• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    Slit2/Robo4信號通路在神經(jīng)元遷移中的活力與凋亡影響

    2015-03-15 06:08:02劉忠志張正洪湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科湖北十堰442000
    關(guān)鍵詞:內(nèi)源性原代氧化應(yīng)激

    劉忠志,張正洪(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,湖北十堰 442000)

    ?

    Slit2/Robo4信號通路在神經(jīng)元遷移中的活力與凋亡影響

    劉忠志,張正洪(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,湖北十堰 442000)

    目的 探討Slit2/Robo4信號通路在神經(jīng)元遷移中的活力與凋亡影響,為闡明腦缺血后神經(jīng)血管新生的機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 選擇成年雄性遠(yuǎn)交群(SD)大鼠,建立缺血性腦卒中動物模型,采用Western blot方法測定梗死側(cè)與非梗死側(cè)Slit2和Robo4的表達(dá)。取原代培養(yǎng)10~14 d的神經(jīng)元種六孔板,分為加藥組H2O2(100 μmol/L)、對照組、H2O2(100 μmol/L)+Slit2 (3 μg/mL)組,行MTT方法檢測細(xì)胞活力與雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 Western blot結(jié)果顯示,梗死側(cè)Slit2和Robo4表達(dá)均較非梗死側(cè)明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。100 μmol/L H2O2處理原代培養(yǎng)神經(jīng)元24 h會導(dǎo)致Slit2和Robo4表達(dá)升高(P<0.05)。MTT結(jié)果示,H2O2、H2O2+Slit2組細(xì)胞活力都有明顯下降,其中,H2O2+Slit2組的細(xì)胞存活率明顯高于單純H2O2組(P<0.05)。流式細(xì)胞學(xué)顯示,H2O2+Slit2組的細(xì)胞凋亡率明顯低于H2O2組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 缺血性腦卒中有內(nèi)源性Slit2/Robo4信號通路的激活,而外源性Slit2可以促進(jìn)氧化應(yīng)激時神經(jīng)元的存活能力,抑制其凋亡作用,從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。

    Slit2/Robo4信號通路; 缺血性腦卒中; 神經(jīng)元遷移

    當(dāng)前我國的缺血性腦卒中的發(fā)病率逐漸增高,病死率在20%左右,嚴(yán)重影響患者的身心健康[1]。眾所周知,當(dāng)腦組織遭受到缺血、缺氧和外傷等有害刺激時,機(jī)體會啟動自身的固有機(jī)制,可達(dá)到減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷的目的[2-3]。其中機(jī)體引起的氧化應(yīng)激會損傷細(xì)胞脂質(zhì)膜、蛋白及DNA,導(dǎo)致細(xì)胞損傷。而腦組織中富含脂肪組織,對氧化應(yīng)激更敏感,因而,氧化應(yīng)激在腦缺血時更易引起神經(jīng)組織的損傷[4]。在治療中,積極促進(jìn)缺血性腦卒中神經(jīng)元的存活能力,抑制神經(jīng)元的凋亡,減少神經(jīng)元損失,能有效改善預(yù)后[5-6]。近年來,隨著醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)的發(fā)展,許多研究者正關(guān)注于研究抑制內(nèi)源性缺血損傷反應(yīng)和增強(qiáng)內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)作用的途徑,從而促進(jìn)腦組織修復(fù)和再生[7]。20世紀(jì)末,Slit/Robo信號通路已經(jīng)被明確闡述為細(xì)胞膜外蛋白,具有排斥、引導(dǎo)神經(jīng)元軸突方向,控制神經(jīng)元遷移等作用[8]。其中Slit2在腫瘤細(xì)胞的代謝中起著重要的作用,Slit2對于神經(jīng)元的出芽和血管的再生作用可能與神經(jīng)再生有關(guān),Robo4作為一種Slit的血管專門受體[9]。Slit2分別通過與Robo4結(jié)合后抑制血管的再生,同時,通過抑制水腫的形成和組織損傷在缺血發(fā)生后發(fā)揮保護(hù)作用[10]。另外有研究表明,缺血性腦卒中后有內(nèi)源性血管新生,新生的血管可更好地促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。為此,相關(guān)研究者逐漸開始致力于腦血管生成機(jī)制的研究,尋找治療缺血性腦卒中新的、更有效的治療策略[11-12]。本文具體探討了Slit2/Robo4信號通路在神經(jīng)元遷移中的活力與凋亡影響,希望為闡明腦缺血后神經(jīng)血管新生機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 研究材料 選擇成年雄性遠(yuǎn)交群(SD)大鼠,為出生后1~3 d SD新生鼠(200~250 g),清潔級,由本院動物中心提供,符合動物倫理學(xué)和動物實(shí)驗(yàn)基本管理條例。

