云南漢族人群Tim-3啟動(dòng)子區(qū)-1516G>T位點(diǎn)多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡關(guān)聯(lián)性研究*

高 輝，彭傳梅，付曉野，曹向紅，董玉琳，王 楊(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，昆明 650051)

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云南漢族人群Tim-3啟動(dòng)子區(qū)-1516G>T位點(diǎn)多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡關(guān)聯(lián)性研究*

高 輝，彭傳梅△，付曉野，曹向紅，董玉琳，王 楊(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，昆明 650051)

目的 探討T細(xì)胞免疫球蛋白域和黏蛋白域蛋白(Tim)-3啟動(dòng)子區(qū)-1516G>T位點(diǎn)基因多態(tài)性與云南高原地區(qū)漢族人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的遺傳易感性及其相關(guān)自身抗體的表達(dá)有無關(guān)聯(lián)。方法 采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)方法對(duì)132例云南漢族SLE患者和120例健康體檢者Tim-3啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)-1516G>T的基因多態(tài)性進(jìn)行檢測，同時(shí)采用間接免疫熒光法和線性免疫印跡法檢測其雙鏈DNA抗體、Sm抗體、核糖核蛋白抗體三種自身抗體。采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算基因型和等位基因頻率，進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，基因型和等位基因頻率的組間比較、各自身抗體和基因型的相關(guān)性比較均采用χ2檢驗(yàn)。結(jié)果 云南漢族人群Tim-3啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)-1516G>T的基因型GG、GT、TT在SLE組頻率為：0.818 2、0.181 8、0.000 0，在對(duì)照組頻率為：0.916 7、0.075 0、0.008 3，其基因型和等位基因頻率在兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 云南漢族人群Tim-3啟動(dòng)子區(qū)-1516位點(diǎn)存在單核苷酸多態(tài)性變異，且其多態(tài)性變異與系統(tǒng)性紅斑狼瘡遺傳易感性相關(guān)，但其不同基因型可能不會(huì)影響SLE相關(guān)自身抗體的表達(dá)。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡； T細(xì)胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白-3； 基因多態(tài)性； 遺傳易感性

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種臨床表現(xiàn)多樣、涉及機(jī)體許多系統(tǒng)和臟器的自身免疫性疾病，其發(fā)病率在種族、地區(qū)上差別很大。SLE的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，一般認(rèn)為遺傳、環(huán)境等為其發(fā)病誘因。T細(xì)胞在SLE的發(fā)病過程中扮演重要角色，在其發(fā)病的不同環(huán)節(jié)均存在輔助性T細(xì)胞(Th)1/Th2的不平衡性[1]。T細(xì)胞免疫球蛋白域和黏蛋白域蛋白(Tim)基因家族是Mcintire等[2]于2001年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的基因家族。小鼠Tim家族基因共有8個(gè)成員(Tim 1～8)，人Tim家族基因與小鼠有高度的同源性，在人類Tim家族發(fā)現(xiàn)只有3個(gè)基因，分別為Tim-1、Tim-3和Tim-4，無Tim-2，定位于染色體5q33.2區(qū)域。人Tim-3基因全長約23 kb，包含有7個(gè)外顯子，編碼產(chǎn)物為301個(gè)氨基酸。Monney等[3]用定量RT-PCR方法檢測Tim-3基因在許多細(xì)胞系(Th1、Th2、DCs、B細(xì)胞)以及SJL小鼠的T、B、CD11b+細(xì)胞上的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Tim-3 mRNA只高表達(dá)于Th1細(xì)胞。由此表明Tim-3是重要的免疫調(diào)節(jié)分子，在自身免疫性疾病等Th1/Th2相關(guān)性疾病中發(fā)揮重要作用。國內(nèi)外研究顯示，人類Tim-3的啟動(dòng)子區(qū)和編碼區(qū)均存在多態(tài)性的變化，這些多態(tài)性可能與哮喘、過敏性鼻炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)等疾病的易感性相關(guān)[4-7]。Tim家族基因是否參與SLE的發(fā)生、發(fā)展目前少有報(bào)道。云南地處高原、紫外線輻射較強(qiáng)，為SLE高發(fā)地區(qū)，因此，筆者對(duì)云南高原地區(qū)漢族人群Tim-3啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)-1516G>T的多態(tài)性與SLE以及與SLE相關(guān)自身抗體的關(guān)聯(lián)進(jìn)行研究，為探索SLE易感的遺傳因素提供數(shù)據(jù)支持，為揭示SLE發(fā)病機(jī)制提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年10月至2013年10月在本院風(fēng)濕免疫科就診的SLE患者132例，其中男16例，女116例；年齡18～58歲；SLE患者符合2009年美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)修訂的SLE分類診斷標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組為120例云南地區(qū)健康體檢者，其中男27例，女93例；年齡22～67歲，無自身免疫性疾病相關(guān)病史。所有對(duì)象均為三代以內(nèi)居住在云南本地漢族居民，所有對(duì)象均無血緣關(guān)系。

