微量肉湯稀釋法檢測(cè)中藥香囊揮發(fā)油對(duì)5種呼吸道致病菌抗菌作用*

陳奕雯,陳 華,許愛萍(湖北省武漢市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科 430014)

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·臨床研究·

微量肉湯稀釋法檢測(cè)中藥香囊揮發(fā)油對(duì)5種呼吸道致病菌抗菌作用*

陳奕雯,陳 華△,許愛萍(湖北省武漢市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科 430014)

目的 探討中藥香囊提取揮發(fā)油在體外對(duì)5種呼吸道常見致病菌的抗菌作用。 方法 采用微量肉湯稀釋法測(cè)定中藥香囊揮發(fā)油對(duì)肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的最小抑菌濃度值和臨床分離菌株最小抑菌濃度范圍。結(jié)果 揮發(fā)油對(duì)以上5種菌標(biāo)準(zhǔn)菌株最低抑菌濃度值分別為小于或等于0.000 15、0.000 125、0.001 25、0.001 45、>0.08，對(duì)臨床分離菌最低抑菌濃度范圍分別為小于或等于0.000 15、0.000 25～0.000 145、0.002 5～0.000 625、0.002 5～0.001 25、>0.08。結(jié)論 除銅綠假單胞菌外，中藥香囊揮發(fā)油對(duì)肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌均有較好的抗菌效果。

中藥香囊揮發(fā)油； 體外抗菌作用； 微量肉湯稀釋法

呼吸道感染是人類最常見的傳染病之一，預(yù)防和治療呼吸道感染一直是全球關(guān)注的熱點(diǎn)，現(xiàn)代中醫(yī)通過狀態(tài)調(diào)治以消除異常病理狀態(tài)，恢復(fù)正常健康狀態(tài)，這種在長(zhǎng)期醫(yī)學(xué)實(shí)踐中形成的獨(dú)具特色的醫(yī)學(xué)體系，在治未病方面有潛在的優(yōu)勢(shì)[1-3]。本院將廣藿香、丁香、檀香等具有抑菌作用和薄荷腦、艾葉等有祛風(fēng)散寒作用的藥材制作成中藥香囊，通過讓患者長(zhǎng)期佩戴改善患者基礎(chǔ)健康狀態(tài)，同時(shí)通過抑制人體的潛在病原體過度繁殖達(dá)到預(yù)防呼吸道感染、治未病的作用。本實(shí)驗(yàn)參照美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)的藥敏執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)M45-A2、M07-A8、M100-S20對(duì)本院中藥香囊揮發(fā)油進(jìn)行藥敏測(cè)試，研究其抗菌效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)臨床菌株來源與鑒定 選用的臨床菌株有金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌各20株。它們均來自本院門診及病房送檢的呼吸道標(biāo)本中分離并經(jīng)過BD-phenix100全自動(dòng)微生物分析儀鑒定及藥敏試驗(yàn)，將其純培養(yǎng)后存于30%甘油肉湯管或脫脂牛奶管中-20 ℃冰箱備用。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC29213金黃色葡萄球菌、ATCC25922大腸埃希菌、ATCC49619肺炎鏈球菌、ATCC27853銅綠假單孢菌、ATCC700603肺炎克雷伯菌購自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.3 中藥材 艾葉200 g、白豆蔻200 g、丁香60 g、檀香100 g、山奈200 g、小茴香100 g、蒼術(shù)100 g、廣藿香150 g、 薄荷腦50 g、肉桂60 g，由武漢市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)基地提供，取各中藥的藥材，適當(dāng)粉碎，按2010版《中國(guó)藥典》[4]附錄XD的方法提取揮發(fā)油，經(jīng)無水硫酸鈉脫水加入揮發(fā)油融化，密封保存，備用。

1.4 試劑及培養(yǎng)基 十二烷基硫酸鈉(分析純)，武漢醫(yī)藥公司進(jìn)口分裝；生理鹽水(0.9%氯化鈉注射液)，武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，產(chǎn)品批號(hào)：121004907； MHB肉湯培養(yǎng)基，購自杭州天和微生物試劑公司；MHA營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，購自杭州天和微生物試劑公司；脫干凍纖維羊血，購自杭州天和微生物試劑公司。