    1.2 動物模型的建立 本文建立了缺血性腦卒中動物模型,其構(gòu)建措施為:SD大鼠進(jìn)行10%水合氯醛35 mL/kg麻醉、剪毛、消毒;選擇頸部正中切口,分離淺筋膜,暴露頸前肌群,可見頸總動脈,分離動脈鞘和迷走神經(jīng)。結(jié)扎頸總動脈近心端,蛙心夾夾閉頸外動脈,打結(jié)頸總動脈近分叉處;選擇7號頭皮針扎頸外動脈分叉處,閉合創(chuàng)口。2 h后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分,選擇評分結(jié)果為1~3分為成功模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.3 分組 SD大鼠行線栓法大腦動脈阻斷缺血模型3 d后殺死,取雙側(cè)大腦半球,以非梗死側(cè)為對照組,選擇Western blot方法檢測Slit2/Robo4信號途徑分子Slit2和Robo4變化。然后取原代培養(yǎng)10~14 d的神經(jīng)元種六孔板,分為加藥組H2O2(100 μmol/L)及對照組,也采用Western blot方法檢測上述指標(biāo)的變化。同時,取原代培養(yǎng)10~14 d的神經(jīng)元種板,待24 h后細(xì)胞生長較為豐滿為加藥,分對照組、H2O2(100 μmol/L)組、H2O2(100 μmol/L)+Slit2(3 μg/mL)組,共3組,作用24 h后收集細(xì)胞行MTT方法檢測細(xì)胞活力,雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。

    2 結(jié) 果

    2.1 缺血性腦卒中的Slit2/Robo4信號通路變化對比 經(jīng)過判定,動物模型都構(gòu)建成功,同時,用抗神經(jīng)元特異中間絲蛋白NESTIN抗體鑒定原代培養(yǎng)的神經(jīng)元。結(jié)果顯示,90%以上實(shí)驗(yàn)材料為NESTIN陽性細(xì)胞,即神經(jīng)元含量占90%以上。筆者采用Western blot方法測定梗死側(cè)與非梗死側(cè)Slit2和Robo4的表達(dá),結(jié)果顯示梗死側(cè)Slit2和Robo4表達(dá)均較非梗死側(cè)明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

    圖1 動物模型中Shh信號傳導(dǎo)通路相關(guān)信號分子表達(dá)改變

    2.2 神經(jīng)元氧化應(yīng)激Slit2/Robo4信號通路變化對比 筆者以100 μmol/L H2O2處理原代培養(yǎng)神經(jīng)元24 h,Western blot方法觀察Slit2/Robo4信號通路分子表達(dá)改變,結(jié)果均有Slit2和Robo4表達(dá)升高(P<0.05),表明神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷早期即有Slit2/Robo4信號通路的激活。見圖2。

    2.3 細(xì)胞活力及凋亡的影響 原代培養(yǎng)10~14 d的神經(jīng)元種六孔板,待24 h后細(xì)胞生長較為豐滿為加藥,分為對照組、H2O2(100 μmol/L)組、H2O2+Slit2組,作用24 h后收集細(xì)胞,觀察細(xì)胞凋亡及存活的改變。MTT結(jié)果示,H2O2、H2O2+Slit2組細(xì)胞活力都有明顯下降,其中H2O2+Slit2組的細(xì)胞存活率明顯高于單純H2O2組(P<0.05),說明Slit2/Robo4信號通路可以促進(jìn)氧化應(yīng)激時神經(jīng)元的存活。流式細(xì)胞學(xué)顯示,H2O2+Slit2組的細(xì)胞凋亡率明顯低于H2O2組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示Slit2/Robo4信號通路氧化應(yīng)激時具有抗神經(jīng)元凋亡作用。見圖3、4。

    圖2 氧化應(yīng)激Shh信號傳導(dǎo)通路相關(guān)信號分子表達(dá)改變

    圖3 Hochest染色Shh對神經(jīng)元氧化應(yīng)激時神經(jīng)元凋亡的影響(定量)

    圖4 Hochest染色對神經(jīng)元氧化應(yīng)激時神經(jīng)元凋亡的影響(定性)