1.2 儀器與試劑 PCR擴(kuò)增儀(DA7600，China)；電泳儀(Bio-rad，USA)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad，USA)；熒光顯微鏡(Leica，Germany)；測序儀(ABI3730，USA)。人全血基因DNA提取試劑盒(Axygen，USA)；TaqDNA聚合酶1 U(Omega，USA)；dNTPs(Omega，USA)；瓊脂糖(Biowest,Spain)；熒光染料(EB，USA)；熒光免疫印跡試劑盒(Omon，Germany)；測序試劑盒(ABI，USA)。

1.3 方法

1.3.1 自身抗體檢測 在知情同意的原則下，采集SLE患者及健康體檢者乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝靜脈血2 mL。SLE組及對(duì)照組均采用熒光免疫印跡試劑盒(Omon，Germany)檢測三種自身抗體：雙鏈DNA抗體(dsDNA)、Sm抗體、核糖核蛋白(RNP)抗體。

1.3.2 模板DNA提取 采用人全血基因DNA提取試劑盒(Axygen，USA)提取SLE患者及健康體檢者外周血基因組DNA，方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，提取產(chǎn)物溶于TE緩沖液，-20 ℃保存。

1.3.3 PCR反應(yīng) 參照GenBank中Tim-3 DNA序列(編號(hào)AC023133)，利用Primer Premier 5.0軟件自行設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，P1：5′-GCC TTG ACC AAG TTC ATG CT-3′和P2：5′-ACC ACC CCG GAT AAT TTT GT-3′，PCR反應(yīng)體系總體積25 μL：包括基因組DNA 100 ng，10×PCR緩沖液2.5 μL，2.0 mmol/L Mg2+、dNTPs各10 nmol，引物P1和P2各15 pmol，TaqDNA聚合酶1U(Omega，USA)，不足體積用滅菌雙蒸水補(bǔ)充至25 μL。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.3.4 酶切、瓊脂糖電泳 PCR產(chǎn)物用BslⅠ內(nèi)切酶(Omega，USA)酶切：PCR產(chǎn)物5 μL，10×酶切緩沖液1 μL，限制性內(nèi)切酶2 U，滅菌雙蒸水3.9 μL，混勻，55 ℃酶切3 h。酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖電泳、EB染色，觀察條帶。根據(jù)電泳圖確定基因型。

1.3.5 測序 選取部分代表不同基因型的擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生物工程公司測序，驗(yàn)證電泳結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算基因型和等位基因頻率，進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)(P>0.05)，基因型和等位基因的組間比較、各自身抗體和基因型的相關(guān)性比較均采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Tim-3啟動(dòng)子區(qū)-1516G>T位點(diǎn)多態(tài)性采用PCR-RFCP分析，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為404 bp。酶切產(chǎn)物獲得3種基因型，即純合子GG基因型：有338、66 bp 2個(gè)片段；雜合子GT基因型：可見404、338和66 bp 3個(gè)片段；純合子TT基因型：僅有404 bp 1個(gè)片段，見圖1。

注：1為marker；2、4、6為GG基因型；3、5為GT基因型；7為TT基因型；8為PCR產(chǎn)物。

2.2 基因型測序分析圖 Tim-3基因啟動(dòng)子-1516G>T位點(diǎn)GG、GT、TT 基因型測序分析圖，見圖2。

注：(a)GG基因型；(b)GT基因型；(c)TT基因型。

2.3 基因型與等位基因頻率分布 根據(jù)PCR產(chǎn)物酶切電泳結(jié)果，記錄各樣本的基因型，并采用直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)基因型，計(jì)算等位基因頻率。SLE組和對(duì)照組-1516G>T位點(diǎn)基因型頻數(shù)分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)，達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性，見表1。χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，SLE組與對(duì)照組-1516G>T位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1 Tim-3基因-1516G/T位點(diǎn)基因型頻數(shù)分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

