艱難梭菌感染實驗室檢測技術(shù)及其研究進(jìn)展

龍海燕,楊菁玉 綜述，馮 萍 審校(四川大學(xué)華西醫(yī)院感染性疾病中心，成都 610041)

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艱難梭菌感染實驗室檢測技術(shù)及其研究進(jìn)展

龍海燕,楊菁玉 綜述，馮 萍△審校(四川大學(xué)華西醫(yī)院感染性疾病中心，成都 610041)

艱難梭菌； 細(xì)菌培養(yǎng)； 毒素檢測； 免疫學(xué)； 分子生物學(xué)

艱難梭菌(CD)是一種專性厭氧的革蘭染色陽性芽孢桿菌，它廣泛分布于自然環(huán)境、動物和人的糞便中，芽孢抵抗力較強(qiáng)，可在外界環(huán)境存活數(shù)周至數(shù)月。CD本身沒有侵襲性，部分產(chǎn)毒細(xì)菌通過分泌毒素A、毒素B及二元毒素引起抗菌藥物相關(guān)性腹瀉、結(jié)腸炎甚至致死性假膜性腸炎，統(tǒng)稱為艱難梭菌感染(CDI)。廣譜抗菌藥物的使用、炎性反應(yīng)腸病、慢性肝病、器官移植、化療、長期使用激素、丙種球蛋白減少等患者以及懷孕及分娩前后的婦女更易發(fā)生CDI[1]。目前，CD是公認(rèn)的院內(nèi)感染和抗菌藥物相關(guān)性腹瀉最重要的病因。進(jìn)入21世紀(jì)以來，CDI發(fā)病率和疾病嚴(yán)重程度在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢。而我國多數(shù)醫(yī)院對CDI檢查手段有限，診斷率低，因此,目前對早期、快速、準(zhǔn)確、廉價地診斷CDI提出了更高要求，以期早期治療，降低住院時間、病死率等。本文就現(xiàn)有CDI檢測技術(shù)及其進(jìn)展作一綜述。

1 CD毒素檢測

1.1 細(xì)胞毒性試驗(CTA) CTA是通過驗證標(biāo)本中存在特異性毒性效應(yīng)產(chǎn)物來診斷CDI，主要原理是將過濾的糞便抽提物接種至處于生長的健康單層細(xì)胞中培養(yǎng)24～48 h，若樣本中存在CD毒素則會出現(xiàn)特殊的細(xì)胞病變效應(yīng)(細(xì)胞變圓)，為明確其特異性需再在樣本中加入特定的抗毒素進(jìn)行細(xì)胞毒素中和試驗。研究發(fā)現(xiàn)，毒素B所致的細(xì)胞病變效力是毒素A的103～104倍[2]。CTA因其敏感性和特異性高曾被美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)定為檢測CDI的金標(biāo)準(zhǔn)。但是CTA需要難度較高細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，測定時間長，受標(biāo)本稀釋濃度等影響使其在常規(guī)臨床微生物實驗室應(yīng)用有一定困難。

1.2 A/B毒素的免疫學(xué)檢測(A/B EIA) 該方法是通過檢測CD產(chǎn)生的主要毒素來判斷CDI。CD通常產(chǎn)生A、B兩種毒素，以前免疫學(xué)常針對的是毒素A，但近年國內(nèi)外均有A/B+株報道，且該菌株仍可導(dǎo)致嚴(yán)重CDI[3]。因此，現(xiàn)在都同時檢測A、B兩種毒素以提高檢測的靈敏度。目前主要采用酶聯(lián)免疫法、免疫層析法等。其基本原理是通過抗原抗體反應(yīng)使酶標(biāo)抗體(或抗原)結(jié)合到載體上，經(jīng)洗滌或?qū)游龊笈c底物反應(yīng)顯色，根據(jù)顏色深淺進(jìn)行定性或定量分析，數(shù)小時即可得出結(jié)果，是一種快速、簡單、便宜、設(shè)備技術(shù)要求不高的檢測手段，目前已經(jīng)有大量的商品試劑盒上市。以前A/B EIA是應(yīng)用最為廣泛的診斷方法。但有研究表明，與產(chǎn)毒株培養(yǎng)相比其敏感性為32.8%～57.1%，而且在臨床中標(biāo)本留取到正式進(jìn)入檢測的時間如果較長，則毒素容易分解，易造成假陰性[4]。目前普遍認(rèn)為EIA不能被作為一個單獨診斷CDI的檢查方法。CD毒素是導(dǎo)致CDI最直接的原因，因此毒素檢測對于CDI診斷具有很高特異性，但是其敏感性仍值得商榷。曾有報道，1例經(jīng)腸鏡檢查診斷為偽膜性腸炎的患者攜帶有CD產(chǎn)毒株，但是卻未檢測到CD毒素，在一定程度上提示若只依靠毒素檢測可能會導(dǎo)致某些CDI的漏診[5]。而關(guān)于毒素陽性與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系也存在一定分歧，這可能是由檢測方法不同導(dǎo)致[6-8]。英國衛(wèi)生部所發(fā)布的指南指出，只有檢測出CD毒素的患者才能上報CDI，因此毒素檢測在臨床上仍占有重要的位置。

