原發(fā)性膜性腎病患者外周血淋巴細胞亞群的變化及其與蛋白尿的關系

馬東紅,郭明好,許清玉,劉 云,劉向東,劉 麗(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎內科，河南新鄉(xiāng) 453100)

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·論 著·

原發(fā)性膜性腎病患者外周血淋巴細胞亞群的變化及其與蛋白尿的關系

馬東紅,郭明好,許清玉,劉 云,劉向東,劉 麗(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎內科，河南新鄉(xiāng) 453100)

目的 分析原發(fā)性膜性腎病(PMN)患者外周血淋巴細胞亞群的變化及其與蛋白尿的關系。方法 選取新鄉(xiāng)醫(yī)學院一附院腎內科確診的PMN患者40例，收集其詳細臨床資料，并留取外周血應用流式細胞儀測定淋巴細胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD16+CD56+、CD19+)，同時選取20例健康志愿者作為健康對照組，比較PMN患者外周血淋巴細胞亞群與健康對照組的差別。根據(jù)患者尿蛋白水平，將PMN患者分為大量蛋白尿組(尿蛋白定量大于或等于3.5 g/d)及非大量蛋白尿組(尿蛋白定量小于3.5 g/d)，分析兩組患者上述淋巴細胞亞群水平的差異及其可能的臨床意義。結果 (1)和健康對照組相比，PMN患者外周血CD4+細胞計數(shù)有升高趨勢(51.83±6.80vs. 43.5±5.65，P>0.05)，CD8+細胞計數(shù)有降低趨勢(28.83±5.60vs. 35.33±5.00，P>0.05)，而 CD4+/CD8+比值較健康對照組明顯升高(1.86±0.43vs. 1.27±0.33，P<0.01)。與健康對照組比較，PMN患者外周血CD16+56+細胞計數(shù)無明顯差異，而CD19+細胞計數(shù)明顯升高(8.00±2.76vs. 7.33±2.66，P<0.01)。(2)和非大量蛋白尿組相比，大量蛋白尿組CD19+細胞計數(shù)明顯高升高(9.80±3.19vs. 7.10±2.23，P<0.01)，而CD4+細胞、CD8+細胞計數(shù)、CD4+/CD8+比值兩者間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 PMN患者表現(xiàn)出明顯的B淋巴細胞異常和CD4+/CD8+細胞比值的偏移，且B淋巴細胞異常程度與蛋白尿量有關，因此，監(jiān)測PMN患者淋巴細胞亞群變化有助于評估病情、指導治療。

原發(fā)性膜性腎病； 淋巴細胞亞群； 蛋白尿

原發(fā)性膜性腎病(PMN)是腎病綜合征的病理類型之一，近年來其發(fā)病率逐漸增高。PMN的發(fā)病機制目前尚不完全清楚[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，和對照組相比，PMN患者體內存在嚴重的淋巴細胞異常[2-3]。PMN患者外周血淋巴細胞亞群的變化及其與蛋白尿的關系目前尚未見報道。本文對40例PMN患者外周血淋巴細胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD16+56+、CD19+)水平進行分析，同時分析不同尿蛋白定量與淋巴細胞亞群的關系，探討患者臨床表現(xiàn)與機體免疫狀態(tài)之間的可能聯(lián)系，有望為PMN患者的治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 PMN患者的納入標準 (1)年齡大于或等于18歲，性別不限；(2)腎活檢報告為膜性腎?。?3)排除了自身免疫、腫瘤、感染等繼發(fā)性疾?。?4)血肌酐水平小于133 μmol/L；(5)近3月內未使用過糖皮質激素及環(huán)磷酰胺、他克莫司、霉酚酸酯、環(huán)孢素等免疫抑制劑。

1.2 研究對象 選擇2011年8月至2013年10月在新鄉(xiāng)醫(yī)學院一附院腎內科住院的PMN患者40例，其中男24例，女16例，平均年齡(49.9±13.8)歲。同時選取健康人20例作為健康對照組，其中男8例，女12例，年齡17～58歲。PMN患者再根據(jù)24 h尿蛋白定量的水平，將其分為兩組，即大量蛋白尿組(Upro≥3.5 g/d)和非大量蛋白尿組(Upro<3.5 g/d)進行亞組分析。

1.3 標本留取 PMN患者和健康對照組均于空腹采集靜脈血8～20 mL，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)抗凝。

