耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌表型檢測及其耐藥性研究*

萬 芳，陳 恒，柯茂彬，崔敏濤，魯 艷，李永聯(lián)，吳學(xué)詩(.廣東省佛山市同江醫(yī)院檢驗(yàn)科 58300；.湖北省孝感市中心醫(yī)院院感科 4300)

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耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌表型檢測及其耐藥性研究*

萬 芳1，陳 恒1，柯茂彬1，崔敏濤1，魯 艷2，李永聯(lián)1，吳學(xué)詩1(1.廣東省佛山市同江醫(yī)院檢驗(yàn)科 528300；2.湖北省孝感市中心醫(yī)院院感科 432100)

目的 了解耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(CRE)感染狀況及其產(chǎn)酶類型。方法 采用最低抑菌濃度(MIC)法分析腸桿菌科細(xì)菌的耐藥情況。采用厄他培南紙片擴(kuò)散法初篩產(chǎn)碳青霉烯酶菌株，對初篩陽性菌株分別采用改良Hodge試驗(yàn)、加硼酸或苯唑西林的改良Hodge試驗(yàn)、EDTA亞胺培南復(fù)合紙片法進(jìn)行表型確證。結(jié)果 腸桿菌科細(xì)菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為2.7%、2.3%。厄他培南紙片擴(kuò)散法初篩陽性菌株11株，其中改良Hodge確證試驗(yàn)陽性(或弱陽性)菌株3株，包括產(chǎn)金屬酶菌株1株，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)或AmpC 酶菌株2株。2株改良Hodge確證試驗(yàn)弱陽性菌中未檢出碳青霉烯酶基因，但檢出AmpC、TEM、CTX-M基因，改良Hodge試驗(yàn)陽性菌中檢出blaIMP 基因。結(jié)論 改良Hodge試驗(yàn)、加硼酸或苯唑西林改良Hodge試驗(yàn)及EDTA亞胺培南復(fù)合紙片法相結(jié)合進(jìn)行碳青霉烯酶檢測，在暫無條件開展基因分型的醫(yī)院具有很好的應(yīng)用前景。

腸桿菌科細(xì)菌； 碳青霉烯酶表型； 耐藥性分析

碳青霉烯類抗菌藥物以其對β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定、毒性低等特點(diǎn)，已成為臨床治療腸桿菌科細(xì)菌重癥感染最主要的抗菌藥物之一。近年文獻(xiàn)報(bào)道顯示，耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(CRE)迅速增多，給臨床抗感染治療帶來了極大困擾。產(chǎn)生碳青霉烯酶是CRE對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要原因[1]?；蚍治鍪菣z測碳青霉烯酶最成熟的方法，但由于其操作步驟繁瑣、費(fèi)用高、需特殊儀器，不能用于常規(guī)檢測[1]。本研究旨在建立快速、簡便、準(zhǔn)確的CRE表型確證方法，從而了解同江醫(yī)院CRE感染情況及其產(chǎn)酶類型，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料 與方法

1.1 菌株來源 收集2012年1月到2014年6月同江醫(yī)院初次分離臨床采集的對1種或多種第三代頭孢菌素耐藥的腸桿菌科細(xì)菌(耐藥腸桿菌科細(xì)菌)共300株。標(biāo)本來源包括靜脈血、中段尿、膿液、痰、氣管內(nèi)抽吸液、肺泡灌洗液、傷口分泌物等，采用Phoenix100微生物自動鑒定與藥敏系統(tǒng)鑒定到種，產(chǎn)碳青霉烯酶初篩陽性菌株采用半固體培養(yǎng)基保存于4 ℃條件下，每3個(gè)月轉(zhuǎn)種。

1.2 儀器與試劑 亞胺培南(IPM)、美羅培南(MEM)藥敏紙片、MH瓊脂購自杭州天和微生物有限公司；厄他培南(ETP)藥敏紙片購自英國Oxoid公司；血平板、巧克力、麥康凱平板購自廣州市迪景微生物科技有限公司。苯唑西林鈉(瑞陽制藥有限公司)，苯硼酸(北京維達(dá)化工有限公司)，EDTA(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)，二甲基亞砜(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，BD 9120血培養(yǎng)儀、Phoenix100微生物自動鑒定與藥敏系統(tǒng)均為美國BD公司產(chǎn)品。基因檢測由廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心合作完成。

