時間分辨熒光法檢測乙型肝炎病毒血清標志物的檢出限探討

秦 雯,胡大春,肖利華(昆明市第一人民醫(yī)院檢驗科 650011)

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·論 著·

時間分辨熒光法檢測乙型肝炎病毒血清標志物的檢出限探討

秦 雯,胡大春,肖利華(昆明市第一人民醫(yī)院檢驗科 650011)

目的 確立時間分辨熒光方法檢測血清乙型肝炎病毒(乙肝)表面抗原(HBsAg)、乙肝表面抗體(HBsAb)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝e抗體(HBeAb)以及乙肝核心抗體(HBcAb)(俗稱乙肝兩對半)的檢出限(LOD),以指導(dǎo)其檢測結(jié)果的合理解釋與應(yīng)用。方法 參考美國臨床檢驗標準化委員會(CLSI)EP17-A文件提供的方案和相關(guān)文獻，建立實驗室時間分辨熒光分析儀檢測血清乙肝兩對半的空白限(LOB)及LOD。結(jié)果 時間分辨熒光分析儀檢測血清乙肝兩對半中HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的LOB分別為0.042 5 ng/mL、0.500 5 mIU/mL、0.000 PEIU/mL、0.997 DRU/mL、0.091 DRU/mL；LOD分別為0.163 ng/mL、1.203 mIU/mL、0.401 PEIU/mL、1.756 DRU/mL、0.350 DRU/mL。結(jié)論 時間分辨熒光方法檢測血清乙肝兩對半，均有較低的檢出限，可較敏感地檢出血清乙肝兩對半中的各項抗原及抗體，早期指導(dǎo)臨床對乙型肝炎病毒感染的診斷、療效的觀察及預(yù)后的判斷。

乙型肝炎病毒； 乙型肝炎病毒標志物； 時間分辨熒光方法

乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)感染是全球的公共衛(wèi)生問題，估計全世界HBV攜帶者達3.5億人之多，我國人口攜帶率約為1.2億。乙肝的診斷依賴于對其標志物的檢測，血清乙肝兩對半[乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝表面抗體(HBsAb)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝e抗體(HBeAb)以及乙肝核心抗體(HBcAb)]傳統(tǒng)的篩查方法是酶聯(lián)免疫吸附法，該方法對血清HBsAg的檢測靈敏度為2 ng/mL[1]，低于2 ng/mL的低濃度標本檢測結(jié)果表觀表現(xiàn)為陰性。慢性乙型肝炎患者中由于抗體缺乏對HBV包膜蛋白的免疫應(yīng)答使得HBV相應(yīng)標志物濃度較低，HBV感染早期等病毒含量較低，酶聯(lián)免疫吸附法有可能檢測不到，表觀表現(xiàn)為乙肝兩對半陰性。文獻報道時間分辨熒光免疫技術(shù)檢測HBsAg靈敏度可達0.2 ng/mL，能提高HBV感染的診斷率并縮短檢測窗口期[2]。近年來美國臨床檢驗標準化委員會(CLSI)對檢測方法的靈敏度提出了新的概念[3]，分別采用空白限(LOB)、檢出限(LOD)、測定限(LOQ)從不同的層面表述方法的檢測靈敏度，對于定性報告的檢測方法，LOD的確定尤其重要。本文對時間分辨熒光法檢測血清乙肝兩對半的檢出限進行探討，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備 時間分辨熒光法乙肝兩對半診斷試劑盒由中山大學達安基因股份有限公司提供，為同一批號試劑。UranusAE100全自動酶聯(lián)免疫檢測儀為愛康公司產(chǎn)品、時間分辨熒光免疫分析儀M6601為達瑞公司產(chǎn)品。

1.2 標本處理 空白樣品：用未感染乙型肝炎的患者的陰性血清(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb均為陰性)作為空白樣品，共6份，用于時間分辨熒光方法檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的LOB。低濃度樣品：將時間分辨熒光方法檢測出HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb各項已知濃度的標本，用試劑盒中的分析緩沖液稀釋為6個低濃度的標本，用于時間分辨熒光方法檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的LOD。

1.3 方法 由于試劑生產(chǎn)廠商對HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的LOB未提供申明，因此本實驗室選擇60個數(shù)據(jù)建立LOB、60個數(shù)據(jù)建立LOD。檢測時儀器狀態(tài)良好，操作人員固定，熟練掌握儀器的各項操作規(guī)程，使用自制質(zhì)控品，CV為17%，室內(nèi)質(zhì)量控制在控，按時間分辨熒光方法檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的操作說明書檢測空白標本及低濃度標本，試劑批號為20110101C。

