宮頸脫落細(xì)胞DKK-3基因甲基化在宮頸癌中的意義

胡 玲，姜 玲，胡 姣，張 婧(.武漢市青山區(qū)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科 430080；2.湖北省襄陽市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科 4402)

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·臨床研究·

宮頸脫落細(xì)胞DKK-3基因甲基化在宮頸癌中的意義

胡 玲1，姜 玲1，胡 姣1，張 婧2△(1.武漢市青山區(qū)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科 430080；2.湖北省襄陽市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科 441021)

目的 檢測宮頸脫落細(xì)胞Dickkopf相關(guān)蛋白3(DKK-3)基因啟動子甲基化并研究其在宮頸癌中的臨床意義。方法 選擇宮頸癌患者(CER組)和健康女性(CON組)為研究對象，采用甲基化特異性PCR(MSP)檢測兩組研究對象宮頸脫落細(xì)胞DKK-3基因啟動子甲基化，比較DKK-3基因啟動子甲基化率在不同臨床病理因素中的差異。結(jié)果 CER組宮頸癌患者宮頸脫落細(xì)胞DKK-3基因啟動子甲基化率明顯高于CON組健康女性(53.8%vs. 0.0%，P<0.01)。CER組宮頸癌患者宮頸脫落細(xì)胞DKK-3基因啟動子甲基化率在HPV感染、組織學(xué)分級、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO) 分期中的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，有HPV感染、組織學(xué)分級高、腫瘤最大徑大于或等于4 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和FIGO分期晚的宮頸癌患者DKK-3基因啟動子甲基化率明顯高于無HPV感染、組織學(xué)分級低、腫瘤最大徑小于4 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和FIGO分期早的患者。結(jié)論 宮頸癌患者宮頸脫落細(xì)胞DKK-3基因啟動子甲基化與HPV感染、組織學(xué)分級、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和FIGO分期有關(guān)，可用于評估宮頸癌的病情嚴(yán)重程度和預(yù)后。

宮頸癌； DKK-3； 甲基化

目前對宮頸癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，研究表明其與抑癌基因的甲基化沉默有關(guān)，這些基因的甲基化率與宮頸癌的病程嚴(yán)重程度和預(yù)后緊密相關(guān)[1-2]。Dickkopf相關(guān)蛋白3(DKK-3)是新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，其甲基化沉默時導(dǎo)致失去對細(xì)胞周期的調(diào)控而發(fā)生癌變，與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展與轉(zhuǎn)歸緊密相關(guān)[3]。研究表明，在宮頸癌組織中可檢測到DKK-3高甲基化狀態(tài)[4]。本研究檢測宮頸癌患者宮頸脫落細(xì)胞DKK-3基因啟動子甲基化狀態(tài)，研究宮頸脫落細(xì)胞DKK-3基因啟動子甲基化在宮頸癌中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年1月至2014年1月診治的宮頸癌患者為研究對象(CER組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)初治患者，既往未行化療及手術(shù)治療；(2)經(jīng)臨床表現(xiàn)、體格檢查、影像學(xué)及病理組織學(xué)檢查確診；(3)排除合并嚴(yán)重心腦肺及其他腫瘤患者。共納入65例研究對象，平均年齡(47.3±6.5)歲；病理類型為鱗狀細(xì)胞癌48例，腺癌11例，腺鱗癌6例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO) (2009年)宮頸癌分期包括Ⅰ期10例，Ⅱ期28例，Ⅲ期17例，Ⅳ期10例。另以同期50例健康女性為對照(CON組)，平均年齡(47.5±7.1)歲。CER組和CON組研究對象年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 材料與試劑 宮頸脫落細(xì)胞獲?。簩m頸刷在子宮頸外口與頸管交界處刷轉(zhuǎn)，收集子宮頸脫落細(xì)胞，然后將宮頸涂片取樣器放入裝有特殊溶液的試管中，輕輕搖動，使取樣器上的細(xì)胞標(biāo)本洗脫在溶液中。DNA提取試劑購自寶生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；甲基化檢測購于北京天漠公司。

1.3 DKK-3基因啟動子甲基化檢測 根據(jù)DNA提取試劑操作說明提取CER組和CON組宮頸脫落細(xì)胞總DNA。采用MSP法檢測DKK-3基因啟動子甲基化，引物序列參考Ding等[5]文獻(xiàn)報道序列。PCR反應(yīng)體系為25 μL，循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性1 min，63 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后檢測。

2 結(jié) 果

2.1 DKK-3基因啟動子甲基化 CER組65例宮頸癌患者宮頸脫落細(xì)胞檢測到35例呈甲基化狀態(tài)，甲基化率為53.8%，CON組50例健康女性中均未檢測到甲基化狀態(tài)，甲基化率為0.0%，CER組宮頸癌患者宮頸脫落細(xì)胞DKK-3基因甲基化率明顯高于CON組健康女性(χ2=36.200，P<0.01)。

