EB病毒抗體及其DNA聯(lián)合檢測(cè)在鼻咽癌篩查和早期診斷中的價(jià)值*

邱厚匡，姚亞超，李 磊，李亞紅，張 珍，李 楠，嚴(yán) 芳，李澤泳，吳春燕，吳曉昀，張 智△(.廣東省第二人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣州 5037；.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心/廣東省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 5050)

?

·論 著·

EB病毒抗體及其DNA聯(lián)合檢測(cè)在鼻咽癌篩查和早期診斷中的價(jià)值*

邱厚匡1，姚亞超1，李 磊2，李亞紅1，張 珍1，李 楠1，嚴(yán) 芳1，李澤泳1，吳春燕1，吳曉昀1，張 智1△(1.廣東省第二人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣州 510317；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心/廣東省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510150)

目的 探討EB病毒(EBV)抗體及EBV DNA聯(lián)合檢測(cè)在鼻咽癌篩查和早期診斷中的價(jià)值。方法 收集2011年7月至2014年8月廣東省第二人民醫(yī)院經(jīng)病理確診的鼻咽癌患者272例，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定血清RTA-IgG、VCA-IgA和EA-IgA；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測(cè)定血漿EBV-DNA。結(jié)果 四項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，其敏感度最高(99.63%)；早期鼻咽癌的陽性率為97.62% (41/42)，晚期鼻咽癌的陽性率為100.00% (230/230)。四項(xiàng)指標(biāo)中任意兩項(xiàng)及兩項(xiàng)以上指標(biāo)為陽性的特異性在93.00%以上。結(jié)論 四項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)可用于早期鼻咽癌的篩查，任意兩項(xiàng)以上指標(biāo)陽性時(shí)應(yīng)高度懷疑鼻咽癌。

鼻咽癌； EB病毒抗體； EBV DNA； 早期診斷

鼻咽癌(NPC)是侵襲性和轉(zhuǎn)移率最高的頭頸部惡性腫瘤，在中國(guó)華南和東南亞地區(qū)高發(fā)[1]，很多患者確診時(shí)已為晚期，預(yù)后較差[2]。早期鼻咽癌預(yù)后較好，但其位置隱蔽，早期癥狀不明顯，因此對(duì)鼻咽癌高發(fā)地區(qū)人群進(jìn)行篩查和早期診斷是治療鼻咽癌的關(guān)鍵[3]。大量研究表明EB病毒(EBV)與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]，EBV相關(guān)抗體和EBV DNA是目前診斷鼻咽癌的重要方法[5-6]。目前尚無聯(lián)合檢測(cè)RTA-IgG、VCA-IgA、EA-IgA、EBV DNA對(duì)鼻咽癌早期診斷價(jià)值的報(bào)道。本研究旨在探討聯(lián)合檢測(cè)這四項(xiàng)指標(biāo)在鼻咽癌篩查和早期診斷中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年7月至2014年8月廣東省第二人民醫(yī)院經(jīng)病理確診的鼻咽癌患者272例，其中男195例，女77例；年齡21～80歲，中位年齡48歲。所有患者均按鼻咽癌臨床TNM分期法進(jìn)行分期，Ⅰ、Ⅱ期為早期，Ⅲ、Ⅳ期為晚期，病理類型以非角化型癌為主，占93.38%(254/272)。

1.2 抗體檢測(cè)方法 抽取鼻咽癌患者治療前靜脈血5 mL。RTA-IgG抗體檢測(cè)采用北京同昕生物技術(shù)有限公司的酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)試劑盒，VCA-IgA和EA-IgA抗體檢測(cè)采用德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份公司的ELISA試劑盒。嚴(yán)格按照上述試劑盒的說明書進(jìn)行操作，RTA-IgG以S/CO≥1.0為陽性，VCA-IgA和EA-IgA均以S/CO≥1.1為陽性。