1.3.1 LOB 的確定 對6個空白標本用時間分辨熒光法乙肝兩對半定量檢測試劑在UranusAE100全自動酶聯(lián)免疫檢測儀上完成加樣、孵育、洗板等步驟，在時間分辨熒光免疫分析儀M6601上測定熒光強度，通過標準曲線得到標本中HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的濃度。每天檢測2次，重復(fù)5 d檢測，共得60個空白標本數(shù)據(jù)。對這60個空白標本數(shù)據(jù)進行分布檢驗，并根據(jù)數(shù)據(jù)分布情況選用參數(shù)或非參數(shù)方法計算LOB?？瞻字党史钦龖B(tài)分布則用非參數(shù)方法估計第95百分位數(shù)(PctB)的值[4]，即LOB=PctB100-α，即LOB=在[NB(ρ/100)+0.5]位置的結(jié)果(NB是重復(fù)檢測的次數(shù)，ρ是百分位數(shù))。

1.3.2 LOD的確定 每天按照理論濃度稀釋為6個低濃度的稀釋標本，稀釋后用與空白標本檢測相同的程序?qū)@6個低濃度標本進行檢測，每個濃度重復(fù)2次檢測，共檢測5 d，共得60個低濃度標本數(shù)據(jù)。對這60個數(shù)據(jù)進行分布檢驗，并根據(jù)分布情況選用參數(shù)或非參數(shù)方法計算LOD。檢測過程中，為使檢測標本的基質(zhì)相同，在對HBsAg低濃度標本進行稀釋時使用相同的分析緩沖液，且不選用有溶血、脂血、黃疸或含有某些特定藥物的標本，以便排除可能的干擾。

低濃度樣品檢測結(jié)果呈正態(tài)分布[5]，LOD=LOB+CβsS。計算多個低濃度樣品的綜合標準差(ss)：ss2=(n1s12+n2s22+n3s32……+ nmsm2)/(n1+n2+n3+……+nm) 式中n1n2……nm代表不同低濃度樣品的自由度。 Cβ是標準正態(tài)分布第95百分位數(shù)值的校正因子，Cβ=1.645/(1-1/4∫)，∫是ss的自由度。

2 結(jié) 果

2.1 HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb空白標本檢測結(jié)果 分別檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb 60個空白標本，對檢測得到的60個空白標本數(shù)據(jù)作升序排列，顯示空白標本檢測數(shù)據(jù)結(jié)果呈偏態(tài)分布，故使用公式LOB= PctB100-α，LOB在[NB(ρ/100)+0.5]位置的結(jié)果。其中NB為60，ρ為95%，LOB=[60(95/100)+0.5]=57.5，即第57、58位數(shù)的中間值。故HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb使用上述公式計算的LOB結(jié)果分別為0.042 5 ng/mL、0.500 5 mIU/mL、0.000 PEIU/mL、0.997 DRU/mL、0.091 DRU/mL。

表1 乙肝兩對半的理想稀釋濃度(ng/mL)

2.2 HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb低濃度標本檢測數(shù)據(jù)結(jié)果見表1。HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb乙肝兩對半各組稀釋濃度標本標準差及LOD如表2所示。

表2 乙肝兩對半各組稀釋濃度標本標準差及LOD(ng/mL)

3 討 論

時間分辨熒光方法采用鑭系元素作為標記物，鑭系元素螯合物的熒光壽命較長(10～1000 μs)，背景熒光壽命較短，可有效地降低本底熒光的干擾；鑭系元素的熒光stokes位移較大，可使激發(fā)光與發(fā)射光分開，消除激發(fā)光的散射干擾；鑭系元素發(fā)射光譜較窄,多在(613±10)nm，(615±5)nm的濾光片只允許此波段熒光通過，減少了來自生物樣品熒光的干擾，有效降低了本底熒光，激發(fā)光譜較寬有利于增加激發(fā)能，故檢測靈敏度較高[6]。建立時間分辨熒光方法檢測乙肝兩對半的檢測靈敏度對指導(dǎo)其結(jié)果的合理解釋及應(yīng)用有重要意義，有關(guān)文獻報道時間分辨熒光方法檢測乙肝兩對半的靈敏度為0.2 ng/mL，但具體的檢測靈敏度方法不明確[1]。2004年美國臨床檢驗標準化協(xié)會發(fā)布了EP17-A文件，即“檢出限和定量檢出限確定方案-批準指南”[5]，該方案推薦使用LOB、LOD和LOQ來表示檢測系統(tǒng)或方法的靈敏度性能?？芍苯影逊治鰞x輸出的濃度或質(zhì)量單位結(jié)果用于估計限值，不以數(shù)據(jù)是否為正態(tài)分布為前提，以檢驗的允許誤差來估計定量限值，充分保證了檢測結(jié)果即使在低值條件下也能符合臨床需求的質(zhì)量管理要求[6]。