1.4 淋巴細胞亞群的測定 取100 μL EDTA抗凝全血加入流式專用管中，再分別加入鼠抗人CD3、CD4、CD8、CD16、CD19、CD56熒光標記的單克隆抗體各20 μL，每種抗體均做一管相應的同型對照，充分混勻，4 ℃避光孵育15 min。孵育結束后，加入1 mL預冷的0.1% BSA/PBS緩沖液，1 500 r/min，離心5 min，離心結束后，棄去上清液，用剩余的100 μL左右液體重懸細胞。再次加入預冷的0.1% BSA/PBS緩沖液，1 500 r/min，離心5 min，離心結束后，棄去上清液，加入400 μL 的1%多聚甲醛固定液4℃避光保存，24 h內上機檢測。上述制備的標本使用美國BD公司 FACSCalibur流式細胞儀進行檢測，結果采用CellQuest軟件進行分析。以外周血淋巴細胞設門，分別計算CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD16+56+和CD19+細胞在外周血淋巴細胞中的計數(shù)。

2 結 果

2.1 PMN患者外周血淋巴細胞亞群的變化 和健康對照組組相比，PMN患者外周血CD3+細胞計數(shù)輕度降低(78.67±4.13vs. 80.33±3.67，P>0.05)，CD4+細胞計數(shù)輕度升高(51.83±6.80vs. 43.5±5.65，P>0.05)，CD8+細胞計數(shù)輕度降低(28.83±5.60vs. 35.33±5.00，P>0.05)，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但PMN患者CD4+/CD8+比值較健康對照組明顯升高(1.86±0.43vs. 1.27±0.33，P<0.01)。見表1。

2.2 PMN患者淋巴細胞亞群的變化與患者尿蛋白的關系 對PMN患者進行了亞組分析，結果顯示，大量蛋白尿組和非大量蛋白尿組相比，CD3+細胞計數(shù)(77.8±5.35vs. 82.3±5.46，P>0.05)、CD4+細胞計數(shù)(37.6±4.33vs. 40.2±7.64，P>0.05)、CD8+細胞計數(shù)(46.4±6.00vs. 43.8±5.80，P>0.05)及CD4+/CD8+比值(1.25±0.20vs. 1.13±0.31，P>0.05)均差異無統(tǒng)計學意義。和非大量蛋白尿組相比，大量蛋白尿組患者血CD19+細胞計數(shù)明顯升高，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義(9.80±3.19vs. 7.10±2.23，P<0.01)。見表2。

表1 原發(fā)性膜性腎病患者外周血淋巴細胞亞群的變化

3 討 論

PMN是原發(fā)性腎病綜合征的主要病理類型之一。國外資料報道，PMN約占原發(fā)腎小球疾病病理類型的29.4%；國內有資料顯示PMN的比例僅次于IgA腎病[4-5]。免疫異常是PMN的主要原因[6]，但其具體發(fā)病機制目前尚不完全清楚。本研究從PMN患者外周血淋巴細胞亞群水平入手，分析PMN患者外周血淋巴細胞亞群的變化及其與蛋白尿的關系。研究發(fā)現(xiàn)，PMN患者CD4+細胞計數(shù)較健康對照組有所升高，CD8+細胞計數(shù)有所下降，但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而CD4+/CD8+較健康對照組明顯升高，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與健康對照組比較，PMN患者外周血CD19+細胞計數(shù)明顯升高，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明PMN患者發(fā)病過程中存在著B淋巴細胞活化與擴增的亢進。

PMN具體發(fā)病機制目前尚不完全清楚。已有的研究表明，PMN是一種抗原抗體介導的自身免疫性疾病，其上皮側免疫復合物的形成是抗體介導的自身免疫反應。腎組織免疫熒光檢測可以發(fā)現(xiàn)，沉積在腎小球上皮的免疫復合物以IgG和補體C3為主，其中IgG的沉積以免疫球蛋白G4亞型為主[7]。腎組織免疫復合物的沉積與B淋巴細胞的功能有關，B淋巴細胞介導機體體液免疫，識別呈遞抗原，合成分泌自身抗體，調節(jié)免疫應答，在自身免疫性疾病發(fā)病中扮演著重要角色。有研究證實，PMN患者體內的B淋巴細胞在Th2細胞所分泌的IL-4和IL-10等細胞因子的作用下,分泌IgG4亞型的功能明顯增強[8]。此外，PMN患者腎組織B淋巴細胞的浸潤，以及針對B細胞表面CD20單克隆抗體的藥物利妥昔單抗(rituximab)在PMN患者臨床治療的應用等，均進一步為PMN的免疫發(fā)病機制提供了依據(jù)[9-11]。B淋巴細胞的激活使人們對PMN的發(fā)病機制的研究和認識到了一個新時代。