1.3 EBV DNA檢測(cè)方法 分離乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血血漿，DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法測(cè)定EBV DNA，計(jì)算病毒拷貝數(shù)，檢測(cè)試劑購(gòu)自湖南圣湘生物科技有限公司。EBV DNA>50 copy/mL記為陽性，低于檢測(cè)下限記為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EBV四項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)對(duì)鼻咽癌的診斷價(jià)值 單獨(dú)應(yīng)用一項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)鼻咽癌患者時(shí)，以VCA-IgA敏感度最高(96.32%)，EA-IgA特異性最高(94.68%)。見表1。四項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，至少一項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果為陽性者的敏感度最高(99.63%)，僅有1例鼻咽癌患者漏診。兩項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，RTA-IgG和VCA-IgA均為陽性的約登指數(shù)最高(83.13%)，RTA-IgG和EA-IgA均為陽性的特異性最高(100.00%)。任意三項(xiàng)或四項(xiàng)檢測(cè)均為陽性的特異性也可達(dá)到100.00%。四項(xiàng)指標(biāo)中任意兩項(xiàng)及兩項(xiàng)以上指標(biāo)為陽性的特異性均在97.00%以上。見表2。

2.2 不同臨床分期鼻咽癌患者EBV檢測(cè)指標(biāo)陽性率比較 各期病例中RTA-IgG、VCA-IgA和EA-IgA陽性率之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；EBV DNA陽性率在各鼻咽癌分期之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。單項(xiàng)檢測(cè)時(shí)，早期鼻咽癌患者中RTA-IgG和VCA-IgA的陽性率分別為85.71% (36/42)和88.10%(37/42)；晚期鼻咽癌患者中VCA-IgA的陽性率最高，可達(dá)到97.83%(225/230)。聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，早期和晚期鼻咽癌中至少一項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果為陽性的概率分別為97.62%(41/42)和100.00%(230/230)。見表3。

表1 EBV四項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)對(duì)鼻咽癌的診斷價(jià)值[%(n/n)]

表2 不同指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)對(duì)鼻咽癌的診斷價(jià)值

表3 不同臨床分期鼻咽癌患者EBV檢測(cè)指標(biāo)陽性率比較[%(n/n)]

3 討 論

大量研究表明EBV感染與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，EBV相關(guān)抗體如RTA-IgG，VCA-IgA和EA-IgA等可作為鼻咽癌輔助診斷的血清學(xué)指標(biāo)[7-8]。此外，鼻咽癌患者血漿中存在高拷貝數(shù)的EBV DNA，且其水平變化與腫瘤發(fā)生、療效、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等多個(gè)環(huán)節(jié)相關(guān)[9]。血清學(xué)指標(biāo)改變和EBV DNA拷貝數(shù)的改變?cè)诒茄拾┌l(fā)生發(fā)展中是普遍和早期的事件，因此探討早期鼻咽癌血清學(xué)和EBV DNA改變情況，將有助于實(shí)現(xiàn)鼻咽癌的早期診斷，從而提高鼻咽癌治愈率。

本研究結(jié)果顯示，單項(xiàng)檢測(cè)RTA-IgG、VCA-IgA、EA-IgA和EBV DNA時(shí)，其敏感度分別為87.50%、96.32%、57.35%和72.43%；RTA-IgG，VCA-IgA和EBV DNA的敏感度與以往報(bào)道一致，EA-IgA的敏感度與以往報(bào)道不一致[10-11]，分析原因可能是所用檢測(cè)方法、檢測(cè)試劑盒、陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)的差異和納入人群的地域分布不一致等。本研究采用德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份公司的ELISA試劑盒，而其他研究多采用中山生物工程公司的免疫酶法檢測(cè)試劑盒[11-14]。此外，單項(xiàng)檢測(cè)時(shí)以VCA-IgA的敏感度最高，EA-IgA的特異性最高，與羅耀凌等[14]報(bào)道的結(jié)果一致。

