高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定血清非結(jié)合雌三醇的前處理研究*

鄭松柏，張喬軒，王建兵，林海標(biāo)，曾瑞麗，韓麗喬，莊俊華，黃憲章(廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣州 510120)

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高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定血清非結(jié)合雌三醇的前處理研究*

鄭松柏，張喬軒，王建兵，林海標(biāo)，曾瑞麗，韓麗喬，莊俊華，黃憲章△(廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣州 510120)

目的 優(yōu)化高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)測定血清游離雌三醇(uE3)的前處理方法。方法以活性炭吸附血清為研究基質(zhì)，通過加入已知量的雌三醇(E3)標(biāo)準(zhǔn)品及E3-2-3-4-13C3內(nèi)標(biāo)，在LC-20AD XR高效液相色譜系統(tǒng)和API 5500串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀上對E3檢測的色譜條件、質(zhì)譜條件及萃取條件等進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果 色譜條件：選用菲羅門Knietex 色譜柱(100.0 mm×2.1 mm，2.6 μm)；有機(jī)相為甲醇，水相為0.1 mmol/L氟化銨水溶液，8 min梯度洗脫。質(zhì)譜條件：選用電噴霧(ESI)負(fù)離子模式和多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式分析，選擇質(zhì)荷比(m/z)287→m/z 145作為E3的定量離子對，m/z 287→m/z 171作為定性監(jiān)測離子對；選擇m/z 290→m/z 148作為內(nèi)標(biāo)的定量離子對，m/z 290→m/z 174作為定性監(jiān)測的離子對。萃取條件：萃取劑為正己烷/乙酸乙酯(50/50，v/v)，樣品與萃取劑的比例為1∶2，萃取率可達(dá)85.71%。結(jié)論 E3檢測的色譜條件、質(zhì)譜條件、萃取條件已得到全面優(yōu)化，為后續(xù)建立LC-MS/MS測定人血中uE3的參考方法打下良好基礎(chǔ)。

雌三醇； 高效液相色譜； 串聯(lián)質(zhì)譜

游離雌三醇(uE3)的測定在孕婦孕期胎盤功能監(jiān)測、唐氏綜合征的篩查等方面發(fā)揮重要作用[1-2]。孕婦血清uE3濃度也可預(yù)示胎兒早產(chǎn)及先兆子癇的可能性[3]，也常用于非孕婦女腫瘤流行病學(xué)篩查、乳腺癌及宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)評估等[4]。測定uE3的方法主要有放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、時(shí)間分辨熒光分析(TRFIA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)等[4-7]，目前臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測技術(shù)是CLIA法。然而以抗原-抗體免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的方法，不可避免地帶來了非特異性反應(yīng)的問題而使得測定結(jié)果有明顯系統(tǒng)誤差，同時(shí)各實(shí)驗(yàn)室使用不同生產(chǎn)廠家的試劑導(dǎo)致結(jié)果可比性差[8]。免疫學(xué)方法在臨床檢測激素方面的不足勢必要求建立新的檢測方法，其中同位素稀釋-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ID-LC-MS/MS)技術(shù)在內(nèi)分泌疾病檢測中快速發(fā)展和應(yīng)用使這項(xiàng)技術(shù)在激素類物質(zhì)檢測中具有越來越突出的地位，與免疫學(xué)方法的特異性相比具有非常明顯的優(yōu)勢[9-10]。因此，將ID-LC-MS/MS技術(shù)應(yīng)用于血清uE3的檢測，并建立參考方法具有重要的研究意義。本研究對uE3的色譜條件、質(zhì)譜條件、萃取條件進(jìn)行全面摸索和系統(tǒng)的優(yōu)化，以期為建立uE3的ID-LC-MS/MS參考方法打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器 LC-MS/MS系統(tǒng)由LC-20AD XR高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)和API 5500串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)組成，分析軟件為美國AB SCIEX公司的Analyst1.5.2；色譜柱：菲羅門Knietex色譜柱(2.6 μm,100.0 mm×2.1 mm)，賽默飛世爾Hypersil gold色譜柱(5 μm，50.0 mm×2.1 mm)，日本島津Shim-park XR-ODS Ⅱ色譜柱(2.2 μm,75.0 mm×2.0 mm)；離心機(jī)(美國Thermo Scientific公司)；氮吹儀(中國天津Agela Technologies公司)；Eppendorf Research型加樣槍；賽多利斯CP225D十萬分之一分析天平；Millipore Simplicity UA型超純水機(jī)。