1.3 方法

1.3.1 藥敏試驗(yàn) 在全自動細(xì)菌鑒定儀上采用最低抑菌濃度(MIC)法測定，根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)2010的標(biāo)準(zhǔn)判斷藥敏結(jié)果。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.3.2 碳青霉烯酶篩選和表型確證試驗(yàn) (1)初篩：采用CLSI推薦的厄他培南紙片擴(kuò)散法，實(shí)驗(yàn)方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[2]。(2)改良Hodge試驗(yàn)：對初篩陽性菌株用改良Hodge試驗(yàn)進(jìn)行確證，實(shí)驗(yàn)方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[2]。(3)金屬酶表型篩選試驗(yàn)：對改良Hodge試驗(yàn)陽性菌株進(jìn)行EDTA亞胺培南復(fù)合紙片法，實(shí)驗(yàn)方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[3]。(4)加硼酸與苯唑西林的改良Hodge試驗(yàn)：參照文獻(xiàn)[4]，通過不同的圖形來區(qū)分A組碳青霉烯酶、AmpC 酶及非A組碳青霉烯酶。

1.4 基因確證 對改良Hodge表型確證試驗(yàn)陽性菌株及部分陰性的可疑菌株進(jìn)行PCR檢測Ambler A組碳青霉烯酶基因(blaKPc、blaIMI)，Ambler B組碳青霉烯酶基因(blaIMPbla)和Ambler D組碳青霉烯酶基因(blaOXA)，對改良Hodge試驗(yàn)陽性株加測AmpC 及ESBL基因(blaTEM、blaSHV和blaCTX-M)。所用引物參考文獻(xiàn)[5-7]，與廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心合作完成基因檢測。

1.5 臨床資料分析 回顧分析改良Hodge表型確證試驗(yàn)陽性菌株及部分陰性的可疑菌株患者的臨床資料，包括一般個(gè)人資料、用藥情況、感染潛在危險(xiǎn)因素等。

2 結(jié) 果

2.1 耐藥腸桿菌科細(xì)菌分布情況 300株耐藥腸桿菌科細(xì)菌的菌種分布以大腸埃希菌(168株，56.0%)和肺炎克雷伯菌(108株，36.0%)為主，另有陰溝腸桿菌6株(2.0%)、產(chǎn)氣腸桿菌6株(2.0%)、奇異變形桿菌6株(2.0%)、弗勞地枸櫞酸桿菌3株(1.0%)、產(chǎn)酸克雷伯菌3株(1.0%)。300株耐藥腸桿菌科細(xì)菌的標(biāo)本分布：痰(40.8%)、中段尿(31.1%)、靜脈血(10.8%)、其他無菌體液及膿液等(共17.3%)。

2.2 耐藥腸桿菌科細(xì)菌藥敏結(jié)果 分離的300株耐藥腸桿菌科細(xì)菌對亞胺培南、美羅培南的耐藥率分別為2.7%、2.3%，對阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率均低于10.0%，除此以外，對其他常用藥物的體外耐藥率均大于50.0%，見表1。

表1 300株耐藥腸桿菌科細(xì)菌藥敏結(jié)果(%)

續(xù)表1 300株耐藥腸桿菌科細(xì)菌藥敏結(jié)果(%)

2.3 碳青霉烯酶表型檢測結(jié)果 厄他培南紙片擴(kuò)散法初篩碳青霉烯酶表型為陽性的耐藥腸桿菌科細(xì)菌共11株，陽性率為3.67%，其中5株經(jīng)MIC法檢測對美羅培南或亞胺培南敏感或中介。改良Hodge確證試驗(yàn)弱陽性2株，陽性1株(圖1A)，均為肺炎克雷伯菌，對這3株改良Hodge確證試驗(yàn)陽性菌進(jìn)行金屬酶及加硼酸、苯唑西林的改良Hodge試驗(yàn)，檢出金屬酶表型陽性菌1株(圖1B)，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)或AmpC 酶2株(圖1C、1D)。

注：A為改良Hodge確證試驗(yàn)結(jié)果，其中單箭頭表示弱陽性，雙箭頭表示陽性；B為金屬酶表型篩選試驗(yàn)陽性結(jié)果；C為加硼酸改良Hodge試驗(yàn)結(jié)果，其中雙箭頭表示陽性，單箭頭表示陰性；D為加苯唑西林改良Hodge試驗(yàn)結(jié)果，其中雙箭頭表示陽性，單箭頭表示陰性。