2.2 DKK-3基因啟動子甲基化與臨床病理因素的關(guān)系 CER組宮頸癌患者的宮頸脫落細(xì)胞DKK-3基因啟動子甲基化率在年齡和病理類型中的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，在HPV感染、組織學(xué)分級、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和FIGO分期中的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，有HPV感染、組織學(xué)分級高、腫瘤最大徑大于或等于4 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、FIGO分期晚的宮頸癌患者DKK-3基因啟動子甲基化率明顯高于無HPV感染、組織學(xué)分級低、腫瘤最大徑小于4 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和FIGO分期早的患者。結(jié)果見表1。

表1 CER組宮頸脫落細(xì)胞DKK-3基因啟動子甲基化與臨床病理因素關(guān)系

續(xù)表1 CER組宮頸脫落細(xì)胞DKK-3基因啟動子甲基化與臨床病理因素關(guān)系

3 討 論

基因甲基化是表觀遺傳學(xué)中與堿基突變無關(guān)的轉(zhuǎn)錄前基因調(diào)控機(jī)制，甲基化CG結(jié)合甲基結(jié)合蛋白或自身結(jié)構(gòu)可阻遏轉(zhuǎn)錄因子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物從而調(diào)控基因表達(dá)，而基因甲基化主要集中在含CpG島的基因啟動子區(qū)域[6]。研究表明，抑癌基因啟動子甲基化沉默導(dǎo)致其失去對正常細(xì)胞增殖的調(diào)控而發(fā)生癌變，與腫瘤的發(fā)病機(jī)制、轉(zhuǎn)歸及預(yù)后密切相關(guān)，越來越多的研究表明抑癌基因啟動子甲基化可用于腫瘤的病情及預(yù)后評估[7-8]。DKK-3基因?qū)儆贒KK家族，為Wnt信號傳導(dǎo)通路的抑制因子，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡和調(diào)控腫瘤血管產(chǎn)生的功能，在消化系統(tǒng)腫瘤和呼吸系統(tǒng)腫瘤等可檢測到其處于甲基化狀態(tài)，且其甲基化率可反映病情嚴(yán)重程度和預(yù)后[9]。目前對宮頸癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，研究表明其與抑癌基因的甲基化失活有關(guān)，隨著研究的不斷深入，越來越多的基因被發(fā)現(xiàn)參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展[10]。研究表明，宮頸癌組織中可檢測到DKK-3基因啟動子甲基化狀態(tài)，其甲基化率明顯高于正常組織[4]，因?qū)m頸脫落細(xì)胞篩查宮頸癌較宮頸切除組織病理學(xué)更方便、快捷，檢測宮頸脫落細(xì)胞DKK-3基因甲基化狀態(tài)對宮頸癌的篩查更有臨床價值。本研究表明宮頸癌患者宮頸脫落細(xì)胞DKK-3基因啟動子甲基化率明顯高于健康女性，證實DKK-3基因甲基化在宮頸癌發(fā)病機(jī)制中的作用。

目前公認(rèn)的宮頸癌病情及預(yù)后的決定因素為組織學(xué)分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和FIGO分期，組織分化程度低、腫瘤越大、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和FIGO分期晚的患者其生存期越差，此外，研究表明宮頸癌患者的生存質(zhì)量同樣與這些因素密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者的宮頸脫落細(xì)胞DKK-3基因啟動子甲基化率在HPV感染、組織學(xué)分級、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和FIGO分期中的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，有HPV感染、組織學(xué)分級高、腫瘤最大徑大于或等于4 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、FIGO分期晚的宮頸癌患者DKK-3基因啟動子甲基化率明顯高于無HPV感染、組織學(xué)分級低、腫瘤最大徑小于4 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和FIGO分期早的患者。這些證據(jù)表明，與宮頸癌術(shù)后切除病理組織一樣，宮頸脫落細(xì)胞DKK-3基因啟動子甲基化與宮頸癌的病情及預(yù)后緊密相關(guān)，可作為其病情及預(yù)后評估的標(biāo)志物。宮頸脫落細(xì)胞篩查宮頸癌較傳統(tǒng)的宮頸活檢更具有臨床價值，同時可在術(shù)前提供客觀證據(jù)，這點(diǎn)是傳統(tǒng)的病理組織學(xué)無法企及的。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.01.045

A

1672-9455(2015)01-0110-02

2014-04-22

2014-07-12)

△通訊作者，E-mail：mirror1219@sohu.com。