    3 討 論

    當(dāng)前,對于缺血性腦卒中的有效治療手段仍非常有限,在腦缺血時,防御和應(yīng)激反應(yīng)可觸發(fā)和啟動一系列內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù),其作用機(jī)制涉及腺苷、神經(jīng)營養(yǎng)因子等多個環(huán)節(jié)。雖然目前內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)作用的存在和增強(qiáng)可顯著改善腦組織受損程度和預(yù)后已得到證實(shí),但是具體機(jī)制還不明確[13]。

    神經(jīng)的連接構(gòu)成了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育基礎(chǔ),在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中,軸突的生長受生長錐生長方向的分子調(diào)節(jié)和控制。一些軸突生長導(dǎo)向因子通過調(diào)節(jié)軸突生長時的吸引排斥信號影響軸突生長,這種信號調(diào)控也有助于血管的再生[14]。神經(jīng)生長導(dǎo)向分子與生長抑制分子都由軸突延伸的四周和靶組織細(xì)胞產(chǎn)生,其可以與相應(yīng)的特定受體分子作用,引導(dǎo)軸突靶向延伸,一些經(jīng)典的神經(jīng)生長導(dǎo)向因子在腦缺血時對神經(jīng)元和血管均可起到促進(jìn)新生進(jìn)而改善神經(jīng)功能恢復(fù)的作用[15]。而Slit是發(fā)現(xiàn)的第一種對神經(jīng)生長和神經(jīng)元遷移都有導(dǎo)向作用的因子,促進(jìn)軸突向正確的方向延伸,同時,對神經(jīng)元的遷移也有導(dǎo)向作用[16]。Slit可與其跨膜受體Roundabout(Robo)蛋白家族相結(jié)合,受體Robo主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng),Slit/Robo不僅參與生理病理情況下的突觸可塑性調(diào)節(jié),而且還參與了各種腫瘤細(xì)胞的生長以及腫瘤血管生成的調(diào)節(jié)。研究已證明,在大鼠全腦缺血模型及神經(jīng)元/神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞模型中,Slit可以減少神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的死亡,并且Slit/Robo對神經(jīng)元/神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有直接的保護(hù)作用。

    本文結(jié)果顯示,梗死側(cè)Slit2和Robo4表達(dá)均較非梗死側(cè)明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示在損傷早期即有Slit2和Robo4表達(dá)的明顯上調(diào),提示Slit2/Robo4信號傳導(dǎo)通路可能為快速損傷反應(yīng)因子,可能是一個對損傷反應(yīng)的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制。有研究也認(rèn)為Slit2與Robo4相結(jié)合,能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移,從而抑制血管的再生,表明Slit2激動Robo4后會抑制VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、重組和構(gòu)建[17]。

    筆者以100 μmol/L H2O2處理原代培養(yǎng)神經(jīng)元24 h,Western blot方法觀察Slit2/Robo4信號通路分子表達(dá)改變,結(jié)果均有Slit2/Robo4表達(dá)升高(P<0.05),表明神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷早期即有Slit2/Robo4信號通路的激活,同時缺血及其他損傷可以促進(jìn)神經(jīng)再生[18]。

    凋亡是一種細(xì)胞的程序性死亡,許多刺激因素可以通過激活凋亡傳導(dǎo)途徑及級聯(lián)放大反應(yīng)等引起細(xì)胞凋亡。本文流式細(xì)胞學(xué)顯示,H2O2+Slit2組的細(xì)胞凋亡率明顯高于H2O2組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示Slit2/Robo4信號通路氧化應(yīng)激時具有抗神經(jīng)元凋亡作用。在神經(jīng)發(fā)育的早期階段,Slit2/Robo4信號通路參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié),對正常發(fā)育的維持起到重要作用[19]。而在缺血性腦卒中,細(xì)胞凋亡是缺血半暗帶區(qū)缺血再灌注損傷時細(xì)胞死亡的主要形式之一,缺血可誘發(fā)Slit2的表達(dá),提示Slit2/Robo4信號通路在腦卒中通過抗凋亡途徑可能具有潛在的治療作用。

    總之,缺血性腦卒中有內(nèi)源性Slit2/Robo4信號通路的激活,而外源性Slit2可以促進(jìn)氧化應(yīng)激時神經(jīng)元的存活能力,抑制其凋亡作用,從而起到神經(jīng)保護(hù)作用,也提示Slit2/Robo4可能是缺血性腦卒中的一個重要的新的治療靶點(diǎn)。

    [1]Navaratna D,Guo S,Aral K,et al.Mechanisms and targets for angiogenic therapy after stroke[J].Cell Adh Migr,2009,3(2):216-223.