2 CD細(xì)菌學(xué)檢測

2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 這是CDI的傳統(tǒng)檢測方法，其主要步驟是預(yù)處理大便后，接種至CD選擇性培養(yǎng)基-環(huán)絲氨酸頭孢西丁果糖瓊脂(CCFA)中，厭氧環(huán)境下至少培養(yǎng)48 h。如果有著足夠相關(guān)經(jīng)驗，根據(jù)培養(yǎng)基上菌落形態(tài)及革蘭染色陽性的證實就可明確有無CD，可疑者可進(jìn)行進(jìn)一步的生化鑒定。目前在傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法上也有一定的改進(jìn)，如在CCFA中加入?；悄懰徕c或者溶菌酶更有助于芽孢的富集，從而提高了敏感性[9]。CD培養(yǎng)敏感性高，培養(yǎng)得到的細(xì)菌可以進(jìn)一步進(jìn)行毒素分析、細(xì)菌分型、耐藥分析等，有利于流行病學(xué)調(diào)查研究。但是厭氧菌標(biāo)本收集要求高，培養(yǎng)難度大，陽性率受操作人員經(jīng)驗影響大，所需時間長，檢驗成本較高，在臨床實驗室未常規(guī)開展，主要用于科研方面。若培養(yǎng)為細(xì)菌陽性者也不能區(qū)別其是否產(chǎn)毒，因此，限制其進(jìn)一步的應(yīng)用。

2.2 CD共同抗原(GDH)檢測 CD共同抗原是CD表面大量表達(dá)的谷氨酸脫氫酶，目前主要用免疫學(xué)方法直接檢測大便中的GDH抗原。Crobach等[10]研究發(fā)現(xiàn)，GDH檢測與細(xì)菌培養(yǎng)和產(chǎn)毒株培養(yǎng)比較，其平均敏感性分別為88%和60%。Shetty等[11]用Meta分析發(fā)現(xiàn)，GDH檢測的陰性預(yù)測值在94.6%～100%。GDH穩(wěn)定性和靈敏度較高，不易受到標(biāo)本存放時間的影響，但不能區(qū)分是否為產(chǎn)毒株，且其最大優(yōu)勢在于有很高的陰性預(yù)測值，陰性結(jié)果者即可基本排除CD的存在，陽性者可再進(jìn)一步行毒素或產(chǎn)毒基因檢測，因此可以作為二步法或三步法的篩查試驗。

3 CD產(chǎn)毒菌株檢測

3.1 產(chǎn)毒菌株培養(yǎng)(TC) TC包括CD培養(yǎng)和毒素檢測兩個步驟。CD培養(yǎng)陽性者再進(jìn)行毒素檢測，后者主要有細(xì)胞毒性檢測，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測毒性基因，免疫法檢測毒素A/B等。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)只是檢測毒素基因，其有不一定表達(dá)或表達(dá)量太少無法致病的可能，而A/B EIA敏感性不高，因此目前產(chǎn)毒菌株培養(yǎng)是指CD培養(yǎng)加細(xì)胞毒性檢測才是公認(rèn)的診斷CDI的金標(biāo)準(zhǔn)[12[13-14]。