臨床分期是影響鼻咽癌預(yù)后的主要因素。RTA-IgG、VCA-IgA、EA-IgA在鼻咽癌的各個(gè)臨床分期之間陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與以往報(bào)道一致[11]。提示這三項(xiàng)指標(biāo)不適用于判定鼻咽癌臨床分期。本研究中EBV DNA陽性率隨著臨床分期升高而增加，與以往報(bào)道一致[13]。在鼻咽癌早期，RTA-IgG或VCA-IgA單項(xiàng)指標(biāo)診斷鼻咽癌的陽性率相差不大，分別為85.71%和88.10%，但是尚不足以成為理想的鼻咽癌早期篩查的腫瘤血清學(xué)指標(biāo)。

RTA蛋白是EBV由潛伏期轉(zhuǎn)向裂解期的關(guān)鍵調(diào)控因子，它能引起一系列裂解早期基因的相繼表達(dá)，最終引發(fā)EBV裂解干擾[15-16]。VCA是在鼻咽癌增殖后期形成的結(jié)構(gòu)蛋白，是在感染EBV后最晚表達(dá)的一種抗原，可在體內(nèi)終生存在，有助于早期診斷鼻咽癌[7-8]。EA-IgA雖然也是鼻咽癌增殖后期形成的結(jié)構(gòu)蛋白，但是其刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的情況存在個(gè)體差異，所以其敏感度不高，但是卻有較高的特異性[7-8]。EBV DNA是反映腫瘤消長(zhǎng)情況靈敏可靠的指標(biāo)，可用于鼻咽癌的診斷、療效評(píng)價(jià)和預(yù)后評(píng)價(jià)[9]。

近年來，國(guó)內(nèi)外有很多聯(lián)合檢測(cè)用于鼻咽癌篩查和診斷的報(bào)道，張玉等[17]認(rèn)為VCA-IgA和EA-IgA聯(lián)合檢測(cè)，在鼻咽癌血清學(xué)診斷中具有互補(bǔ)作用，但敏感度僅有84.85%；汪欣等[18]認(rèn)為，VCA-IgA、ZTA-IgA、NA1-IgA或者RTA-IgG、VCA-IgA、ZTA-IgA三項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)可使鼻咽癌檢出率達(dá)到100.00%。但該研究中鼻咽癌患者例數(shù)僅有20例，不能準(zhǔn)確反映這些指標(biāo)診斷鼻咽癌的真實(shí)情況。本研究中采用四項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)，既包括EBV相關(guān)抗原的免疫應(yīng)答情況，又含有鼻咽癌時(shí)EBV自身增殖情況，檢測(cè)結(jié)果可以互補(bǔ)。研究結(jié)果顯示，僅有1例早期鼻咽癌漏診，早期鼻咽癌的陽性率可提高至97.62%(41/42)，晚期鼻咽癌的陽性率可達(dá)到100.00%，雖然其約登指數(shù)不高(58.14%)，但是可以提高臨床篩查的敏感度。

已知EA-IgA診斷鼻咽癌的特異性較高，此指標(biāo)陽性者鼻咽癌風(fēng)險(xiǎn)非常大，與其他指標(biāo)同時(shí)陽性者的風(fēng)險(xiǎn)更大。本研究?jī)身?xiàng)指標(biāo)檢測(cè)中RTA-IgG和EA-IgA均為陽性，任意三項(xiàng)或四項(xiàng)檢測(cè)均為陽性的特異性均可達(dá)到100.00%，出現(xiàn)上述檢測(cè)結(jié)果時(shí)應(yīng)該高度懷疑鼻咽癌。郭麗萍等[19]報(bào)道EBV RTA-IgG和VCA-IgA兩種抗體均為陽性者，可列為鼻咽癌高危人群。程偉民等[20]報(bào)道，EBNA1-IgA、EBNA1-IgG和ZTA-IgG均為陽性的特異性可達(dá)到93.00%。本研究中比較了四項(xiàng)指標(biāo)中兩項(xiàng)及以上指標(biāo)的陽性率，與姜世強(qiáng)等[21]報(bào)道一致。DNA和VCA-IgA，以及EA-IgA和EBV DNA均為陽性時(shí)有較高的鼻咽癌診斷價(jià)值。本研究中任意兩項(xiàng)以上指標(biāo)為陽性時(shí)診斷鼻咽癌的特異性均在97.00%以上，可較以往報(bào)道獲得更高的特異性，可提高臨床診斷的準(zhǔn)確度。若臨床患者出現(xiàn)任意兩項(xiàng)以上指標(biāo)為陽性時(shí)，提示其鼻咽癌風(fēng)險(xiǎn)非常高，應(yīng)高度懷疑鼻咽癌。