    [2]Gorbunova EE,Gavrilovskaya IN,Mackow ER.Slit2-Robo4 receptor responses inhibit ANDV directed permeability of human lung microvascular endothelial cells[J].Antiviral Res,2013,99(2):108-112.

    [3]Zhang X,Yu J,Kuzontkoski PM,et al.Slit2/Robo4 signaling modulates HIV-1 gp120-induced lymphatic hyperpermeability[J].PLoS Pathog,2012,8(1):1002-1004.

    [4]Auriel E,Bomstein NM.Neuro protection in acute ischemie stroke-current status[J].J Cell mol Med,2010,14(9):2200-2202.

    [5]黃莉蕓,周希瑗.腺病毒介導(dǎo)的slit2 shRNA對缺氧誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響[J].中國生物制品學(xué)雜志,2014,27(3):361-365.

    [6]Yu J,Zhang X,Kuzontkoski PM,et al.Slit2N and Robo4 regulate lymphangiogenesis through the VEGF-C/VEGFR-3 pathway[J].Cell Commun Signal,2014,12(1):25-26.

    [7]Kidd PM.Integrated brain restoration after ischemic stroke-medical management,risk factors,nutrients,and other interventions for managing inflammation and enhancing brain plasticity[J].Altern Med Rev,2009,14(1):14-15.

    [8]Hou ST,Jiang SX,Smith RA.Permissive and repulsive cues and signalling pathways of axonal outgrowth and regeneration[J].Int Rev Cell Mol Biol,2008,267(12):125-127.

    [9]Wang L,Zhang ZG,Gregg SR,et al.The sonic hedgehog pathway mediates carbamylated EPO enhanced proliferation and differentiation of adult neural progenitor cells[J].J Biol Chem,2007,282(10):32462-32470.

    [10]Chen ZY,Asavaritikrai P,Prchal JT,et al.Endogenous erythropoietin signaling is required for normal neural progenitor cell proliferation[J].J Biol Chem,2008,282(8):25875-25883.

    [11]G?hrig A,Detjen KM,Hilfenhaus G,et al.Axon guidance factor SLIT2 inhibits neural invasion and metastasis in pancreatic cancer[J].Cancer Res,2014,74(5):1529-1540.

    [12]Lu ZH,Kaliberov S,Sohn RE,et al.Transcriptional targeting of primary and metastatic tumor neovasculature by an adenoviral type 5 roundabout4 vector in mice[J].PLoS One,2013,8(12):83933-83935.

    [13]Smith-Berdan S,Schepers K,Ly A,et al.Dynamic expression of the Robo ligand Slit2 in bone marrow cell populations[J].Cell Cycle,2012,11(4):675-682.

    [14]Paul JD,Coulombe KL,Toth PT,et al.SLIT3-ROBO4 activation promotes vascular network formation in human engineered tissue and angiogenesis in vivo[J].J Mol Cell Cardiol,2013,64(2):124-131.

    [15]Jones CA.Robo4 stabilizes the vascular network by inhibiting pathologic angiogenesis and endothelial hyperpermeability[J].Nat Med,2008,14(4):448-453.

    [16]Ma C,Lu XC,Luo Y,et al.Angiogenesis related gene expression profiles of EA.hy926 cells induced by irbesartan:a possible novel therapeutic approach[J].Chin Med J (Engl),2012,125(8):1369-1375.

    [17]Goto-Koshino Y,Fukuchi Y,Shibata F,et al.Robo4 plays a role in bone marrow homing and mobilization,but is not essential in the long-term repopulating capacity of hematopoietic stem cells[J].PLoS One,2012,7(11):50849-50850.

    [18]Morlot C.Structural insights into the Slit-Robo complex[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(38):14923-14928.

    [19]Okada Y.Transcriptional regulation of the endothelial cell-specific receptor,Robo4[J].Yakugaku Zasshi,2012,132(9):1045-1049.

