肺炎支原體肺炎患兒肺泡灌洗液病菌量與臨床特征相關性研究*

王亞坤，高文杰△，王 偉，杜習霞，杜 安，王艷艷(.河北省兒童醫(yī)院小兒內(nèi)科，石家莊05000；.河北省兒童醫(yī)院護理學，石家莊 05000；.河北省石家莊市婦產(chǎn)醫(yī)院護理學，石家莊050000；.日本城西國際大學藥學，日本 6-7)

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肺炎支原體肺炎患兒肺泡灌洗液病菌量與臨床特征相關性研究*

王亞坤1，高文杰1△，王 偉2，杜習霞3，杜 安4，王艷艷1(1.河北省兒童醫(yī)院小兒內(nèi)科，石家莊050030；2.河北省兒童醫(yī)院護理學，石家莊 050030；3.河北省石家莊市婦產(chǎn)醫(yī)院護理學，石家莊050000；4.日本城西國際大學藥學，日本 261-7114)

目的 研究肺炎支原體(MP)肺炎患兒肺泡灌洗液(BALF)中MP-DNA基因拷貝數(shù)和患兒病情嚴重程度的關系。方法 選取河北省兒童醫(yī)院2012年10月至2013年12月收治的82例MP肺炎患兒作為研究對象，行支氣管鏡下支氣管肺泡灌洗(BAL)，采用熒光實時定量聚合酶鏈反應(FQ-PCR)對肺泡灌洗液中MP-DNA定量檢測，并根據(jù)檢測結果的基因拷貝數(shù)分為低菌量組(MP-DNA的拷貝數(shù)<103/mL的患兒)，中等菌量組(MP-DNA的拷貝數(shù)為103～106/mL的患兒)和高菌量組(MP-DNA的拷貝數(shù)>106/mL的患兒)。比較不同菌量組患兒的臨床癥狀、實驗室檢查結果和影像學結果。結果 高菌量組患兒總病程長，高熱患兒和熱程大于或等于7 d的患兒數(shù)量均多于中、低菌量組，使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物后退熱時間也較其他兩組更長，差異均具有統(tǒng)計學意義(P=0.027、P=0.025、P=0.029、P=0.003)。實驗室檢查中高菌量組C反應蛋白值升高明顯，高于中低菌量組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.005)。影像學檢查中高菌量組大片肺實變、肺不張者較、低菌量組多(P=0.002)。低菌量組未見雙側胸腔積液或大量胸腔積液患兒，中高菌量組此癥狀患兒較多，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.033)。結論 MP肺炎患兒BALF病菌量和臨床表現(xiàn)密切相關，高菌量組患兒病情更為嚴重?？赡芘c患兒體內(nèi)的肺炎支原體不易清除和存在較強的免疫反應有關，臨床需延長抗菌藥物治療時間以及加強免疫治療。

肺炎支原體； 肺泡灌洗液； 兒童

肺炎支原體(MP) 是引起兒童下呼吸道感染的常見病原體之一[1-2]。以往認為MP肺炎病程有自限性，患兒臨床癥狀較輕、治療順利，但近年來重癥與難治性MP肺炎有增加趨勢，部分患兒臨床癥狀重、病程長、治療效果差，易導致肺不張、支氣管擴張等并發(fā)癥，嚴重者甚至威脅患兒生命[3]。不同患兒MP肺炎的嚴重程度不同，MP的致病性、耐藥性及宿主的免疫力等是影響病情的主要因素。局部MP菌量客觀反映了病菌與宿主免疫力之間的關系[4-5]，MP一方面通過代謝產(chǎn)物對組織造成直接損害，另一方面引發(fā)局部炎性反應與免疫反應使機體產(chǎn)生間接損傷。鑒于以上背景，推測MP肺炎患兒局部菌量可能與其病情嚴重程度存在一定的相關性。因此，本研究探討MP肺炎患兒肺泡灌洗液(BALF)中MP-DNA基因拷貝數(shù)與其臨床表現(xiàn)、實驗室檢查和胸部影像學檢查之間的關系，以期對MP肺炎臨床病情的監(jiān)測及診斷提供指導。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析河北省兒童醫(yī)院2012年10月至2013年12月收治的82例經(jīng)支氣管鏡檢查并進行肺泡灌洗的MP肺炎患兒臨床資料，其中男51例，女31例，年齡6月齡至13歲。≤5歲的患兒36例，其中，<1歲的嬰兒4例；≥5歲的患兒46例。把BALF中MP-DNA的拷貝數(shù)小于103/mL的15例患兒設為低菌量組，BALF中MP-DNA的拷貝數(shù)為103～106/mL的24例患兒設為中等菌量組，BALF中MP-DNA的拷貝數(shù)大于106/mL的43例患兒為高菌量組。