1.1.2 試劑 雌三醇(E3)標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于99.3%)、E3-2-3-4-13C3、氟化銨等均購自美國Sigma公司。LC-MS級甲醇、乙腈，高效液相色譜級正己烷購自德國Merck公司，LC-MS級乙酸乙酯購自J.T.Baker公司，實(shí)驗(yàn)用水為本實(shí)驗(yàn)室自制高純水?；钚蕴课窖鍨檠芯炕|(zhì)，檢測前血清樣品在-20 ℃條件下保存。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化 對離子源、離子模式、離子對、氣源參數(shù)、電壓參數(shù)等進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化。

1.2.2 色譜條件優(yōu)化 比較3種色譜柱的分離效果及信號響應(yīng)，比較乙腈、甲醇、乙腈/甲醇混合液(50∶50，v/v)分別作為有機(jī)相時(shí)對信號響應(yīng)的影響。以E3-2-3-4-13C3作為內(nèi)標(biāo)，分別配置濃度為2 ng/mL的E3標(biāo)準(zhǔn)溶液和濃度為1 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，進(jìn)樣量為20 μL，保持其他色譜、質(zhì)譜條件一致，對水相緩沖鹽進(jìn)行了篩查，分別比較了純水與甲酸銨(0.1 mmol/L)、乙酸銨(0.1 mmol/L)和氟化銨(0.1 mmol/L)。確定了緩沖鹽的種類后，對含有不同濃度緩沖鹽的水相進(jìn)行了響應(yīng)信號的比較，優(yōu)化色譜條件。

1.2.3 萃取條件優(yōu)化 選擇二氯甲烷、乙醚、正己烷/乙酸乙酯混合液等多種萃取劑進(jìn)行萃取條件的優(yōu)化。操作方法：在15 mL離心管中加入1 mL含有E3和內(nèi)標(biāo)樣本和2 mL萃取液，漩渦混勻10 min后離心機(jī)高速離心10 min (13 000 r/min)，取上層(二氯甲烷取下層)于另一15 mL離心管中，再次加入2 mL萃取液重復(fù)萃取，兩次萃取后的混合液在50 ℃條件下氮?dú)獯蹈?，加? mL甲醇水復(fù)溶，漩渦混勻5 min后高速離心5 min(13 000 r/min)取上清液(應(yīng)吹干后用統(tǒng)一體積的流動(dòng)相溶液溶解后進(jìn)樣，如果直接用萃取液進(jìn)樣，可能產(chǎn)生較大的溶劑峰)進(jìn)樣測定。確定了萃取劑的種類之后，對萃取劑的量和萃取次數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。準(zhǔn)備兩組樣品，A組萃取前在血清中加入已知量的E3(2 ng/mL)和等量內(nèi)標(biāo)，B組在萃取前加2 ng/mL E3，在萃取之后加內(nèi)標(biāo)。樣品的絕對回收率就是使用該萃取劑的萃取率，絕對回收率由兩組樣品中E3與內(nèi)標(biāo)的濃度比值來計(jì)算。考察了樣品與萃取劑體積比分別1∶1、1∶2、1∶3、1∶4時(shí)的萃取率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理均在Microsoft Office Excel 2007上進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化 在正離子模式下無信號響應(yīng)。電噴霧電離源(ESI)負(fù)離子模式的響應(yīng)優(yōu)于大氣壓化學(xué)電離源(APCI)負(fù)離子模式。噴霧氣(Gas1)、霧化輔助加熱氣(Gas2)、氣簾氣(CUR)和碰撞氣(CAD)均為氮?dú)?，進(jìn)氣壓力分別為65 psi、65 psi、30 psi和7 psi，Gas2的加熱溫度為650 ℃，噴霧電壓(IS)為-4 500 V。優(yōu)化后，對應(yīng)離子對的去簇電壓(DP)、碰撞電壓(CE)、出口電壓(CXP)，見表1。選擇質(zhì)荷比(m/z)287→m/z 145作為E3的定量離子對，m/z 287→m/z 171作為定性監(jiān)測的離子對；選擇m/z 290→m/z 148作為內(nèi)標(biāo)的定量離子對，m/z 290→m/z 174作為定性監(jiān)測的離子對。

表1 質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)