    The viability and apoptosis effects of Slit2/Robo4 polarity signaling in neuronal migration

    LIUZhong-zhi,ZHANGZheng-hong

    (Departmentofinternalmedicine,AffiliatedDongfengHospitalofHubeiMedicalCollege,Shiyan,Hubei442000,China)

    Objective To investigate the viability and apoptosis effects of Slit2/Robo4 polarity signaling in neuronal migration for providing theoretical and experimental mechanisms basis for elucidating cerebral ischemia angiogenesis.Methods Adult male SD rats were established animal models of ischemic stroke,the expression of non-infarct infarction side Slit2 and Robo4 were measured by the Western blot method.The neurons cell by 10-14 days primary cultured were selected and switched to six-well plat,there were divided dosing group H2O2(100 μmol/L),the control group and H2O2(100 μmol/L)+Slit2(3 μg/mL) group,the cell viability were detected by MTT and double staining apoptosis were detected by flow cytometry.Results Western blot showed infarction side Slit2 and Robo4 expression were significantly higher than that of non-infarcted side(P<0.05).When treated by the 100 μmol/L H2O2treatment of primary cultured neurons 24 hours will cause increased expression of Slit2 and Robo4(P<0.05).MTT results shown the H2O2,H2O2+Slit2 groups had significantly decreased in cell viability,which the cell survival rate of H2O2+Slit2 group were significantly higher than those of H202group(P<0.05).The apoptosis rate of H2O2+Slit2 group were significantly lower than those of Slit2 H2O2group(P<0.05).Conclusion Ischemic stroke had Slit2/Robo4 endogenous pathway activated,and the exogenous Slit2 can promote the viability of the neuronal oxidative stress and inhibit apoptosis,thereby it can protect the neuro.

    Slit2/Robo4 signaling pathway; ischemic stroke; neuronal migration

    劉忠志,男,主治醫(yī)師,本科,主要從事神經(jīng)內(nèi)科臨床工作。

    10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.015

    A

    1672-9455(2015)08-1065-03

    2014-11-10

    2014-11-22)