1.2 納入標準 (1)參照2013年修訂的《兒童社區(qū)獲得新肺炎管理指南》診斷為MP肺炎的患兒：雙份血清抗體滴度升高4倍及4倍以上，或血清特異性IgM抗體陽性；X線片顯示肺部有浸潤影[6]。(2)無其他病原感染：痰、血清標本和BALF細菌培養(yǎng)陰性，痰呼吸道病毒檢測為陰性，肺炎衣原體、沙眼衣原體、軍團菌抗體檢測為陰性。(3)所有患兒均有行纖維支氣管鏡檢查和支氣管肺泡灌洗指征。本研究經(jīng)本院倫理會同意，研究取得患兒家屬理解并簽署知情同意書。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 入院第1天采集靜脈血做血培養(yǎng)、血常規(guī)及MP抗體等。痰標本的采集使用無菌負壓吸引法，在入院2 h內(nèi)進行，使用一次性吸痰管緩慢遞入患兒鼻腔約5～10 cm，負壓吸取1～2 mL痰液，2 h內(nèi)送檢。行纖維支氣管鏡檢查及BALF收集，所有患兒術前均得到家長簽字同意，術前4～6 h禁食，術前30 min肌注速眠安 0.15～0.20 mg/kg。根據(jù)患兒年齡大小選擇不同外徑的支氣管鏡；注入2%利多卡因1～2 mL，對灌洗肺段行局部麻醉；經(jīng)鼻腔插入支氣管鏡，先常規(guī)探查各葉、段支氣管，然后將纖支鏡頂端緊密插入感染病變肺段、亞段處，再快速注入37 ℃滅菌生理鹽水25～50 mL，共3次負壓吸引回收灌洗液；并記錄總量；裝瓶后置于放有冰塊的保溫箱里，立即送檢。

1.3.2 MP-DNA定量檢測 采用熒光實時定量聚合酶鏈反應(FQ-PCR)法對BALF中MP-DNA定量檢測。將纖維支氣管鏡下收集的BALF置于1.5 mL離心管中，12 000 r/min 離心5 min，去上清，留取管底沉淀加入裂解液作為DNA提取標本，再進行PCR擴增，試劑盒由中山大學達安基因股份有限公司提供，PCR儀為美國BIO-RADicycler基因擴增儀。檢測嚴格按照試劑說明書要求的操作規(guī)程進行。

1.3.3 細菌培養(yǎng)與鑒定 痰液標本經(jīng)震蕩、離心、去上清，同樣以FQ-PCR方法檢測痰液中MP-DNA基因。將痰標本用生理鹽水稀釋成懸液后分別接種于血平板和含抗菌藥物的巧克力平板。BALF原液和用生理鹽水稀釋10倍和100倍的BALF溶液分別接種于血平板上進行定量培養(yǎng)。將接種好的血平板置于5%CO2培養(yǎng)箱中35 ℃孵育18～24 h。灌洗液培養(yǎng)細菌濃度大于或等于104cfu/mL可認為是致病菌。

1.3.4 病毒檢測 痰標本懸液300～500 r/min離心10 min，取沉淀做涂片。直接免疫熒光檢測7種常見呼吸道病毒：腺病毒，EB病毒，呼吸道合胞病毒，流感病毒，副流感病毒，偏肺病毒，柯薩奇病毒。直接免疫熒光法病毒檢測試劑由美國Chemicon 公司提供，嚴格按照說明書要求進行操作。

1.3.5 血清檢測 用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測血清中MP、肺炎衣原體、沙眼衣原體和軍團菌抗體IgM。

1.3.6 臨床資料記錄 記錄患兒性別、年齡、發(fā)熱情況、實驗室常規(guī)檢查、影像學檢查結果等。

2 結 果

2.1 MP菌量與發(fā)病年齡的關系 高菌量組患兒年齡(7.3±2.5)歲，中等菌量組(5.8±3.3)歲，低菌量組(2.5±1.4)歲，3組患兒年齡差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。