1.5 儀器與設(shè)備 中草藥粉碎機(jī)、揮發(fā)油提取裝置、HH-S型水浴鍋、超凈工作臺(tái)、電熱蒸氣消毒器、手動(dòng)(可調(diào)試)移液槍、96孔滅菌酶標(biāo)板購自美國(guó)Costar公司、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、冰箱、超純水制造系統(tǒng)等。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組 參照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)M45-A2《苛養(yǎng)菌的稀釋法抗菌藥物敏感試驗(yàn)參考方法》[3]； M07-A8《需氧菌的稀釋法抗菌藥物敏感試驗(yàn)參考方法》[3]；M100-S20《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》[3]對(duì)中藥香囊揮發(fā)油進(jìn)行最低抑菌濃度檢測(cè),分為標(biāo)準(zhǔn)菌株組和臨床分離組。標(biāo)準(zhǔn)菌株組：測(cè)試揮發(fā)油乳液對(duì)5種呼吸道細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(模式種)的MIC值，保證實(shí)驗(yàn)濃度和結(jié)果的可行性。臨床分離組：測(cè)試揮發(fā)油乳液對(duì)臨床呼吸道標(biāo)本分離的不同耐藥性菌株的MIC值，評(píng)價(jià)揮發(fā)油體外抗菌的效果。

1.7 方法

1.7.1 揮發(fā)油乳液存儲(chǔ)液的制備 取十二烷基硫酸鈉0.1 g，加生理鹽水100 mL溶解，制成0.1%十二烷基硫酸鈉溶液；取溶液21 mL，加中藥香囊揮發(fā)油原液4 mL,攪拌使其充分乳化，揮發(fā)油乳液儲(chǔ)存液濃度為最高試驗(yàn)濃度的10倍，即0.16 U·mL-1。

1.7.2 微量揮發(fā)油藥敏板的制備 取無菌96孔酶標(biāo)板,在每列第1孔加入0.1%十二烷基硫酸鈉溶液50 μL為陰性對(duì)照，第2孔只加入菌液為陽性對(duì)照，第3孔加入中藥香囊揮發(fā)油原液100 μL,第4～12孔 加0.1%十二烷基硫酸鈉溶液50 μL。 從第3孔吸取50 μL藥液加入第4孔,充分混勻后吸取50 μL加入第5孔,依次做倍比稀釋至第12孔,第12孔的藥液混勻后吸取50 μL棄去。配置好的藥敏板每列為一株受試菌的梯度，從第3孔至第12孔加入菌液后最終藥物濃度由高到低為0.08～0.001 56 U·mL-1。

1.7.3 試驗(yàn)菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株菌液的制備 肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌的試驗(yàn)菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株用無菌接種環(huán)從脫脂牛奶管或30%甘油肉湯管中刮取菌液到血平板，35 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)18～24 h后，從血平板中挑選2～3個(gè)菌落在生理鹽水中制成0.5麥?zhǔn)蠁挝粦乙?，其濃度?1～2)×108cfu·mL-1。

1.7.4 試驗(yàn)菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株接種

1.7.4.1 將肺炎鏈球菌外的試驗(yàn)菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株0.5麥?zhǔn)蠁挝粦乙喝?0 μL加入5 mL的MHB肉湯培養(yǎng)基中制成接種液，取已加入揮發(fā)油乳液的96孔酶標(biāo)板每株菌接種一行2～12孔接種50 μL，使其最終試驗(yàn)菌每孔濃度大約是5×105cfu·mL-1，放35 ℃環(huán)境中培養(yǎng)24 h。

1.7.4.2 肺炎鏈球菌的試驗(yàn)菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株0.5麥?zhǔn)蠁挝粦乙喝?0 μL加入5 mL的MHB肉湯+5%脫脂纖維羊血培養(yǎng)基中制成0.5麥?zhǔn)蠁挝粦乙?，取已加入揮發(fā)油乳液的96孔酶標(biāo)板每株菌接種一行2～12孔接種50 μL，其最終試驗(yàn)菌每孔濃度大約是5×105cfu·mL-1，放35 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h。

1.7.5 最低抑菌濃度(MIC)值判讀 肉眼觀察培養(yǎng)液澄清的為陰性(即無細(xì)菌生長(zhǎng))，培養(yǎng)液混濁的為陽性(即有細(xì)菌生長(zhǎng))。并且用多點(diǎn)接種裝置接種到血平板培養(yǎng)24 h，觀察有無菌落生長(zhǎng)以驗(yàn)證是否無菌生長(zhǎng)。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株組結(jié)果 香囊揮發(fā)油對(duì)5種實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株(金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸埃希菌ATCC25922、肺炎鏈球菌ATCC49619、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC700603)的MIC值檢測(cè)結(jié)果見表1。除銅綠假單胞菌外，香囊揮發(fā)油對(duì)試驗(yàn)菌株的標(biāo)準(zhǔn)菌株均有抑制效果，實(shí)驗(yàn)的揮發(fā)油濃度范圍合理，實(shí)驗(yàn)可以繼續(xù)進(jìn)行。

2.2 臨床分離組結(jié)果 香囊揮發(fā)油對(duì)20株臨床分離得到肺炎鏈球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌抑制率分別為100%、90%、95%、60%(MIC范圍分別為(MIC≤0.000 15、0.002 5～0.000 625、0.002 5～0.001 25、0.000 25～0.000 145)，對(duì)20株臨床分離的銅綠假單胞菌無抑制效果(MIC>0.08)，結(jié)果見表2、3。