綜上所述，本研究所采用的四項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)有互補(bǔ)作用，可用于鼻咽癌高發(fā)地區(qū)人群的篩查和早期診斷，其中一項(xiàng)陽性者應(yīng)該定期復(fù)查體檢，以便提高早期無癥狀鼻咽癌檢出率；任意兩項(xiàng)以上指標(biāo)為陽性時(shí)，應(yīng)高度懷疑鼻咽癌，實(shí)現(xiàn)早期無癥狀鼻咽癌的準(zhǔn)確診斷。

[1]Yu MC，Yuan JM.Epidemiology of nasopharyngeal carcinoma[J].Semin Cancer Biol，2002，12(6):421-429.

[2]Guigay J.Advances in nasopharyngeal carcinoma[J].Curr Opin Oncol，2008，20(3):264-269.

[3]Faivre S，Janot F，Armand JP.Optimal management of nasopharyngeal carcinoma[J].Curr Opin Oncol，2004，16(3):231-235.

[4]Pearson GR.Epstein-Barr virus and nasopharyngeal carcinoma[J].J Cell Biochem，1993，17(1):150-154.

[5]黃小顏，許琳，溫本，等．動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)EB病毒抗體對(duì)鼻咽癌的診治價(jià)值[J]．中華實(shí)用診斷與治療雜志，2014，28(5)：498-499．

[6]Han BL，Xu XY，Zhang CZ，et al.Systematic review on Epstein-Barr virus(EBV) DNA in diagnosis of nasopharyngeal carcinoma in Asian populations[J].Asian Pac J Cancer Prev，2012，13(6):2577-2581.

[7]Cai YL，Li J，Lu AY，et al.Diagnostic significance of combined detection of Epstein-Barr virus antibodies，VCA/IgA，EA/IgA，Rta/IgG and EBNA1/IgA for nasopharyngeal carcinoma[J].Asian Pac J Cancer Prev，2014，15(5):2001-2006.

[8]陳靜平，龍軍，張宏征．EB病毒殼抗原抗體定性檢測(cè)在鼻咽癌篩查中的作用[J]．南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011,21(9)：1637-1638．

[9]Ji MF，Huang QH，Yu Xia，et al.Evaluation of plasma Epstein-Barr virus DNA load to distinguish nasopharyngeal carcinoma patients from healthy high-risk populations in Southern China[J].Cancer，2014，120(9):1353-1360.

[10]朱文良，梁新強(qiáng)，章陽，等．EB病毒Rta蛋白抗體IgG在鼻咽癌診斷中的應(yīng)用[J]．中國(guó)癌癥防治雜志，2009，1(3)：211-213．

[11]蔡永林，鄭裕明，成積儒，等．EB病毒Rta/IgG、EBNAl/IgA、VCA/IgA及EA/IgA抗體與鼻咽癌分期的關(guān)系[J]．南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30(3)：509-511．

[12]李筱莉，陳燕，葉倩，等．EB病毒抗體聯(lián)合檢測(cè)在鼻咽癌血清學(xué)診斷和篩查中的應(yīng)用評(píng)價(jià)[J]．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，8(2)：140-141．

[13]蔡永林，鄭裕明，王偉，等．EB病毒抗體聯(lián)合檢測(cè)在鼻咽癌血清學(xué)診斷中的價(jià)值[J]．南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30(12)：2746-2748．

[14]羅耀凌，歐國(guó)萍，池沛冬，等．聯(lián)合檢測(cè)EB病毒相關(guān)抗體和抗原對(duì)診斷鼻咽癌的價(jià)值[J]．癌癥，2009，28(1)：96-99．

[15]Fahraeus R，Jansson A，Ricksten A，et al.Epstein-barr virus-encoded nuclear antigen-2 activates the viral latent membrane-protein promoter by modulating the activity of a negative regulatory element[J].Proc Natl Acad Sci USA.1990，87(19):7390-7394.