    猜你喜歡
    內(nèi)源性原代氧化應(yīng)激
    內(nèi)源性NO介導(dǎo)的Stargazin亞硝基化修飾在腦缺血再灌注后突觸可塑性中的作用及機(jī)制
    病毒如何與人類共進(jìn)化——內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的秘密
    科學(xué)(2020年3期)2020-11-26 08:18:34
    基于炎癥-氧化應(yīng)激角度探討中藥對新型冠狀病毒肺炎的干預(yù)作用
    改良無血清法培養(yǎng)新生SD乳鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞
    新生大鼠右心室心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定
    艾迪注射液對大鼠原代肝細(xì)胞中CYP1A2、CYP3A2酶活性的影響
    中成藥(2018年9期)2018-10-09 07:18:32
    氧化應(yīng)激與糖尿病視網(wǎng)膜病變
    內(nèi)源性12—HETE參與缺氧對Kv通道抑制作用機(jī)制的研究
    內(nèi)源性雌激素及雌激素受體α水平與中老年男性冠心病的相關(guān)性
    氧化應(yīng)激與結(jié)直腸癌的關(guān)系
    日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲中文日韩欧美视频| 又紧又爽又黄一区二区| 午夜a级毛片| 亚洲无线在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 国产av一区在线观看免费| 国产免费男女视频| av天堂在线播放| 天堂√8在线中文| 99riav亚洲国产免费| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 精品国产国语对白av| 999久久久精品免费观看国产| 丰满的人妻完整版| 99riav亚洲国产免费| 欧美国产日韩亚洲一区| 手机成人av网站| 午夜福利18| 久久久久国内视频| 91国产中文字幕| 日韩大码丰满熟妇| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| av福利片在线| 色播在线永久视频| 大型黄色视频在线免费观看| 十八禁网站免费在线| 男人的好看免费观看在线视频 | 在线av久久热| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 又大又爽又粗| 久久性视频一级片| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | av天堂在线播放| 日韩欧美三级三区| 色综合站精品国产| 亚洲中文av在线| 国产精品精品国产色婷婷| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 色精品久久人妻99蜜桃| svipshipincom国产片| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 无遮挡黄片免费观看| 99国产综合亚洲精品| 国产麻豆成人av免费视频| svipshipincom国产片| 女人被狂操c到高潮| 久久草成人影院| www.熟女人妻精品国产| 妹子高潮喷水视频| av有码第一页| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 少妇熟女aⅴ在线视频| 12—13女人毛片做爰片一| www.自偷自拍.com| 亚洲第一av免费看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产亚洲av嫩草精品影院| 中文字幕最新亚洲高清| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产在线观看jvid| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美午夜高清在线| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 欧美日韩一级在线毛片| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 精品日产1卡2卡| 中文字幕久久专区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 神马国产精品三级电影在线观看 | 一本一本综合久久| √禁漫天堂资源中文www| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 久久九九热精品免费| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 久久久久亚洲av毛片大全| www.999成人在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 观看免费一级毛片| 久久精品91蜜桃| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 日韩欧美免费精品| 后天国语完整版免费观看| 国产激情久久老熟女| 黄色毛片三级朝国网站| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲精品一区av在线观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲欧美精品综合久久99| 白带黄色成豆腐渣| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲成人久久爱视频| 99国产精品99久久久久| 午夜福利18| 久久久久久久精品吃奶| 看免费av毛片| 一级a爱片免费观看的视频| cao死你这个sao货| 99精品在免费线老司机午夜| 无遮挡黄片免费观看| 欧美在线一区亚洲| 看免费av毛片| 欧美在线黄色| 成年人黄色毛片网站| 黄色毛片三级朝国网站| av在线播放免费不卡| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产高清激情床上av| 高清毛片免费观看视频网站| 精品国产国语对白av| 一级a爱片免费观看的视频| 日本 欧美在线| 日韩欧美国产在线观看| 成人av一区二区三区在线看| 香蕉丝袜av| 精品日产1卡2卡| 又紧又爽又黄一区二区| a级毛片a级免费在线| 桃色一区二区三区在线观看| 一级黄色大片毛片| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 视频区欧美日本亚洲| www国产在线视频色| 白带黄色成豆腐渣| 国产精品一区二区三区四区久久 | 精品一区二区三区视频在线观看免费| av有码第一页| 国产久久久一区二区三区| 国产亚洲av高清不卡| 变态另类丝袜制服| 欧美另类亚洲清纯唯美| 男人舔女人的私密视频| 日韩av在线大香蕉| 国产激情偷乱视频一区二区| 美女免费视频网站| 在线观看午夜福利视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 99久久国产精品久久久| 国产精品1区2区在线观看.