圖1 碳青霉烯酶表型檢測結(jié)果

2.4 基因檢測 送檢的11株初篩碳青霉烯酶表型陽性的耐藥腸桿菌科細(xì)菌中，改良Hodge試驗(yàn)陰性的菌株菌未攜帶blaKPc、blaIMI、blaIMP、blaOXA碳青霉烯酶基因，2株改良Hodge試驗(yàn)弱陽性的菌株中未檢出相關(guān)碳青霉烯酶基因，但檢出了AmpC、TEM、CTX-M基因，改良Hodge試驗(yàn)陽性菌株中檢出了blaIMP 基因，見表2。

2.5 方法學(xué)比較 以基因檢測結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，比較了MIC法、厄他培南紙片擴(kuò)散法、改良Hodge試驗(yàn)、加硼酸與加苯唑西林Hodge試驗(yàn)結(jié)合金屬酶表型篩選試驗(yàn)的診斷性能，見表3。

表2 基因分析與表型檢測結(jié)果比較

注：kpn表示肺炎克雷伯菌；+/-表示弱陽性；+表示陽性；-表示陰性。

表3 不同方法檢測碳青霉烯酶診斷性能(%)

2.6 臨床資料分析 查閱相關(guān)患者的病歷資料，本研究菌株來源以老年患者、ICU住院患者及手術(shù)患者為主，多有轉(zhuǎn)科、使用呼吸機(jī)、連續(xù)使用頭孢菌素類抗菌藥物超3 d以上的記錄，尤其在檢出改良Hodge確證試驗(yàn)陽性菌的3例患者中，有1例患者連續(xù)使用頭孢菌素類抗菌藥物5 d，1例患者連續(xù)使用哌拉西林/他唑巴坦超過7 d，1例患者7 d內(nèi)交替使用哌拉西林/他唑巴坦、美羅培南、左氧氟沙星，甚至發(fā)現(xiàn)在同一科室中有使用同一種頭孢菌素類抗菌藥物的用藥習(xí)慣。

3 討 論

大多數(shù)醫(yī)院在全自動細(xì)菌鑒定儀上采用MIC法檢測CRE，但由于KPC型碳青霉烯酶(KPC酶)一般僅引起細(xì)菌對碳青酶烯類藥物低水平耐藥，常規(guī)檢測方法易誤認(rèn)為產(chǎn)ESBLs，不能有效檢測出產(chǎn)KPC酶菌株[8-9]。CLSI推薦的改良Hodge試驗(yàn)用于碳青霉烯酶表型確證，亦存在特異性較低、無法分型、產(chǎn)ESBLs或AmpC 酶菌株易導(dǎo)致試驗(yàn)假陽性的缺點(diǎn)[10]。而利用加硼酸或加苯唑西林的改良Hodge試驗(yàn)，能夠很簡單地區(qū)分出A組、非A組碳青霉烯酶與ESBLs或AmpC 酶，聯(lián)合B類金屬酶篩選試驗(yàn)則可在不使用基因分析的基礎(chǔ)上快速、簡便、準(zhǔn)確地對CRE進(jìn)行表型確證分型[11]，這在暫無條件開展基因分型的醫(yī)院具有很好的應(yīng)用前景。本研究結(jié)果亦顯示出其較佳的診斷性能，與以往研究不同的是，4種方法均有較好的敏感性與陰性預(yù)測值[12]，分析原因?yàn)楸敬螜z測的菌株數(shù)量較少，可能存在統(tǒng)計(jì)學(xué)偏差。CLSI在2013年更新了碳青霉烯酶篩選試驗(yàn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)，可以較好地篩選出疑似產(chǎn)酶株，大大減少了實(shí)際工作中CRE監(jiān)測的工作量；酶抑制劑的應(yīng)用可較準(zhǔn)確地分析出細(xì)菌耐藥機(jī)制，對及時(shí)識別CRE、合理選擇抗菌藥物及醫(yī)院感染防控有重要意義。

