7)。結(jié)論 本檢測(cè)方法不僅實(shí)現(xiàn)了PCT檢測(cè)的快速、全自動(dòng)化，而且化學(xué)性能優(yōu)良、操作簡(jiǎn)單，降低了臨床試劑成本，適合臨床推廣使用。

降鈣素原； 免疫比濁法； 方法學(xué)評(píng)價(jià)； 免疫熒光法

降鈣素原(PCT)在臨床主要應(yīng)用于感染性疾病的鑒別[1]，是診斷血行感染、菌血癥、敗血癥的一個(gè)較好指標(biāo)[2-3]。目前PCT的檢測(cè)方法主要有放射免疫法、雙抗體夾心法、膠體金法、免疫熒光法、免疫透射比濁法等。本研究選用的國(guó)產(chǎn)免疫透射比濁法，具有快速、簡(jiǎn)便，且價(jià)格相對(duì)較低廉的特點(diǎn)。根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)和醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)(ISO15189)對(duì)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量的要求[4]，實(shí)驗(yàn)室對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)(儀器、試劑、校準(zhǔn)品等)必須進(jìn)行性能驗(yàn)證[5]。因此，實(shí)驗(yàn)室需要對(duì)廠商聲明的主要分析性能進(jìn)行驗(yàn)證。本文對(duì)AU5800檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定PCT進(jìn)行精密度、線性范圍、參考區(qū)間等指標(biāo)的方法學(xué)評(píng)價(jià)，再與酶免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，觀察結(jié)果相關(guān)性，以此來(lái)評(píng)價(jià)該檢測(cè)方法在臨床上的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 患者標(biāo)本為2013年10～11月實(shí)驗(yàn)室接收的67例臨床送檢標(biāo)本。酶免疫熒光法隨時(shí)檢測(cè)送檢標(biāo)本，剩余血清-80 ℃保存用于免疫比濁法測(cè)試(一次性完成)。正常人群均為健康體檢者，年齡16～77歲，選擇血常規(guī)、C反應(yīng)蛋白(CRP)正常，即無(wú)急、慢性炎癥的體檢合格標(biāo)本20例。

1.2 儀器與試劑 貝克曼AU5800全自動(dòng)生化分析儀，梅里埃全自動(dòng)熒光分析儀。安徽大千生物工程有限公司生產(chǎn)的PCT測(cè)定試劑盒(免疫透射比濁法)(批號(hào)085813)，標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)084113)和質(zhì)控品(批號(hào)084213)。梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司進(jìn)口的PCT測(cè)定試劑盒(酶免疫熒光法)(批號(hào)1002326640)，校準(zhǔn)品(批號(hào)1057790)和質(zhì)控品(批號(hào)1057880)。

1.3 方法

1.3.1 免疫透射比濁法 樣品中的PCT與試劑中的PCT抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，形成復(fù)合物，從而引起透光度減低，在一定范圍內(nèi)與樣本中PCT量呈線性相關(guān)。

1.3.2 酶免疫熒光法 結(jié)合一步免疫測(cè)定夾心法和最終熒光檢測(cè)來(lái)進(jìn)行測(cè)定。

1.4 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 精密度評(píng)價(jià) 按照CLSI EP15-A2，取2個(gè)濃度水平質(zhì)控品，5 d實(shí)驗(yàn)，每天做1批，每批每個(gè)水平3次重復(fù)測(cè)定，計(jì)算批內(nèi)精密度和批間精密度的均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

1.4.2 線性評(píng)價(jià) 選擇低濃度(L)和高濃度(H)患者標(biāo)本各1份，濃度覆蓋儀器說(shuō)明書(shū)給出的線性范圍，H和L按等比關(guān)系配制形成系列濃度血清(如1L，0.8L+0.2H，0.6L+0.4H，0.4L+0.6H，0.2L+0.8H，1H)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品在檢測(cè)系統(tǒng)上重復(fù)測(cè)定2次，記錄結(jié)果。將實(shí)測(cè)值與預(yù)期值作比較。采取平均斜率來(lái)確定系列樣品應(yīng)含有的待測(cè)物的預(yù)期值(X)，所有樣品重復(fù)測(cè)定的均值為實(shí)測(cè)值(Y)，將所有結(jié)果點(diǎn)在X-Y坐標(biāo)圖上，計(jì)算回歸方程:Y=bX+a和R2，并用t檢驗(yàn)驗(yàn)證a是否與0差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4.3 參考區(qū)間評(píng)價(jià) 參考NCCLSC28-A2文件，選擇20份體檢合格的健康人標(biāo)本，在檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行測(cè)定，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并對(duì)儀器說(shuō)明書(shū)提供的參考區(qū)間進(jìn)行驗(yàn)證，若20份標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果均在儀器說(shuō)明書(shū)提供的參考區(qū)間內(nèi)或僅有2個(gè)標(biāo)本超出，則驗(yàn)證通過(guò)。否則，進(jìn)行參考區(qū)間確立實(shí)驗(yàn)。

