冰點(diǎn)滲透壓儀定量二甲基亞砜標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立*

張 朕,朱澤興,張樹明△(1.山西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，太原 030001；.中國(guó)人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院骨科，北京 100088)

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·臨床研究·

冰點(diǎn)滲透壓儀定量二甲基亞砜標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立*

張 朕1,2,朱澤興2,張樹明2△(1.山西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，太原 030001；2.中國(guó)人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院骨科，北京 100088)

滲透壓； 二甲基亞砜； 定量； 標(biāo)準(zhǔn)曲線

二甲基亞砜(DMSO,又名二甲亞砜)是一種由二甲基硫化物氧化合成的、無(wú)色吸濕性液體，最初來(lái)源于木漿加工廢品。其化學(xué)結(jié)構(gòu)使其具有高極性，硫-氧鍵確定DMSO的極性性質(zhì)，以溶解難溶性藥物的能力，其完全溶于水、常用的有機(jī)溶劑和不飽和烴[1]。此外，DMSO的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其能夠通過提高滲透性而不影響皮膚和身體膜的形態(tài)特征滲透膜屏障，其優(yōu)良的滲透性使其在日常生產(chǎn)生活中得到廣泛應(yīng)用[2-3]。同時(shí)，早在1972年，DMSO就被作為滲透性冷凍保護(hù)劑應(yīng)用。有報(bào)道，DMSO利用其滲透特性，通過保持凍融過程中蛋白質(zhì)和磷脂膜的完整性來(lái)發(fā)揮作用[4-6]。因?yàn)镈MSO本身具有毒性，其檢測(cè)一直是各個(gè)領(lǐng)域的研究方向。目前，對(duì)DMSO的檢測(cè)方法包括氣相色譜法、紫外線檢測(cè)儀法、磁共振法、高效液相色譜法等，適用于檢測(cè)各種不同的溶劑中的DMSO[7-12]。作者在研究離斷肢體冷凍保護(hù)劑的滲透性時(shí)，利用微透析技術(shù)將冷凍保護(hù)劑從離斷肢體中透析出來(lái)，而在檢測(cè)生理鹽水中的DMSO時(shí)，以上很多方法并不適用或有嚴(yán)重的缺陷[13]。而利用聯(lián)合檢測(cè)技術(shù)可以得到比較純凈的樣品，從而認(rèn)為溶質(zhì)和溶劑的成分是明確的，故選擇利用滲透壓的區(qū)別來(lái)定量生理鹽水中的DMSO。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 DMSO由Sigma公司生產(chǎn)，濃度大于或等于99.5%，細(xì)胞級(jí)；生理鹽水由大冢制藥生產(chǎn)。微量加樣槍由BIO-DL公司生產(chǎn)，誤差0.01%，不精確率0.32%；冰點(diǎn)滲透壓儀為德國(guó)L?ser公司生產(chǎn)的OM806型，重復(fù)性(±0.5%)，測(cè)量范圍：0～2 500 mOsm/kg H2O。檢測(cè)儀器、器皿均經(jīng)專業(yè)人員校準(zhǔn)。

1.2 方法 所有操作均在第二炮兵總醫(yī)院檢驗(yàn)科完成，室溫恒定17.9 ℃。以DMSO為溶質(zhì)，生理鹽水為溶劑，依次配制體積比濃度為1%～15%v/v DMSO的溶液，每個(gè)樣品100 μL液體，每個(gè)濃度分別滴定6個(gè)樣品；另配制100 μL濃度為1%v/v DMSO 6個(gè)樣品，依次成倍稀釋，得到濃度為0.5%v/v、0.25%v/v、0.125%v/v、0.062 5%v/v、0.031 25%v/v DMSO的溶液。利用冰點(diǎn)滲透壓儀檢測(cè)，每次檢測(cè)結(jié)束后擦拭檢測(cè)探針。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行配對(duì)樣品t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

圖1 滴定標(biāo)準(zhǔn)濃度DMSO滲透壓結(jié)果

表1 滴定標(biāo)準(zhǔn)濃度DMSO滲透壓統(tǒng)計(jì)描述(mOsm/kg H2O)

圖2 擬合曲線圖

3 討 論

當(dāng)一種溶質(zhì)加入到一種純?nèi)軇┲袝r(shí)，溶液會(huì)發(fā)生四種變化，即冰點(diǎn)降低、沸點(diǎn)升高、滲透壓升高、蒸汽壓降低，這些變化被稱為稀溶質(zhì)的依數(shù)性；而在物理化學(xué)中，任何溶液，如果其單位體積溶液所溶解的溶質(zhì)的顆粒總數(shù)相同，則引起溶液冰點(diǎn)下降的數(shù)值亦相同，此被稱為拉烏爾冰點(diǎn)原理，既滲透壓摩爾濃度與冰點(diǎn)溫度下降值為線性關(guān)系[15]。冰點(diǎn)滲透壓儀就是利用以上理論通過檢測(cè)溶液冰點(diǎn)的變化來(lái)測(cè)定其滲透壓的儀器，單位為mOsm/kg H2O。