CRE耐碳青酶烯類抗菌藥物的機(jī)制簡單說來主要有兩大類，其一為膜孔蛋白表達(dá)質(zhì)和(或)量的缺失合并對碳青霉烯類抗菌藥物有微弱水解活性的β內(nèi)酰胺酶(AmpC 酶和ESBLs)的過表達(dá)；另一機(jī)制是獲得具有編碼碳青霉烯類抗菌藥物水解活性的碳青霉烯酶基因[13]。在我國，腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機(jī)制主要是產(chǎn)KPC酶和金屬酶[14]。本研究未檢出KPC酶，但檢出了1例產(chǎn)金屬酶的肺炎克雷伯菌，這與患者來源、檢測數(shù)量及地域性差異有關(guān)。需要特別注意的是，本次通過改良Hodge試驗(yàn)檢出了產(chǎn)AmpC 和產(chǎn)ESBLs的菌株，這些細(xì)菌以過表達(dá)AmpC 酶合并OmpF或OmpC膜孔蛋白修飾為特征，同時(shí)社區(qū)獲得性產(chǎn)CTX-M型菌株在世界范圍內(nèi)的廣泛播散導(dǎo)致厄他培南耐藥菌株不斷出現(xiàn)[15]，給臨床抗感染治療帶來極大的困擾。

導(dǎo)致CRE產(chǎn)生的危險(xiǎn)因素包括侵襲性操作(特別是外科手術(shù))、導(dǎo)尿管留置、床位的頻繁更換和應(yīng)用廣譜抗菌藥物[16-17]。也有資料顯示，對有基礎(chǔ)并發(fā)病的患者，醫(yī)院獲得性感染比抗菌藥物選擇更重要[18]。本研究發(fā)現(xiàn)碳青酶烯類抗菌藥物的應(yīng)用不是導(dǎo)致本院出現(xiàn)產(chǎn)酶菌株的主要原因，不良的用藥習(xí)慣、高危人群的存在、醫(yī)務(wù)人員感染防控意識不強(qiáng)，更能導(dǎo)致耐藥菌株的播散。

對CRE的控制手段中，早期識別雖然重要，防患于未然更重要，只有加強(qiáng)對抗菌藥物臨床合理應(yīng)用的監(jiān)管，減少侵襲性操作，掌握CRE早期監(jiān)測手段，嚴(yán)格執(zhí)行手衛(wèi)生，實(shí)施接觸防護(hù)措施，大力發(fā)揮公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)的作用，擴(kuò)大CRE防控范圍[13]，同步做好院感防控、監(jiān)測、治療三方面的工作，才能真正做到控制CRE多重耐藥菌醫(yī)院感染的發(fā)生。

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Research on the phenotype and drug resistance of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae*

WANFang1，CHENHeng1，KEMao-bin1，CUIMin-tao1，LUYan2，LIYong-lian1，WUXue-shi1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,TongjiangHospital,Foshan,Guangdong528300,China;2.DepartmentofHospitalInfectionControl,CentralHospitalofXiaogan,Xiaogan,Hubei432100,China)

Objective To explore the phenotype and drug resistance of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae(CRE).Methods Minimal inhibitory concentration(MIC) method was used to analyze the drug resistance of Enterobacteriaceae.Kirby-Bauer (Ertapenem) was used to screen the carbapenemases strains.Improving Hodge experiment，the one with adding boric acid and Kirby-Bauer compounding oxacillin and EDTA-Imipenem were used to confirmed the phenotype.Results The drug resistance rate of Enterobacteriacea to imipenem(IPM) and meropenem (MEM) were 2.7% and 2.2%，in 11 pcs screening positive by Kirby-Bauer (ETP)，3 pcs improved Hodge tested positive，1 pic carbapenemases tested by phenotype，2 pcs ESBLs or AmpC enzyme.2 pcs weekly positive tested AmpC，TEM，and CTX-M gene，not carbapenemases.The blaIMP gene were tested.improved Hodge positive plants.Conclusion The corporation of improved Hodge experiment，the one with adding boric acid and Kirby-Bauer compounding oxacillin and EDTA-Imipenem has good performance on CRE testing.

Enterobacteriaceae； carbapenemases； analysis of drug resistance

廣東省佛山市順德區(qū)醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(2013091)。

萬芳，女，本科，副主任技師，主要從事微生物檢驗(yàn)技術(shù)與輸血管理研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.10.013

A

1672-9455(2015)10-1369-03

2014-11-05

2015-01-19)