1.4.5 相關(guān)性評(píng)價(jià) 通過(guò)67例不同病例分別用酶免疫熒光法和免疫透射比濁法測(cè)定，比較兩者的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件和Microsoft Excel 2000軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PCT精密度結(jié)果 精密度評(píng)價(jià)結(jié)果符合廠家聲明的批內(nèi)精密度CV≤8.0%、批間精密度CV≤15.0%。該檢測(cè)系統(tǒng)的批內(nèi)精密度和批間精密度均滿足檢測(cè)要求。見(jiàn)表1。

表1 PCT的精密度

2.2 線性結(jié)果R2=0.999，b=0.994 1，1.03≥b≥0.97；a=0.124 5，經(jīng)t檢驗(yàn)t=0.371，小于t0.05=2.228，顯示a與0差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。驗(yàn)證結(jié)果表明PCT在0～58.8 ng/mL范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系，與廠家提供線性范圍0～80 ng/mL相符合。見(jiàn)表3和圖1。

表3 6個(gè)稀釋濃度標(biāo)本PCT結(jié)果(ng/mL)

注:X為各組數(shù)據(jù)的理論值，Y為各組實(shí)測(cè)值減去“1”號(hào)實(shí)測(cè)均值后的數(shù)值(實(shí)測(cè)值)。

圖1 PCT的線性測(cè)定

2.3 參考區(qū)間的驗(yàn)證 參考NCCLSC28-A2文件，選擇20份體檢合格的健康人血清標(biāo)本，在檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行測(cè)定。經(jīng)驗(yàn)證20份健康人血清標(biāo)本濃度均在儀器說(shuō)明書(shū)提供的參考區(qū)間內(nèi)，符合試劑說(shuō)明書(shū)提供參考范圍，無(wú)結(jié)果超出所驗(yàn)證的參考范圍，參考范圍通過(guò)驗(yàn)證，表明正常人群PCT參考范圍為小于0.5 ng/mL。

2.4 相關(guān)性實(shí)驗(yàn) 取67例標(biāo)本同時(shí)用酶免疫熒光法和免疫透射比濁法測(cè)定，結(jié)果表明兩者相關(guān)性良好，Y=0.357 4X+0.284 2，R2=0.960 7。見(jiàn)圖2。

圖2 免疫比濁法和免疫熒光法檢測(cè)PCT結(jié)果比對(duì)

3 討 論

根據(jù)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)(ISO15189)對(duì)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量的要求，實(shí)驗(yàn)室對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)(儀器、試劑、校準(zhǔn)品等)必須進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)試劑驗(yàn)證包括：精密度、線性、準(zhǔn)確度和參考范圍等[6]。

精密度評(píng)價(jià)按照CLSI EP15-A2文件進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示在AU5800全自動(dòng)生化分析儀上PCT測(cè)定的精密度達(dá)到了廠家檢測(cè)聲明，批內(nèi)和批間精密度分別小于8%和15%。線性評(píng)價(jià)即分析測(cè)量范圍評(píng)價(jià)根據(jù)EP6-A文件，采用簡(jiǎn)便的平均斜率法。在AU5800全自動(dòng)生化分析儀上PCT的濃度在0～58.8 ng/mL范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系，由于PCT達(dá)到80 ng/mL的血清標(biāo)本難以獲得，最高檢測(cè)限58.8 ng/mL偏低于廠家的最高測(cè)定值，有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。參考區(qū)間的驗(yàn)證參考NCCLSC28-A2文件，選擇20份體檢合格的健康人血清標(biāo)本全部通過(guò)驗(yàn)證。與法國(guó)梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司進(jìn)口的PCT測(cè)定試劑盒(酶免疫熒光法)進(jìn)行相關(guān)性實(shí)驗(yàn)，表明PCT免疫比濁法結(jié)果同樣可靠(n=67，R2=0.960 7)。

目前檢測(cè)PCT的方法很多[7]。傳統(tǒng)的放射免疫法敏感性較高，但檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，且有放射性元素污染，使用受限；膠體金法為半定量法，不依賴儀器，操作簡(jiǎn)便快速，但敏感性低，線性范圍小無(wú)法滿足臨床需求，只能作為臨床篩查；免疫發(fā)光法具有敏感度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，但是成本昂貴，不利于臨床推廣[8]。臨床需要一種快捷、準(zhǔn)確、成本相對(duì)低廉的PCT測(cè)定方法，以便于臨床廣泛推廣應(yīng)用。免疫比濁法簡(jiǎn)便、快捷，適用于波長(zhǎng)包括600 nm的各種生化分析儀，可滿足臨床急診及批量檢測(cè)的需要；而且成本較低，可以大大減低患者的檢測(cè)費(fèi)用。

綜上所述，免疫比濁法檢測(cè)PCT的各項(xiàng)性能指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證和評(píng)價(jià)，均能滿足臨床檢測(cè)的要求，具有良好的發(fā)展前景。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.10.049

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