將本文結(jié)果應(yīng)用于研究離斷肢體冷凍保護(hù)劑的滲透性，利用微透析(MD)將冷凍保護(hù)劑從離斷肢體中透析出來(lái)，灌流液為生理鹽水，當(dāng)DMSO的濃度不足時(shí)，回收樣品的滲透壓與生理鹽水的滲透壓一致，結(jié)果并未受組織內(nèi)生物小分子物質(zhì)的影響；當(dāng)提高DMSO的濃度時(shí)，回收樣品的滲透壓開始隨時(shí)間的變化而升高，所有可以推斷MD探針在斷肢中透析的小分子生理成分并不足以改變回收透析液的滲透壓，該實(shí)驗(yàn)方法具有其可行性。

本文通過對(duì)滴定標(biāo)準(zhǔn)濃度DMSO(溶劑為生理鹽水)通過冰點(diǎn)滲透壓儀進(jìn)行檢測(cè)，認(rèn)為該檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、便捷、有效、費(fèi)用低，得到其回歸方程公式2，敏感性s=0.1%v/v，檢測(cè)范圍為0.1%～10%v/v，區(qū)分度d=0.1%v/v，不精確度c=±2.35%，在檢測(cè)范圍內(nèi)。而隨著DMSO的體積濃度提高，溶液滲透壓隨之提高，該方法亦可用于其他溶質(zhì)、溶劑明確的、單一溶質(zhì)為變量的溶液檢測(cè)中。

志謝：第二炮兵總醫(yī)院檢驗(yàn)科在本實(shí)驗(yàn)過程中所提供的幫助。

[1]Jana M,Miroslav P,Hana K.Early ontogeny,growth and mortality of common carp(cyprinus carpio) at low concentrations of dimethyl sulfoxide[J].Acta Veterinaria Brno,2009,78(3):505-512.

[2]Kligman AM.Topical pharmacology and toxicology of dimethyl sulfoxide-Part1[J].JAMA,1965,193(10):796-804.

[3]Kligman AM.Dimethylsulfoxide-part2[J].JAMA,1965,193(11):923-928.

[4]Ashwood-Smith MJ,Warby C.Protective effect of low and high molecular weight com pounds on the stability of catalase subjected to freezing and thawing[J].Cryobiology,1972,9(2):137-140.

[5]Arakawa T,Carpenter JF,Kita YA,et al.The basis for toxicity of certain cryoprotectants:an hypothesis[J].Cryobiology,1990,27(4):401-415.

[6]Anchordoguy TJ,Rudolph AS,Carpenter JF,et al.Modes of interaction of cryoprotectants with membrane phospholipids during freezing[J].Cryobiology,1987,24(4):324-331.

[7]Willhite CC,Katz PI.Dimethylsulfoxide[J].J Appl Toxicol,1984,4(3):155-160.

[8]Susan EG,John PA.Determination of dimethyl sulfoxide in serum and other body fluids by gas chromatography[J].J Anal Toxicol,1982,6(2):76-81.

[9]Susan EG,John PA.Comparison of dimethyl sulfoxide levels in whole blood and serum using an autosampler-equipped gas chromatograph[J].Ann N Y Acad Sci,1983,441(6):328-331.

[10]Ivey JP,Haddad PR.Determination of dimethylsulphoxide using ion-exclusion chromatography with ultraviolet absorption detection[J].J Chro A,1987,391:309-314.

[11]Fuller BJ,Busza AL,Proctor E.Studies on cryoprotectant equilibration in the intact rat liver using nuclear magnetic resonance spectroscopy:a noninvasive method to assess distribution of dimethyl sulfoxide in tissues[J].Cryobiology,1989,26(2):112-118.

[12]John FC,Patti ED.Quantitation of dimethyl sulfoxide in solutions and tissues by high-performance liquid chromatography[J].Cryobiology,1991,28(3):210-215.

[13]Chandra S,Chaurasia,Markus M,et al.AAPS-FDA workshop white paper:microdialysis principles,application and regulatory perspectives[J].Phar Research,2007,24(5):589-603.

[14]Gordon HG,Andrew DO,Regina K,et al.GRADE guidelines 6.Rating the quality of evidence-imprecision[J].J Clin Epidemiol,2011,64(12):1283-1293.

[15]Peter A.Physical Chemistry 8ed[M].New York:W.H.Freeman and Company,2006：136-173.

全軍“十一五”醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金資助項(xiàng)目(08G051)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.029

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1672-9455(2015)08-1101-02

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