2.2 3組臨床癥狀比較 所有患兒均表現(xiàn)有咳嗽、發(fā)熱癥狀?？人砸源碳ば詥芸葹橹?，或咳少量黏液痰。發(fā)熱患兒中，高熱患兒61例(74.4%)，中度發(fā)熱19例(23.2%)，低熱2例(2.4%)。氣促/呼吸困難35例(42.7%)，出現(xiàn)畏寒、寒戰(zhàn)12例(14．6%)，出現(xiàn)呼吸衰竭3例(3.7%)。發(fā)熱患兒中熱程大于或等于7 d者53例(64.6%)。其中高菌量組體溫大于39 ℃的高熱患兒數(shù)量多于中低菌量組(P=0.027)；總熱程較中低菌量組長(P=0.029)；熱程大于或等于7 d的患兒數(shù)多于中低菌量組(P=0.025)；使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療后熱程明顯長于其他兩組(P=0.003)。見表1。

表1 3組患兒臨床癥狀比較[中位數(shù)(范圍)]

表2 3組患兒實驗室檢查結果比較

注：CRP為C反應蛋白，a用中位數(shù)(范圍)表示。

2.3 3組患兒實驗室檢查結果比較 3組患兒外周血白細胞計數(shù)、血紅蛋白均在正常范圍內(nèi)，但高菌量組淋巴細胞百分數(shù)及絕對值明顯低于中等菌量組和低菌量組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。高菌量組患兒CRP值明顯高于其他兩組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.005)。見表2。

2.4 3組患兒影像學檢查結果比較 82例患兒中51例(62.2%)為單側病變，其中高、中、低菌量組分別有27(62.8%)、14(58.3%)、10(66.7%)例，且34例病變位于右肺(66.7%)，主要表現(xiàn)為大片段或葉的實變影 (40.7%)；雙側肺受累的有31例(37.8%)，其中高、中、低菌量組分別有16(37.2%)、10(41.7%)、5(33.3%)例。影像學檢查提示大片肺實變/肺不張者，高菌量組有26例(60.5%)，中等菌量組6例(25.0%)，低菌量組2例(13.3%)，3組患兒的影像學比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.002)。雙側胸腔積液或大量胸腔積液者，高菌量組有11例(25.6%)，中等菌量組為3例(12.5%)，低菌量組患兒未見，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.033)。

3 討 論

MP作為一種常見的呼吸道病原體，目前發(fā)病機制尚未完全清楚。一般認為MP通過侵入吸附宿主呼吸道上皮細胞表面、破壞呼吸道黏膜，以及通過刺激機體產(chǎn)生免疫反應進行損害[7-8]。MP肺炎的發(fā)病率逐年上升，以往認為此病是一種自限性疾病，但近年來難治性、致死性MP肺炎的報道逐漸增多。一些患兒經(jīng)大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療后，仍高熱不退、臨床癥狀未見好轉，影像學檢查提示病情加重，合并肺外損害，病情惡化甚至危及生命。不同個體感染MP肺炎后病情嚴重度不同的原因未能明確。MP的毒素和代謝產(chǎn)物有致病性，可損害局部組織，同時又能引發(fā)炎性反應與免疫反應損害機體，所以MP肺炎患兒局部病菌量與其病情嚴重度可能存在一定的相關性[9-10]。局部MP菌量可反映病菌與宿主免疫清除能力之間的關系。本研究采用FQ-PCR檢測BALF中MP拷貝數(shù)作為局部菌量指標，對MP肺炎患兒局部菌量與臨床特征的相關性進行研究探討。

入組患兒均為難治性MP肺炎，且有支氣管鏡指征，病情相對較重，所有患兒均伴有發(fā)熱癥狀，其中高熱患兒61例(74.4%)，熱程大于或等于7 d者53例(64.6%)，氣促和呼吸困難者35例(42.7%)，出現(xiàn)畏寒、寒戰(zhàn)12例(14.6%)，呼吸衰竭3例(3.7%)。高菌量組高熱患兒數(shù)量、熱程大于或等于7 d患兒的數(shù)量明顯多于中等菌量及低菌量組(P=0.027、P=0.025)，總熱程、使用大環(huán)內(nèi)酯類后退熱時間明顯長于其他兩組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.029、P=0.003)。高菌量組患兒出現(xiàn)氣急、呼吸困難、畏寒、寒戰(zhàn)的比例相對較高。提示MP肺炎患兒局部MP菌量越多，臨床癥狀越嚴重。有相關研究證實，MP感染臨床嚴重度與口咽分泌物中的MP菌量有關[11]。本研究與既往研究結果一致。此外，高菌量組中學齡兒患者居多，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。但這也可能是因為本次研究中MP感染者以年長兒居多，且對象中學齡患兒占多數(shù)有關。