[16]Hu LF，Chen F，Zheng X，et al.Clonability and tumorigenicity of human epithelial-cells expressing the EBV encoded membrane-protein LMP1[J].Oncogene，1993，8(6):1575-1583.

[17]張玉，張昌卿，宗永生，等．酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)血清EB病毒VCA-IgA和EA-IgG診斷鼻咽癌[J]．廣東醫(yī)學(xué)，2003，24(4)：371-373．

[18]汪欣，趙素萍，吳旋，等．4種標(biāo)記蛋白抗體測(cè)定在鼻咽癌體檢篩查及診斷中的應(yīng)用[J]．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，8(21)：2563-2564．

[19]郭麗萍，崔英，梁新強(qiáng)，等．EB病毒抗體聯(lián)合檢測(cè)在篩查鼻咽癌高危人群中的應(yīng)用價(jià)值[J]．中國(guó)醫(yī)藥指南，2012，10(10)：26-27．

[20]程偉民，陳國(guó)雄，陳鴻霖，等．以血清EB病毒抗體譜評(píng)估患鼻咽癌危險(xiǎn)度的研究[J]．中華腫瘤雜志，2002，24(6)：561-563．

[21]姜世強(qiáng)，柳青．EBVDNA和EBV抗體指標(biāo)早期診斷鼻咽癌方案的篩選[J]．中國(guó)腫瘤臨床，2009，36(22)：1271-1273．

Combined determination of Epstein-Barr virus-related antibodies and EBV DNA for nasopharyngeal carcinoma early diagnosis*

QIUHou-kuang1，YAOYa-chao1，LILei2，LIYa-hong1，ZHAGNZhen1，LINan1，YANFang1，LIZe-yong1，WUChun-yan1，WUXiao-yun1，ZHANGZhi1△

(1.BiologicalExperimentCenter，theSecondPeople′sHospitalofGuangdongProvince，Guangzhou，Guangdong510317，China；2.DepartmentofReproductiveMedicineCenter/KeyLaboratoryforReproductiveMedicineofGuangdongProvince，ThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou，Guangdong510150，China)

Objective To evaluate the values of combined detection of Epstein-Barr virus-related antibodies and EBV DNA for diagnosing of early stage nasopharyngeal carcinoma(NPC).Methods A total of 272 NPC patients were recruited in this study from July 2011 to August 2014 in the Second People′s Hospital of Guangdong Province.Euzymelinked immunosorbent assay was performed to detect RTA-IgG，VCA-IgA and EA-IgA antibody,and real-time fluorescent quantitative PCR for measuring EBV DNA in plasma.Results The sensitivity of the combined detection for diagnosing NPC was 99.63%.Combined detection could improve the positive rate of diagnosis for early and late stage NPC to 97.62% (41/42) and 100.00%(230/230) respectively.The positive rate of any two or more indicators for NPC was above 93.00%.Conclusion Combined determination could be helpful to screen the early stage NPC，when people has any two or more positive indicators should be suspected to have NPC.

nasopharyngeal carcinoma; Epstein-Barr virus antibody; EBV DNA; early diagnosis

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81400639)；廣州醫(yī)科大學(xué)博士啟動(dòng)基金(2014C39)。

邱厚匡，男，本科，技師，主要從事分子生物學(xué)研究。

△通訊作者,E-mail：yalw135@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.10.001

A

1672-9455(2015)10-1339-03

2014-11-05

2015-01-15)