2.4 三種SLE相關(guān)自身抗體(雙鏈DNA抗體、Sm抗體、RNP抗體) 檢測結(jié)果表明，SLE組三種自身抗體檢測陽性率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。SLE組各基因型三種自身抗體檢測結(jié)果，見表4。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，SLE組中雙鏈DNA抗體、Sm抗體、RNP抗體檢測陽性率與Tim-3基因啟動(dòng)子-1516G>T位點(diǎn)基因分型均無相關(guān)性(P>0.05)，見表4。

表2 Tim-3基因-1516G/T位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布[n(%)]

表3 2組三種自身抗體檢測陽性率比較(%)

表4 SLE組各基因型中三種自身抗體檢測結(jié)果[n(%)]

3 討 論

人類基因組單核苷酸多態(tài)性是基因組變異中最常見的一種形式，在人類基因組中大概每1 000個(gè)堿基就有1個(gè)SNP。不同人群之所以對(duì)疾病的易感程度有所區(qū)別、同種疾病的臨床表型不同以及對(duì)藥物會(huì)產(chǎn)生不同反應(yīng)，部分受到SNP的影響。SNP作為第3代遺傳標(biāo)記，在復(fù)雜疾病的基因定位、關(guān)聯(lián)分析、個(gè)體疾病易感性分析、同種疾病臨床表型分析以及藥物基因組學(xué)的研究中發(fā)揮著越來越重要的作用。許多研究均表明，Tim基因遺傳多態(tài)性與多種自身免疫性疾病和過敏性疾病的易感性、臨床表型有著密切的關(guān)系，且不同種族、不同地區(qū)之間由于遺傳特征不同導(dǎo)致多態(tài)性變異亦不同，但Tim基因多態(tài)性與SLE的關(guān)聯(lián)研究尚處于起步階段[8-10]。

本研究通過PCR-RFLP技術(shù)對(duì)132例SLE患者和120例健康人群Tim-3啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)-1516G>T的多態(tài)性進(jìn)行分析。SLE組與對(duì)照組-1516G>T基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。兩組間基因型及等位基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明云南漢族人群Tim-3啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)-1516G>T的多態(tài)性與SLE的遺傳易感性相關(guān)。

在SLE眾多相關(guān)自身抗體中，雙鏈DNA抗體、Sm抗體、RNP抗體三種抗體的檢測意義尤為明顯，其可能與疾病發(fā)病機(jī)制、疾病嚴(yán)重程度等密切相關(guān)[11]。本研究也發(fā)現(xiàn)，SLE組三種自身抗體檢測陽性率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞因子基因編碼區(qū)的多態(tài)性可以通過抑制與特異性細(xì)胞因子受體的結(jié)合、啟動(dòng)靶細(xì)胞或靶分子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和二級(jí)信號(hào)通路，從而影響其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和表達(dá)。相應(yīng)地，這些變異也能夠影響自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致自身免疫性疾病不同的病情嚴(yán)重程度以及自身抗體水平的差異，因此筆者分析了SLE三種自身抗體檢測陽性率與Tim-3基因啟動(dòng)子區(qū)-1516G>T位點(diǎn)基因分型的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)三種自身抗體檢測陽性率與Tim-3基因啟動(dòng)子區(qū)-1516G>T位點(diǎn)基因分型均無明顯相關(guān)性，提示Tim-3基因-1516G>T位點(diǎn)不同基因型可能不會(huì)影響SLE相關(guān)自身抗體的表達(dá)，但其對(duì)Tim-3基因表達(dá)水平的影響及SLE疾病嚴(yán)重程度的影響尚有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

[1]周廣宇,楊永凈.系統(tǒng)性紅斑狼瘡中T細(xì)胞作用的研究進(jìn)展[J].國際免疫學(xué)雜志,2005,28(5):274-277.

[2]Mcintire JJ,Umetsu SE,Akbari O,et al.Identification of Tapr(an airway hyperreactivity regulatory locus) and the linked Tim gene family[J].Nat Immunol,2001,2(12):1109-1116.