| 国产精品一区二区三区四区久久 | 老司机靠b影院| 日韩视频一区二区在线观看| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲精品国产区一区二| 日日干狠狠操夜夜爽| 黄色丝袜av网址大全| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲一码二码三码区别大吗| 人人澡人人妻人| 欧美+亚洲+日韩+国产| 两个人视频免费观看高清| 99热这里只有精品一区 | 丁香六月欧美| 婷婷六月久久综合丁香| 免费在线观看成人毛片| 日本黄色视频三级网站网址| 制服丝袜大香蕉在线| 国产片内射在线| 少妇粗大呻吟视频| a级毛片在线看网站| 精品一区二区三区av网在线观看| www日本黄色视频网| 99riav亚洲国产免费| 波多野结衣巨乳人妻| 国产一区在线观看成人免费| 久99久视频精品免费| 亚洲精品av麻豆狂野| 妹子高潮喷水视频| 18禁国产床啪视频网站| 成人午夜高清在线视频 | 国产成人欧美| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲av电影在线进入| 国产欧美日韩一区二区精品| 九色国产91popny在线| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲人成77777在线视频| 日韩欧美在线二视频| 成人av一区二区三区在线看| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产免费男女视频| 美女高潮到喷水免费观看| 特大巨黑吊av在线直播 | 国产单亲对白刺激| 一边摸一边做爽爽视频免费| 一夜夜www| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产真人三级小视频在线观看| tocl精华| 黄色成人免费大全| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 我的亚洲天堂| 国产av一区二区精品久久| 亚洲成人久久爱视频| 曰老女人黄片| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 99精品在免费线老司机午夜| 午夜免费观看网址| 欧美一级毛片孕妇| 久久久久亚洲av毛片大全| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 人人澡人人妻人| 日韩成人在线观看一区二区三区| 欧美日韩福利视频一区二区| 熟女电影av网| 大型av网站在线播放| 国产99久久九九免费精品| 亚洲精品在线观看二区| 天天添夜夜摸| 成人国语在线视频| 一本大道久久a久久精品| av天堂在线播放| 黄频高清免费视频| 老司机福利观看| 亚洲色图av天堂| АⅤ资源中文在线天堂| 99在线视频只有这里精品首页| 人人妻人人看人人澡| 亚洲精品在线观看二区| 91成年电影在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 99精品在免费线老司机午夜| 色哟哟哟哟哟哟| 搡老岳熟女国产| 香蕉丝袜av| 欧美中文日本在线观看视频| 国产熟女xx| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 麻豆成人午夜福利视频| 少妇 在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲五月色婷婷综合| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 一区二区三区国产精品乱码| 波多野结衣高清作品| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久人人精品亚洲av| 久久性视频一级片| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 久久久国产精品麻豆| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 欧美在线黄色| 欧美中文日本在线观看视频| 精品人妻1区二区| 久久午夜亚洲精品久久| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 叶爱在线成人免费视频播放| 在线国产一区二区在线| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产欧美日韩一区二区三| 国产97色在线日韩免费| 欧美一区二区精品小视频在线| 香蕉丝袜av| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲电影在线观看av| 国产一区二区激情短视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 韩国精品一区二区三区| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产精品精品国产色婷婷| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧美激情极品国产一区二区三区| 香蕉国产在线看| 日日爽夜夜爽网站| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 91老司机精品| 久久精品人妻少妇| 亚洲av美国av| 中文在线观看免费www的网站 | 免费在线观看日本一区| 不卡av一区二区三区| 他把我摸到了高潮在线观看| 哪里可以看免费的av片| 在线av久久热| 国产精品99久久99久久久不卡| 91成年电影在线观看| www.精华液| 国产精品综合久久久久久久免费| 日本免费a在线| 中出人妻视频一区二区| 欧美精品亚洲一区二区| 国产精品一区二区三区四区久久 | 757午夜福利合集在线观看| 欧美黑人精品巨大| 一进一出抽搐动态| 亚洲国产精品合色在线| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 日本在线视频免费播放| 12—13女人毛片做爰片一| 俄罗斯特黄特色一大片| 怎么达到女性高潮| 亚洲 国产 在线| 免费搜索国产男女视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 97碰自拍视频| 亚洲国产精品成人综合色| 国产成人欧美在线观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 男女床上黄色一级片免费看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 欧美精品亚洲一区二区| 色综合站精品国产| 久久国产精品人妻蜜桃| 老司机靠b影院| 国产一区二区在线av高清观看| 久久久国产成人精品二区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久久国产成人免费| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 婷婷六月久久综合丁香| 在线观看免费午夜福利视频| 色老头精品视频在线观看| 国产精品,欧美在线| 99久久综合精品五月天人人| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲精品在线观看二区| 国产区一区二久久| 久久人人精品亚洲av| 国产日本99.免费观看| 91字幕亚洲| 欧美日韩福利视频一区二区| 好男人电影高清在线观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| a在线观看视频网站| 一级黄色大片毛片| 午夜免费激情av| 在线观看66精品国产| 欧美黑人巨大hd| 亚洲av五月六月丁香网| 午夜福利在线观看吧| 国产乱人伦免费视频| 色播亚洲综合网| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 啦啦啦免费观看视频1| 国产精品亚洲av一区麻豆| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 在线观看午夜福利视频| 天天一区二区日本电影三级| 久久精品影院6| 99精品久久久久人妻精品| 成人永久免费在线观看视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 麻豆成人午夜福利视频| 欧美性长视频在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 最新在线观看一区二区三区| 国产午夜福利久久久久久| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产1区2区3区精品| 波多野结衣高清作品| www.