2.2 液相條件優(yōu)化 菲羅門Knietex 色譜柱(2.6 μm,100.0 mm×2.1 mm)在分析E3時(shí)柱效和響應(yīng)均最好。甲醇作為有機(jī)相，峰形好，響應(yīng)最髙。水相加入甲酸銨出現(xiàn)離子抑制，響應(yīng)降低，適當(dāng)濃度氟化銨可提高其離子化效率。不同氟化銨濃度下，出峰的響應(yīng)值和信噪比(S/N)結(jié)果見表2。當(dāng)氟化銨的濃度為0.10 mmol/L時(shí)，其響應(yīng)值和S/N均最大。優(yōu)化后的色譜條件為：以甲醇作為有機(jī)相，0.10 mmol/L氟化銨水溶液作為水相，洗脫梯度設(shè)置：0 min，30%有機(jī)相；1 min，30%有機(jī)相；3.5 min，95%有機(jī)相；5 min，95%有機(jī)相；5.1 min，30%有機(jī)相；8 min，30%有機(jī)相，流動(dòng)相流速300 μL/min，進(jìn)樣量20 μL。在優(yōu)化后的質(zhì)譜條件和色譜條件下，以20 μL 2 ng/mL E3標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，其保留時(shí)間為4.28 min，柱效及E3與雜質(zhì)峰的分離度均良好。

表2 不同濃度氟化銨對E3檢測的響應(yīng)值和S/N

2.3 萃取條件的優(yōu)化 二氯甲烷萃取率不到10%，不宜采用。乙醚萃取能力強(qiáng)，但是毒性很強(qiáng)，對工作人員的毒害大，盡量考慮使用其他替代的萃取劑。正己烷及乙酸乙酯毒性比乙醚小，在50 ℃左右都能氣化。選擇樣品與萃取劑的體積比為1∶2，采用一次萃取的方法，在優(yōu)化好的色譜、質(zhì)譜條件下對不同比例的正己烷/乙酸乙酯的萃取率進(jìn)行了比較，最后選擇正己烷/乙酸乙酯(50/50，v/v)作為萃取劑。確定了萃取劑的種類之后，對萃取劑的量和萃取次數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。準(zhǔn)備A、B兩組樣品，考察了樣品與萃取劑體積比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4時(shí)，2次萃取后的萃取率分別為40.97%、85.71%、87.63%、88.96%，綜合考慮萃取效率、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等因素，最后選擇加入萃取劑體積為樣品體積的2倍。

3 討 論

已有文獻(xiàn)報(bào)道，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法測定血清uE3等甾體激素，這些方法都有很好的特異性，但是往往反應(yīng)通量很低，需要較大體積的血清樣本。目前，也有利用同位素稀釋液質(zhì)聯(lián)用法(ID-LC-MS/MS)檢測血清中的uE3，但是實(shí)驗(yàn)中采用了衍生的步驟，而衍生實(shí)驗(yàn)對于實(shí)驗(yàn)人員的專業(yè)要求較高，不利于各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的普及。本研究采用液液萃取后直接進(jìn)行LC-MS/MS測定的方法，以E3-2-3-4-13C3作為內(nèi)標(biāo)加入血清樣本中，混合均勻后進(jìn)行液液萃取，用C18反相色譜柱分離，分析時(shí)間為8 min，定量用ESI負(fù)離子模式選擇離子監(jiān)控模式，E3的離子對為m/z 287→m/z 145(定量)，m/z 287→m/z 171(定性)。對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)離子對為m/z 290→m/z 148(定量)，m/z 290→m/z 174(定性)。

LC-MS/MS與高效液相色譜分析(HPLC)在流動(dòng)相緩沖液的選擇和有機(jī)相的選擇方面有顯著差異。因?yàn)長C-MS/MS在選擇流動(dòng)相緩沖鹽時(shí)要考慮緩沖鹽的揮發(fā)性及其對分析物形成帶電離子的影響。因此，對LC-MS/MS流動(dòng)相緩沖鹽的種類進(jìn)行優(yōu)化，對色譜峰的峰形具有重要意義。緩沖鹽的濃度對提高離子響應(yīng)，增加檢測靈敏度也有很大影響。梯度和進(jìn)樣量的優(yōu)化，可以選擇適合的保留時(shí)間，使得色譜分離結(jié)果滿足定量檢測的要求。