表1 中藥香囊揮發(fā)油對(duì)5種標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌效果

注：+為細(xì)菌為生長(zhǎng)，-為無細(xì)菌生長(zhǎng)。

表2 中藥香囊揮發(fā)油對(duì)臨床分離的試驗(yàn)菌株的抑菌效果

注：+為細(xì)菌為生長(zhǎng)，-為無細(xì)菌生長(zhǎng)。

表3 不同濃度的中藥香囊揮發(fā)油對(duì)5種不同細(xì)菌的耐藥菌株數(shù)量

3 討 論

呼吸道感染多發(fā)于冬春季節(jié)，散發(fā)，且可在氣候突變時(shí)小規(guī)模流行。呼吸道感染20%～30%為細(xì)菌引起，可單純發(fā)生或繼發(fā)于病毒感染之后，以肺炎鏈球菌、葡萄球菌等口腔定植菌多見，也常見肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌等革蘭陰性菌，但接觸病原體后是否發(fā)病，取決于傳播途徑和人群易感性。淋雨、受涼、氣候突變、過度勞累等可降低呼吸道局部防御功能，使原攜帶的病毒或細(xì)菌迅速繁殖，同時(shí)作為一些易感人群，老年、體弱免疫功能低下或有慢性呼吸道疾病者更易發(fā)病[4]。傳統(tǒng)的處理措施是在出現(xiàn)呼吸道癥狀后予以藥物治療，但往往因已過細(xì)菌潛伏期，發(fā)病時(shí)間較長(zhǎng)使得應(yīng)用抗菌藥物事倍功半，對(duì)于年老、體弱等免疫力低下人群更是危害性較大。尋求一種安全、簡(jiǎn)便的方法進(jìn)行有效地預(yù)防呼吸道疾病發(fā)生，使在治未病方面取得良好的效果，是目前老年化社會(huì)亟待解決的一個(gè)醫(yī)學(xué)問題。

目前已有較多研究證明中藥對(duì)細(xì)菌或耐藥菌有良好的抗菌作用[5]。文獻(xiàn)報(bào)道廣藿香水提物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、銅綠假單胞菌、腸炎球菌、產(chǎn)氣桿菌有明顯抑制效應(yīng)[6]。中藥丁香具有較強(qiáng)的抗菌消炎作用，張軍鋒等[7]報(bào)道丁香對(duì)金黃色葡萄球菌、腸炎球菌、肺炎鏈球菌、痢疾桿菌、銅綠假單胞菌等具有明顯的抗菌作用，同時(shí)還具有明顯的鎮(zhèn)咳、祛痰作用，因而對(duì)呼吸道感染具有良好的防治作用。而檀香具有良好的抗菌和抗氧化成分，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用[8]。由此可見,以上3種中藥對(duì)常見的呼吸道細(xì)菌均有良好的抑制作用,因此本院將廣藿香、丁香、檀香3種具有抑菌效果的中藥和薄荷腦、艾葉等有祛風(fēng)散寒作用的藥材制作成中藥香囊，研究其抗菌活性，以期對(duì)免疫功能低下等特殊人群起著良好的治未病功效。

本實(shí)驗(yàn)中本院中藥香囊的揮發(fā)油對(duì)常見呼吸道致病菌有較好的抑制效果，特別是社區(qū)人群容易感染的肺炎鏈球菌，本實(shí)驗(yàn)中20株臨床分離菌在MIC≤0.00015的濃度，可全部抑制，對(duì)其他常見菌如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌也有較好的抑制效果，抑制率分別達(dá)到90%、95%、60%，如果患者在日常生活中長(zhǎng)期佩戴中藥香囊，能對(duì)人體攜帶的潛在的呼吸道致病菌(肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌)有一定抑制作用，控制了潛在致病菌的過度繁殖，能達(dá)到防治呼吸道感染的效果。此次實(shí)驗(yàn)中中藥香囊揮發(fā)油對(duì)銅綠假單胞菌沒有抑菌效果，這和既往文獻(xiàn)報(bào)道有所矛盾，分析其原因可能是由于選取適應(yīng)其他4種致病菌的揮發(fā)油濃度不足以抑制銅綠假單胞菌，并且銅綠假單胞菌的耐藥基因多，機(jī)制較復(fù)雜，因此幾種抗菌藥物如何進(jìn)行合適比例的配伍以發(fā)揮更好的療效是未來進(jìn)一步研究的方向。

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湖北省武漢市衛(wèi)生局臨床醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(WZ11B02)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.01.033

A

1672-9455(2015)01-0085-02

2014-04-22

2014-09-10)

△通訊作者，E-mail:769491105@qq.com。