精华液| 午夜免费成人在线视频| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久久久国内视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 成年女人毛片免费观看观看9| 精品久久久久久,| 欧美色欧美亚洲另类二区| 一区二区三区激情视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 亚洲国产高清在线一区二区三 | 成熟少妇高潮喷水视频| 大型黄色视频在线免费观看| 最近最新免费中文字幕在线| 91九色精品人成在线观看| 18禁国产床啪视频网站| or卡值多少钱| 亚洲av美国av| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产私拍福利视频在线观看| 国产单亲对白刺激| 妹子高潮喷水视频| 欧美成人性av电影在线观看| 国产1区2区3区精品| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产精品电影一区二区三区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 亚洲五月天丁香| 久久久久久久久中文| 欧美午夜高清在线| 国产97色在线日韩免费| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 久久午夜综合久久蜜桃| 在线视频色国产色| 久久香蕉激情| 国产精品98久久久久久宅男小说| videosex国产| xxx96com| 国产av一区二区精品久久| 99久久综合精品五月天人人| 久久99热这里只有精品18| 黑人欧美特级aaaaaa片| 美女高潮到喷水免费观看| 久久精品国产综合久久久| 99国产综合亚洲精品| 欧美精品啪啪一区二区三区| 视频在线观看一区二区三区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 热99re8久久精品国产| 国产亚洲精品第一综合不卡| 午夜久久久在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 看片在线看免费视频| 大香蕉久久成人网| 免费在线观看影片大全网站| 免费在线观看亚洲国产| 国产又色又爽无遮挡免费看| 两个人看的免费小视频| 90打野战视频偷拍视频| 99国产精品一区二区三区| av超薄肉色丝袜交足视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 可以在线观看的亚洲视频| 男女午夜视频在线观看| 国产久久久一区二区三区| 99热只有精品国产| 亚洲中文日韩欧美视频| 欧美激情高清一区二区三区| 中文字幕高清在线视频| 亚洲精品色激情综合| 最新在线观看一区二区三区| 悠悠久久av| 精品欧美国产一区二区三| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 中国美女看黄片| 曰老女人黄片| 日本a在线网址| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| 91成人精品电影| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 欧美黄色片欧美黄色片| 黑人操中国人逼视频| cao死你这个sao货| 身体一侧抽搐| 在线看三级毛片| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产精品久久视频播放| 国产爱豆传媒在线观看 | 在线十欧美十亚洲十日本专区| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲专区中文字幕在线| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产成人精品久久二区二区免费| 69av精品久久久久久| 欧美三级亚洲精品| 国产视频内射| 精品国产美女av久久久久小说| 怎么达到女性高潮| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 在线观看免费午夜福利视频| 国产一区在线观看成人免费| 高潮久久久久久久久久久不卡| 听说在线观看完整版免费高清| 精品福利观看| 操出白浆在线播放| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美一级a爱片免费观看看 | 老司机午夜福利在线观看视频| 国产一卡二卡三卡精品| 热re99久久国产66热| 成人午夜高清在线视频 | 十分钟在线观看高清视频www| 午夜a级毛片| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 香蕉丝袜av| 国产视频一区二区在线看| 无人区码免费观看不卡| 国产真人三级小视频在线观看| 人人澡人人妻人| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久热爱精品视频在线9| 制服诱惑二区| 搡老岳熟女国产| 91老司机精品| 一夜夜www| 动漫黄色视频在线观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 在线永久观看黄色视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 免费观看人在逋| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲人成伊人成综合网2020| 午夜福利一区二区在线看| 一级毛片高清免费大全| 久久亚洲真实| www.自偷自拍.com| 国产片内射在线| 久久久国产精品麻豆| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲成人久久爱视频| av欧美777| 久久 成人 亚洲| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产一区二区在线av高清观看| 婷婷亚洲欧美| 中文字幕人妻熟女乱码| 日本 av在线| 99国产精品99久久久久| 1024视频免费在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲无线在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久这里只有精品19| 精品国产美女av久久久久小说| 黑人操中国人逼视频| 一本久久中文字幕| 最好的美女福利视频网| 两个人看的免费小视频| 51午夜福利影视在线观看| 黄色 视频免费看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产精品一区二区精品视频观看| x7x7x7水蜜桃| 黄片小视频在线播放| 国产免费男女视频| 久久香蕉激情| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 成人精品一区二区免费| 免费看十八禁软件| 精品人妻1区二区| 九色国产91popny在线| 国产黄色小视频在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 久久国产精品人妻蜜桃| 日本黄色视频三级网站网址| 高清毛片免费观看视频网站| 熟女电影av网| 99在线视频只有这里精品首页| 少妇粗大呻吟视频| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 两个人免费观看高清视频| 欧美久久黑人一区二区| 美女高潮到喷水免费观看| 91在线观看av| 成人午夜高清在线视频 | a在线观看视频网站| 精品久久久久久,| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲五月天丁香| 国产亚洲精品第一综合不卡| 怎么达到女性高潮| 日本 欧美在线| 午夜影院日韩av| 欧美最黄视频在线播放免费| 最近最新免费中文字幕在线| 久久久国产欧美日韩av| 国产精品电影一区二区三区| 18美女黄网站色大片免费观看| 亚洲自拍偷在线| 中文字幕av电影在线播放| 在线观看午夜福利视频| 国产精品久久久av美女十八| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 嫁个100分男人电影在线观看| 啦啦啦免费观看视频1| 久久久久久久久中文| 久久九九热精品免费| 午夜a级毛片| av电影中文网址| 后天国语完整版免费观看| 草草在线视频免费看| 无限看片的www在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久99热这里只有精品18| 中文字幕精品免费在线观看视频| 99精品久久久久人妻精品| 国产一卡二卡三卡精品| 岛国在线观看网站| 亚洲欧美激情综合另类| 免费高清视频大片| 国产精品免费视频内射|