3.2 核酸擴(kuò)增試驗(NAAT)

3.2.1 PCR 因為所有產(chǎn)毒菌株都攜帶B毒素基因，因此大部分PCR主要針對艱難梭菌B毒素基因tcdB，也有針對艱難梭菌A毒素基因tcdA，負(fù)向調(diào)節(jié)基因tcdC，編碼二元毒素的基因cdtA和cdtB，CD的特異性基因等。在普通PCR基礎(chǔ)上已經(jīng)發(fā)展出實時熒光PCR，多重PCR等技術(shù)應(yīng)用于CDI檢測。Deshpande等[15]用Meta分析發(fā)現(xiàn)，實時熒光PCR與TC和CTA相比，其平均敏感性和特異性分別為90%、96%、89%、97%。Persson等[16]使用多重PCR檢測tcdA、tcdB、ctdA、cdtB和tcdC，發(fā)現(xiàn)其對027核酸型有很高特異性，并且能檢測其他CD臨床類型，對流行病學(xué)也有重要意義。目前已經(jīng)有多種商品試劑盒上市，有些可直接用于糞便檢測，耗時1～5 h不等，因其快速、高敏感性而被廣泛認(rèn)可。但是PCR仍存在一些問題：如引物結(jié)合區(qū)基因修飾導(dǎo)致假陰性結(jié)果；只攜帶產(chǎn)毒基因卻不表達(dá)或少量表達(dá)而不足以致?。粺o法區(qū)分疾病嚴(yán)重程度；新型菌株出現(xiàn)時易漏診，檢測費用昂貴等。

3.2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP) 因LAMP對目標(biāo)基因長度只能控制在200 bp左右，因此其針對的是tcdA。LAMP是利用鏈置換反應(yīng)在一定溫度下進(jìn)行，反應(yīng)只需將基因模板、4種針對靶基因的6個區(qū)域的特異性引物、鏈置換型DNA合成酶、基質(zhì)等共同置于一定溫度(60～65 ℃)下，經(jīng)1個步驟即可完成。Lalande等[17]以產(chǎn)毒株培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，用LAMP檢測CD發(fā)現(xiàn),敏感性和特異性分別可達(dá)91.8%和99.1%且可1 h內(nèi)出結(jié)果。Boyanton等[18]用實時熒光PCR與LAMP相比發(fā)現(xiàn)兩者在敏感性上相差無幾，后者特異性稍低一些，但都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過A/B EIA。該方法檢測時間短(1 h左右)、設(shè)備簡單、操作簡便、費用相對便宜，配合相應(yīng)顯色試劑還能實現(xiàn)肉眼判別結(jié)果。但其缺點是容易污染，造成假陽性結(jié)果；有些產(chǎn)毒菌株有tcdA缺失，從一定程度上影響了LAMP準(zhǔn)確度。

3.2.3 依賴解螺旋酶恒溫擴(kuò)增技術(shù)(HDA) 該技術(shù)是2004年報道的一種新型恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)。HDA基本原理是先用解旋酶解開雙鏈DNA，再依靠單鏈DNA結(jié)合蛋白與模板單鏈結(jié)合，使模板單鏈處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)它的完整性，引物與模板雜交，然后在DNA聚合酶催化下擴(kuò)增，新合成的雙鏈DNA即產(chǎn)物作為底物進(jìn)入下一輪擴(kuò)增。目前有分別針對tcdA、tcdB的HDA。Deak等[19]發(fā)現(xiàn)AmpliVue C.Difficile assay(針對tcdA)與LAMP法比較，其敏感性和特異性分別為96%、100%。有學(xué)者對The Portrait Toxigenic C.difficile assay(針對tcdB)進(jìn)行了一個多中心的臨床檢測評價，發(fā)現(xiàn)該法以TC為金標(biāo)準(zhǔn)，其敏感性和特異性分別為98.2%、92.8%，可在90 min內(nèi)出結(jié)果[20]。HDA模仿自然界DNA合成方式，不易引起非特異性擴(kuò)增，具有高敏感性和高保真性。反應(yīng)在同一溫度下可以進(jìn)行，因而不需要昂貴的PCR儀，很適合基層實驗室的使用，為一種嶄新的恒溫擴(kuò)增技術(shù)，雖然還有待更進(jìn)一步的探索研究，但是具有很大的發(fā)展前景。