[3]Monney L,Sabatos CA,Gaglia JL,et al.Th1-specific cell surface protein Tim-3 regulates macrophage activation and severity of an autoimmune disease[J].Nature,2002,415(6871):536-541.

[4]Du WT,Zhao HF,Xu JH,et al.The role of T-cell immunoglobulin and mucin-domain-containing molecule-3 polymorphisms in idiopathic thrombocytopenic purpura[J].Hum Immunol,2009,70(6):398-402.

[5]Xu J,Yang Y,Liu X,et al.The -1541 C>T and +4259 G>T of TIM-3 polymorphisms are associated with rheumatoid arthritis susceptibility in a Chinese Hui population[J].Int J Immunogenet,2011,38(6):513-518.

[6]Yang S,Chen W,Dun H,et al.The relationship between polymorphisms in the promoter region of Tim-3 and unexplained recurrent spontaneous abortion in Han Chinese women[J].Reprod Biol Endocrinol,2013,11(11):104-111.

[7]Liao JY,Zhang Q,Liao Y,et al.Association of T-Cell immunoglobulin and mucin domain-containing molecule 3 (Tim-3) polymorphisms with susceptibility and disease progression of HBV infection[J].PloS One,2014,9(5):e98280-98287.

[8]王燕,劉志連,孫捷,等.新疆維吾爾族和漢族人群Tim-3啟動(dòng)子區(qū)rs6555849位點(diǎn)多態(tài)性與變應(yīng)性鼻炎的相關(guān)性研究[J].中華鼻咽喉頭頸外科,2011,46(9):712-717.

[9]Munoz-Valle JF,Valley Y,Padilla-Gutierrez JR,et al.The +49A>G CTLA-4 polymorphisms is associated with rheumatoid arthritis in Mexican population[J].Clin Chim Acta,2010,411(9/10):725-728.

[10]Wu Q,Hu L,Cai P,et al.Association analysis of Tim-1 -232G>A and 5383-5397 insertion/deletion polymorphisms with childhood asthma and total serum immunoglobulin E levels in middle China[J].J Investig Allergol Clin Immunol,2009,19(2):146-153.

[11]李俊,羅嬌,徐巍,等.多種自身抗體聯(lián)合檢測對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷價(jià)值及意義[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2010,39(4):390-394.

Association analysis of Tim-3 -1516G>T polymorphism with systemic lupus erythematosus in a han population of Yunnan Province*

GAOHui,PENGChuan-mei△,FUXiao-ye,CAOXiang-hong，DONGYu-lin，WANGYang

(DepartmentofMedicalLaboratory,TheAffiliatedYananHospitalofKunmingMedicalUniversity,YunnanKunming650051,China)

Objective The aim of the present study was to analyze the association between the Tim-3 polymorphism -1516G>T and susceptibility to systemic lupus erythematosus(SLE) in a group of Han population from Yunnan province.Methods Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis(PCR-RFLP) was used to detect the polymorphism of -1516G>T site in 132 SLE patients and 120 controls.and we used indirect immunofluorescence assay and liner immunoblotting to detect three related aotuantibodies of SLE,which include the anti-double stranded DNA(dsDNA)antibody,the anti-Sm antibody and the anti-RNP antibody.We used direct counting method to calculate the genotype and allele frequencies to conduct the Hardy-Weinberg equilibrium test,and we used χ2test to compare the difference of the genotypic and allelic frequencies between SLE and control groups and the correlation of autoantibodies and genotypes.Results We found there are statistically significant differences in genotype and allele frequency of -1516G>T between SLE and control group(P<0.05);The genotype(GG,GT,TT)frequency in the SLE group is 0.818 2,0.181 8 and 0.000 0,which in the control group is 0.916 7,0.075 0 and 0.008 3 respectively.Conclusion The -1516 site of Tim-3 gene has SNP variations，the -1516G>T genotype maybe related with the susceptibility to SLE in a Han population of Yunnan province,but different genotypes may not affect the expression of related autoantibodies of SLE.

SLE； Tim-3； gene polymorphism； susceptibility

云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項(xiàng)項(xiàng)目(2011FB232)。

高輝，女，主任醫(yī)師，碩士，主要從事臨床血液學(xué)檢驗(yàn)和分子生物學(xué)檢驗(yàn)方面的研究。△

，E-mail：meizimh@sina.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.004

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1672-9455(2015)08-1034-03

2014-11-05

2015-01-12)