參照EP17-A文件提供的方案及CNAS-C130 的要求，本文對時間分辨熒光方法檢測乙肝兩對半的LOB 和LOD進行檢測。LOB是指在規(guī)定的可能性條件下，空白樣品被觀察到的最大檢測結(jié)果。LOB不是檢測到的實際濃度，是確保在實際濃度處的陽性信號成為檢出限，是含有分析物等于LOD水平的樣品預(yù)期得到的最低值；這和“檢測下限”相同，由規(guī)定的測量程序得到，可以給出一定測量不確定度的最低檢測結(jié)果，也稱為“臨界值”[7]。本文參照該方案確立的HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的LOB分別為0.042 5 ng/mL、0.500 5 mIU/mL、0.000 PEIU/mL、0.997 DRU/mL和0.091 DRU/mL，與黃永富等[8]的檢測結(jié)果基本一致，說明并不是所有的空白標本都沒有信號輸出，可能會有很少許本底熒光的干擾或其他因素的影響。

LOD是指標本中分析物的最小量，可以在規(guī)定的可能性條件下予以檢出，但也許還不能量化為一個確切的值。也被稱為“檢測下限”、“最小的可檢測濃度”，有時也用于指示“靈敏度”。LOD是這個樣品的實際濃度，它是可靠檢測到的最低實際濃度。本文參照該方案確立的HBsAg最低LOD為0.163 ng/mL，較上述文獻報道的檢測靈敏度為0.2 ng/mL低，較試劑說明書給出的HBsAg最低檢出量adr亞型為0.2 ng/mL、adw亞型為0.5 ng/mL；ay亞型為0.5 ng/mL均低，證實時間分辨熒光方法能較為敏感的檢出血清中的HBsAg，只要在此檢出限以上的結(jié)果均說明血清中的HBsAg是有一定含量的，能較好地檢測出灰區(qū)標本，可在一定程度上減少漏診率，避免誤診。HBsAb最低LOD為1.203 mIU/mL，較試劑說明書給出的HBsAb最低檢出量應(yīng)不高于5 mIU/mL為低,HBeAg、HBeAb、HBcAb最低LOD分別為0.401 PEIU/mL、1.756 DRU/mL、0.350 DRU/mL，均較試劑說明書給出的最低檢出量為低,可能因不同的TRFIA 檢測系統(tǒng)所用設(shè)備、標記物、分析原理等均不相同，且缺乏參考方法，以及工作人員對儀器的操作、試驗標本存在差異的原因。由此可見乙肝兩對半定量檢測較定性檢測更敏感，在HBV標志物處于低濃度時，定性檢測可表現(xiàn)為陰性，而定量檢測仍可檢出，檢測到的最低實際濃度即檢測限則能較好地幫助臨床診斷是否感染了乙肝，決定治療方案，因此確定檢測限就顯得尤為重要。同時可提高乙肝診斷率并縮短檢測窗口期，合理指導(dǎo)時間分辨熒光方法檢測乙肝兩對半結(jié)果的解釋，真正指導(dǎo)臨床對乙肝的診斷、療效的觀察及預(yù)后的判斷，對乙肝的早期診斷、預(yù)防接種方面有重要的臨床意義。但如果要為臨床診斷乙肝提供更為準確、完整的報告，還必須確立HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的定量LOQ，這將在下一步的工作中完成。

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Study on TRFIA for detecting detection limit of hepatitis B virus serological markers

QINWen,HUDa-chun,XIAOLi-hua

(DepartmentofClinicalLaboratory,KunmingMunicipalFirstPeople′sHospital,Kunming,Yunnan650011,China)

Objective To establish the limit of detection(LOD) of hepatitis B surface antigen(HBsAg),HbsAb,HbeAg,HbeAB and HBcAB by using the time-resolved fluorescence immunoassy(TRFIA) in order to guide the reasonable interpretation and application for their detection results.Methods Referring to the scheme and the related literature provided by the EP17-A document of CLSI,the limit of blank(LOB) and the limit of detection(LOD) of the hepatitis B serological markers by using TRFIA were established.Results LOB of serum HBsAg,HbsAb,HbeAg,HbeAb and HBcAb was 0.042 5 ng/mL,0.500 5 mIU/mL,0.000 PEIU/mL,0.997 DRU/mL and 0.091 DRU/mL respectively；LOD was 0.163 ng/mL,1.203 mIU/mL,0.401 PEIU/mL,1.756 DRU/mL and 0.350 DRU/mL respectively.Conclusion TRFIA for detecting serum hepatitis B serological markers has the lower LOD,can more sensitively detect each antigen and each antibody of hepatitis B serological markers and early guide clinical diagnosis of hepatitis B virus infection,efficacy observation and prognosis judgment.

hepatitis B virus; hepatitis B virus markers; TRFIA

秦雯，女，主任技師，學士/本科，研究方向是臨床免疫學檢驗。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.01.013

A

1672-9455(2015)01-0034-03

2014-03-22

2014-08-15)