目前NAAT因其敏感性高、快速而被廣泛認(rèn)可，2013年《美國胃腸病學(xué)雜志》發(fā)表的關(guān)于CDI診斷的指南中指出，建議NAAT可以單獨作為一種診斷手段[1]。它有利于臨床CDI診治和控制措施的快速開展，從而減少經(jīng)驗性治療、平均住院時間、CD傳播的發(fā)生率等，因此可一定程度上降低整體醫(yī)療支出[21]。但在臨床應(yīng)用中仍發(fā)現(xiàn)一些問題：難以區(qū)分無癥狀攜帶者；導(dǎo)致CDI發(fā)病率報道的增加[22]。因此，建議臨床醫(yī)生把檢測手段與臨床癥狀相結(jié)合以綜合判斷病情。

4 二步法和三步法

CTA和TC因敏感性高而曾先后推薦為CDI的診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但其技術(shù)要求高，耗費時間長；A/B EIA雖然方便、快速、便宜但敏感性不足；NAAT敏感性高、快速，但費用昂貴。因此很多指南推薦二步法和三步法，但關(guān)于該法的具體構(gòu)成存在不一致性。2012年英國衛(wèi)生部更新的指南建議：使用NAAT或GDH為初篩試驗，陽性者再加敏感的A/B EIA，全陽性考慮CDI；NAAT(GDH)陽性，A/B EIA陰性，考慮CD攜帶，有傳染的可能性，可選擇性地再進(jìn)行PCR檢測；全陰性不考慮CDI。2013年美國《胃腸病學(xué)雜志》發(fā)表的指南建議，GDH為初篩試驗，陰性者排除CDI；陽性者必須再進(jìn)行NAAT或A/B EIA檢測；NAAT陽性則考慮CDI，反之排除；A/B EIA陽性者考慮CDI，陰性者還需再用NAAT進(jìn)行確診[2]。無論二步法或三步法構(gòu)造怎樣，其都具有很好的敏感性和特異性[23-24]；雖然確診可能會稍有延長，但能夠迅速排除CDI，明顯縮減疾病負(fù)擔(dān)費用[25]。見表1。

表1 CDI實驗室檢測技術(shù)比較

5 小 結(jié)

CD正在不斷進(jìn)化，CDI的地理范圍、嚴(yán)重程度、發(fā)病特點、人群種類也在不斷變化。診斷CDI的檢測技術(shù)也經(jīng)歷了產(chǎn)毒細(xì)菌分離培養(yǎng)，免疫學(xué)檢測到分子生物學(xué)技術(shù)檢測時代。細(xì)菌分離培養(yǎng)是金標(biāo)準(zhǔn)，但對標(biāo)本、技術(shù)人員要求高，耗時長；免疫學(xué)檢測快速但是敏感性較低；NAAT則以更敏感、更快速而被大家推崇，雖然費用稍高，但是隨著不同的NAAT技術(shù)發(fā)展，費用正在逐步降低，有望走向臨床；二步法和三步法同時具有很好的敏感性和特異性，可針對性檢測，從而在整體效益上明顯縮減醫(yī)療費用，也有臨床應(yīng)用前景。但是因檢測到CD產(chǎn)毒基因并不代表CDI，因此CDI診斷需要結(jié)合患者癥狀和其他生化輔助指標(biāo)以綜合評判患者的病情，以免過度治療。如何提高CDI診斷率仍將是生物學(xué)工作者及臨床醫(yī)生的一大難題，本綜述對CDI的診斷技術(shù)進(jìn)行復(fù)習(xí)，希望對提高CDI的診斷意識及水平有一些幫助。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.049

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1672-9455(2015)08-1143-03

2014-10-17

2014-11-22)

△通訊作者，E-mail：fengp_62@163.com。