從前期利用ID-LC-MS/MS技術(shù)建立E3常規(guī)檢測方法的經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn)報(bào)道分析[2]，前處理中可能出現(xiàn)萃取效率較低的問題，該文獻(xiàn)采用乙醚進(jìn)行萃取，其萃取率僅為45%。雖然使用了內(nèi)標(biāo)，萃取率對方法的準(zhǔn)確性幾乎沒有影響[11-13]。但萃取率太低會(huì)直接影響儀器的檢測限和定量限。本研究選用二氯甲烷、乙醚、正己烷/乙酸乙酯混合液等多種萃取劑進(jìn)行萃取條件的優(yōu)化。正己烷對E3的一次萃取效率在3%以下。純乙酸乙酯萃取效率較高，但乙酸乙酯萃取時(shí)易發(fā)生乳化現(xiàn)象，會(huì)影響萃取重復(fù)性及延長吹干時(shí)間，故應(yīng)減少乙酸乙酯用量。因此，本研究最終選擇正己烷/乙酸乙酯混合液作為萃取劑?？紤]到不同的組成比例對萃取率的影響，本研究考察了不同比例的正己烷/乙酸乙酯的萃取率，當(dāng)乙酸乙酯的體積濃度大于或等于50%時(shí)，該混合萃取劑具有良好的萃取率。因此，本研究選擇正己烷/乙酸乙酯(50/50，v/v)作為萃取劑。不同萃取劑量對血清uE3的萃取率也有顯著影響。綜合考慮到實(shí)驗(yàn)的效率，減少氮?dú)獯蹈傻臅r(shí)間和節(jié)約萃取劑，綜合考慮萃取效率、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等因素，本研究選擇樣品與萃取劑的體積比為1∶2，2次萃取進(jìn)行后續(xù)研究。

綜上所述，本研究對ID-LC-MS/MS測定血清uE3的方法進(jìn)行了系統(tǒng)研究，在此基礎(chǔ)上，對質(zhì)譜、色譜條件和前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化，減少了衍生化步驟，得到了較好的結(jié)果。在后續(xù)的研究中，將以優(yōu)化的LC-MS/MS方法為參考進(jìn)行樣品的前處理，進(jìn)而建立人血中uE3檢測的參考方法。

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Investigate the pretreat conditions of the determination of unconjugated estriol in human serum using high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry*

ZHENGSong-bai,ZHANGQiao-xuan,WANGJian-bing,LINHai-biao,ZENGRui-li,HANLi-qiao,ZHUANGJun-hua,HUANGXian-zhang△

(DepartmentofClinicalLaboratory,theSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou,Guangdong510120,China)

Objective To optimize the pretreat conditions of the determination of unconjugated estriol(uE3) in human serum using isotope dilution liquid chromatography/tandem mass spectrometry (ID-LC-MS/MS).Methods Estriol (purity>99.3%) and estriol-2-3-4-13C3were the standard and the internal standard respectively.Activated carbon adsorption serum was used for the study of serum matrix.The liquid chromatography(LC)and mass spectrometry(MS) condition were optimized to increase the sensitivity of the detection by use of the the AB/Sciex API 5500 tandem mass spectrometer equipped with Shimadzu LC-20AD XR system.Results LC condition:Knietex 100×2.1 mm,2.6 μm as the column,the mobile phase was fluoride (NH4F) in water (buffer A) and methanol (buffer B).The analysis of uE3was accomplished within 8 min.MS condition:the samples were analyzed by ID-LC-MS/MS system in the negativelyelectro-spray ioniz ation (ESI) mode and multiple reaction monitor(MRM)mode.And the MRM transitions used for each analytes were:(m/z) 287→145 (quantitative) and m/z 287→171 (qualitative) for uE3,m/z 290→148 (quantitative) and m/z 290→174 (qualitative) for internal standard.Extraction:n-Hexane/ethyl acetate (50∶50,v/v) was chosen to the extraction solvent,and the volume ratio of the serum sample to extraction solvent was 1∶2.The mean extraction efficiency for the method was determined to be 85.71%.Conclusion This study successfully optimized the LC and MS conditions and the ideal condition was obtained of the determination of uE3in human serum using ID-LC-MS/MS.The applicable extract method was determined.This study was an important base of establish the candidate reference measurement procedure for the determination of uE3in human serum using ID-LC-MS/MS.

estriol； high performance liquid chromatography； tandem mass spectrometry

科技部重大新藥創(chuàng)制子項(xiàng)目(2012ZX09303009-003)。

鄭松柏，男，副主任檢驗(yàn)師，博士，主要從事實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理研究。

△通訊作者，E-mail：huangxz020@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.10.004

A

1672-9455(2015)10-1347-03

2014-12-05

2015-01-25)