3組患兒外周血白細胞計數(shù)、血紅蛋白均處在正常范圍內(nèi)。高菌量組淋巴細胞百分數(shù)及其絕對值明顯低于中低菌量組，這可能與MP感染后免疫抑制有關。CRP作為高靈敏的炎癥指標[12]，在肺損害嚴重的患兒中升高明顯。低菌量組、中等菌量組和高菌量組患兒的CRP值呈明顯遞增，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.005)。本研究還對不同菌量組的影像學檢查進行了比較。影像學表現(xiàn)為大片肺實變/肺不張者提示肺損害嚴重，高菌量組有26例(60.5%)，中等菌量組6例(25.0%)，低菌量組2例(13.3%)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.002)。雙側胸腔積液或大量胸腔積液者，高菌量組有11例(25.6%)，中等菌量組為3例(12.5%)，低菌量組患兒未見，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.033)。說明高菌量組患兒肺部損傷較其他兩組更為嚴重，更易出現(xiàn)大片狀肺實變或肺不張及大量胸腔積液。

MP肺炎患兒BALF中MP菌量與臨床癥狀及實驗室檢查、影像學結果的相關性，可能是由于MP產(chǎn)生的免疫反應及炎性反應。局部高MP菌量可伴隨局部高水平抗原，而過多的MP作為抗原可能導致機體局部更為嚴重的免疫炎性反應[13-14]。

綜上所述，MP肺炎患兒下呼吸道MP菌量與患兒的病情嚴重度有關。高菌量組患兒年齡較大，熱程更長，高熱患兒更多，用藥后退熱時間更長；實驗室檢查CRP升高明顯、淋巴細胞降低明顯；影像學檢查顯示肺部損傷更為嚴重。因此建議MP肺炎患兒進行肺泡灌洗及局部MP定量檢測，有利于病情診斷及指導臨床治療。

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Relationship between bacteria loads of bronchoalveolar lavage fluid and clinical characteristics in children with mycoplasma pneumoniae pneumonia*

WANGYa-kun1，GAOWen-jie1△，WANGWei2，DUXi-xia3，DUAn4，WANGYan-yan1

(1.DepartmentofPediatricsInternalMedicine，Children′sHospitalofHebeiProvince,Shijiazhuang,Hebei050030,China;2.NursingDepartment,Children′sHospitalofHebei,Shijiazhuang,Hebei050030,China；3.NursingDepartment,ShijiazhuangMaternityHospital,Shijiazhuang,Hebei050000,China；4.PharmacyCollege,JosaiInternationalUniversity，Tokyo261-7114,Japan)

Objective To study the relationship between mycoplasma pneumoniae(MP)-DNA gene copy number of bacteria loads of bronchoalveolar lavage fluid(BALF) and clinical characteristics in children with MP pneumonia.Methods A total of 82 children with MP pneumonia were recruited as objects from October 2012 to December 2013,bronchoscopic bronchoalveolar lavage (BAL) was perfomed，and real-time polymerase chain reaction (FQ-PCR) was used to detected MP-DNA in BALF.According to the results of MP-DNA detection,objects were divided into low MP load group (MP-DNA was less than 103/mL)，moderate MP load group(MP-DNA was 103-106/mL) and high MP load group (MP-DNA was more than 106/mL).Clinical symptoms in three groups，laboratory test results and imaging results were compared.Results Children in the high MP load group had long course of disease,children with high fever and with fever process more than 7 d in the high MP load group were more than other two groups,and the fever relieving time after using drugs in the high MP load group were longer than other two groups,the differences were statistical significant(P=0.027,P=0.025,P=0.029,P=0.003).The C-reactive protein (CRP) level in the high MP load group was significant higher than the other two groups,the difference was statistical significant (P=0.005).Imaging examination showed that the big range of consolidation and pulmonary atelectasis in the high MP load group were more than that in the low MP loads group (P=0.002).There were no children with bilateral pleural effusion or pleural effusion in the low MP loads group,which was significant less than the other two groups (P=0.033).Conclusion There is a close relationship between MP load in BALF and clinical characteristics in children with MP pneumoniae,children with high MP load had a more severe process.

mycoplasma pneumoniae； bronchoalveolar lavage fluid； child

河北省2014年度醫(yī)學科學研究重點課題計劃(ZD20140097)。

王亞坤，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事小兒疾病研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.10.010

A

1672-9455(2015)10-1361-03

2014-10-18

2015-01-20)