那么，導致PMN患者體內B淋巴細胞功能異常活化的因素是什么呢？有研究發(fā)現(xiàn)，CD4+輔助性T細胞(Th)是一類重要的免疫調節(jié)細胞，它不僅對機體特異性和非特異性免疫均具有調節(jié)作用，還能影響B(tài)淋巴細胞產生抗體的功能，被稱為免疫調節(jié)系統(tǒng)的“司令部”。傳統(tǒng)觀念將CD4+Th細胞分為Th1和Th2兩類細胞亞群，其中Th2細胞主要分泌白細胞介素(IL)-4、IL-5、IL-10和IL-13等，主要功能為刺激B淋巴細胞增殖并產生免疫球蛋白抗體，參與體液免疫反應[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，Th2和Treg免疫反應在PMN發(fā)生及病情進展中起了舉足輕重的作用[12]。根據(jù)以上研究結果，作者推測，PMN患者體內存在著明顯的T淋巴細胞異常，其通過分泌IL等多種細胞因子，刺激B淋巴細胞增殖，從而導致B淋巴細胞的激活。B淋巴細胞激活后可介導機體體液免疫，形成抗原抗體免疫復合物參與發(fā)病。本研究未對B淋巴細胞激活后的免疫反應做深入探討，是本研究的一個缺陷，亦是今后研究的方向。

那么，淋巴細胞異?；罨欠窈蚉MN患者臨床表現(xiàn)、疾病活動程度有關系呢？故本研究分析了患者體內免疫異常與蛋白尿的關系。研究發(fā)現(xiàn)，大量蛋白尿組CD19+細胞計數(shù)明顯高于非大量蛋白尿組，提示PMN發(fā)病過程中B淋巴細胞活化與擴增程度可能和患者臨床表現(xiàn)、疾病活動程度有一定關系。

綜上所述，PMN患者體內存在明顯免疫異常，主要表現(xiàn)為B淋巴細胞的增加和CD4+/CD8+比值升高。其中外周血B淋巴細胞數(shù)量與患者蛋白尿呈正相關。因此，監(jiān)測患者體內淋巴細胞亞群的水平有助于評估病情，并有望為臨床治療提供指導意義。

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Changes of peripheral blood lymphocyte subgroups in patients with primary membranous nephropathy and their relationship with proteinuria

MADong-hong,GUOMing-hao,XUQing-yu,LIUYun,LIUXiang-dong,LIULi

(DepartmentofNephrology,FirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalCollege,Xinxiang,Henan453100,China)

Objective To analyze the changes of lymphocyte subgroups in peripheral blood for the patients with primary membranous nephropathy(PMN) and their relationship with proteinuria.Methods 40 cases of PMN in the nephrology department of our hospital were selected and their detailed clinical data were collected.The peripheral blood was collected for detecting the levels of lymphocyte subgroups(CD3+,CD4+,CD8+,CD4+/CD8+,CD16+56+,CD19+) by the flow cytometry.Simultaneous 20 healthy volunteers were selected as the control group.The differences in peripheral blood lymphocyte subgroups were compared between the PMN patients and the healthy control group.According to the proteinuria levels,the PMN patients were divided into the massive proteinuria group(MPG,proteinuria quantity≥3.5 g/d) and the non-massive proteinuria group(NMPG,proteinuria quantity<3.5 g/d).The differences in peripheral blood lymphocyte subgroups were compared between the MPG group and the NMPG group and their possible clinical significance was investigated.Results (1) Compared with the healthy control group,the CD4+cell levels had a rising trend(51.83±6.80vs.43.5±5.65,P>0.05) and the CD8+cell levels had a downward trend(28.83±5.60vs. 35.33±5.00，P>0.05) in the PMN patients,while the CD4+/CD8+ratio was significantly increased compared with the healthy control group(1.86±0.43vs.1.27±0.33,P<0.01).There was no significant difference in the CD16+CD56+count between two groups,while the CD19+cell count in the PMN patients was significantly increased(8.00±2.76vs.7.33±2.66,P<0.01).(2) Compared with the NMPG group,the CD19+cell count in the MPG group was significantly increased(9.80±3.19vs.7.10±2.23，P<0.01),while the CD4+cell count,CD8+cell count and the CD4+/CD8+ratio had no statistically significant differences between the MPG and NMPG groups.Conclusion PMN patients appear obvious abnormalities of B lymphocytes and the shift of CD4+/CD8+cells ratio.The abnormal degree of B lymphocyte is related to proteinuria quantity.Therefore,monitoring the lymphocyte subgroups changes can help to assess the disease condition and guide the treatment.

primary membranous nephropathy; lymphocyte subgroups; proteinuria

馬東紅，女，副主任醫(yī)師，博士，研究方向是原發(fā)性腎小球疾病的發(fā)病機制與治療。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.01.021

A

1672-9455(2015)01-0055-03

2014-04-16

2014-09-13)